Imaging Intracellular ATP Dynamics Using FRET-Based Sensors in an Organotypic Mouse Hippocampal Slice
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowetenschap
0 weergaven • 3:40 min • April 28th, 2025
Secure an organotypic mouse hippocampal slice in an experimental chamber.
The slice contains transduced neurons and astrocytes expressing an ATP sensor with donor and acceptor fluorescent proteins.
Place the chamber on a fluorescence microscope stage and perfuse it with oxygenated ACSF.
Allow the slice to adapt to the buffered conditions.
Using transmission light, focus the slice and identify the area of interest.
Switch to fluorescence mode and excite the donor fluorescent protein to initiate fluorescence emission.
Upon ATP binding, the sensor undergoes conformational changes, enabling fluorescence-based energy transfer from the donor to the acceptor, which emits fluorescence at a longer wavelength.
Use a dichroic mirror and bandpass filters to isolate and separate donor and acceptor emissions.
Select a region without fluorescence for background subtraction. Then, identify target cells and record their fluorescence over time.
Calculate the FRET ratio to monitor intracellular ATP levels in real-time.
Prepare experimental ACSF and obtain a pH of 7.4 by bubbling it with 95% oxygen and 5% carbon dioxide through an inserted tubing connected to the carbogen supply for at least 30 minutes. Keep the saline bubbled during the entire experiment. Then, switch on the fluorescent light source of the monochromator.
Transfer the organotypic slice culture into the experimental chamber. Place a grid on top of the organotypic slice culture with the frame down, not touching the culture, and the threads up, touching the membrane. Place the chamber on the microscope stage and connect it to the perfusion system.
Switch on the peristaltic pump at a flow rate of 1.5 to 2.5 milliliters per minute. Make sure there is no leaking of the perfusion system. Using transmission light, bring the cultured slice into focus and identify the area where experiments shall be performed.
Before starting imaging experiments, wait at least 15 minutes to allow slices to adapt to the saline conditions. Then, switch on the camera and the imaging software. Excite the donor fluorescent protein at 435 nanometers. Set the exposure time to between 40 to 90 milliseconds.
Then, insert the dichroic mirror and the filters into the beam splitter unit. Split the fluorescence emission at 500 nanometers with an emission image splitter, and employ bandpass filters at 482 plus or minus 16 and 542 plus or minus 13.5 nanometers to further isolate donor and acceptor fluorescence.
Select a region of interest apparently devoid of cellular fluorescence for background subtraction. Circle single structures of labeled tissue in the image on the screen to create ROIs. Set the frequency of image acquisition in the overall recording time. For experiments longer than 30 minutes, an acquisition frequency of 0.2 to 0.5 Hertz is recommended to prevent phototoxicity. Subsequently, start the recording.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het real-time monitoren van intracellulaire ATP-niveaus met behulp van fluorescence resonance energy transfer (FRET) in organotypische hippocampussneden van muizen. De aanpak maakt gebruik van getransduceerde neuronen en astrocyten die een ATP-sensor tot expressie brengen met donor- en acceptorfluorescerende eiwitten.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Fluorescentie-imaging
Achtergrond
- Intracellulaire ATP-niveaus zijn cruciaal voor cellulaire functies.
- FRET is een krachtige techniek voor het bestuderen van moleculaire interacties in levende cellen.
- Organotypische plakculturen behouden de architectuur en cellulaire samenstelling van hersenweefsel.
- Fluorescerende eiwitten maken real-time beeldvorming van biologische processen mogelijk.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor real-time monitoring van ATP-gehaltes in levende hersensneden.
- Om FRET te gebruiken voor het beoordelen van cellulaire energietoestanden.
- Om het begrip van de ATP-dynamiek in neuronale cellen en gliacellen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Preparatie van organotypische hippocampusschijfjes van muizen.
- Transductie van neuronen en astrocyten met ATP-sensoren.
- Gebruik van fluorescentiemicroscopie om FRET-signalen te monitoren.
- Aftrek van de achtergrond en selectie van regio's van interesse (ROI) voor nauwkeurige metingen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle adaptatie van coupes aan de experimentele condities.
- Real-time monitoring van ATP-gehaltes via FRET-ratio's.
- Identificatie van cellulaire responsen op ATP-fluctuaties.
- Vaststellen van optimale imaging-parameters om fototoxiciteit te minimaliseren.
Conclusies
- De methode biedt een betrouwbare aanpak voor het bestuderen van ATP-dynamiek in levend hersenweefsel.
- FRET-gebaseerde beeldvorming kan inzicht verschaffen in het cellulaire energiemetabolisme.
- Deze techniek kan worden toegepast op diverse experimentele condities om de neuronale functie te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Het monitoren van intracellulaire ATP-dynamiek in levend hersenweefsel maakt mechanische risicobeperking van neurotherapeutische targets mogelijk door cellulaire energietoestanden te koppelen aan functionele uitkomsten. Deze FRET-gebaseerde aanpak ondersteunt targetvalidatie in de vroege ontdekkingsfase door kwantitatieve real-time read-outs te leveren van het neuronale en gliale metabolisme onder fysiologische omstandigheden. De methode verhoogt het voorspellende vertrouwen in preklinische modellen door de weefselarchitectuur te behouden, terwijl longitudinale beoordeling van ATP-fluctuaties in reactie op farmacologische of genetische perturbaties mogelijk wordt gemaakt.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door ATP-dynamiek te correleren met neuronale en astrocytaire activiteit in ziekterelateerde circuits.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbaar platform voor functionele targetvalidatie met behulp van genetisch gecodeerde sensoren in primair-achtig weefsel.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt leadidentificatie door vroege metabole verschuivingen te detecteren die vooraf kunnen gaan aan functionele of toxicologische fenotypes.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Stelt gestandaardiseerde FRET-ratio-metrieken vast voor het kwantificeren van intracellulaire ATP-niveaus onder verschillende experimentele condities.
- Reproduceerbaarheid: Maakt achtergrondcorrectie en ROI-selectie mogelijk om variabiliteit te minimaliseren en signaalspecificiteit te waarborgen bij longitudinale beeldvorming.
- Schaalbaarheid: Compatibel met perfusiesystemen en geautomatiseerde acquisitie-instellingen voor multi-well- of tijdreeks-screeningformaten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Behoudt de architectuur van hippocampale coupes om extrapolatie van ATP-dynamiek naar in vivo neuronale netwerken te ondersteunen.
- Mechanistische risicoreductie: Koppelt target-interactie aan cellulaire energietoestanden, waardoor ambiguïteit in studies naar het werkingsmechanisme wordt verminderd.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door verbindingen te identificeren die de ATP-homeostase verstoren in fysiologisch relevante preparaten.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie tot preklinische profilering, waarbij real-time ATP-monitoring both het werkingsmechanisme en de beoordeling van de cellulaire toxiciteit informeert.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten door sensor-afgeleide FRET-ratio's te koppelen aan de cellulaire energiestroom in neuronen en astrocyten.
- Screening: Maakt standaardisatie van assays mogelijk via gedefinieerde excitatie-/emissiesinstellingen en protocollen voor achtergrondsubtractie.
- Analytics: Genereert kwantitatieve FRET-ratio-uitlezingen waarmee ATP-niveaus tussen behandelingsgroepen of genetische modellen kunnen worden vergeleken.
- Translationeel onderzoek: Behoudt complexiteit op weefselniveau om in vitro bevindingen te overbruggen met intacte fysiologie op circuitniveau.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar imagingplatform voor longitudinale metabole profilering over meerdere neurotherapeutische programma's.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen door mechanistische ambiguïteit bij het screenen van neuroactieve verbindingen te verminderen.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare fluorescentie-uitlezingen die compatibel zijn met de workflows van centrale imaging-faciliteiten.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege detectie van mitochondriale of metabole tekortkomingen mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Faciliteert risicogebaseerde prioritering van verbindingen op basis van ATP-homeostaseprofielen in ziekterelateerd weefsel.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in fluorescentiemicroscopie, FRET-imaging en het onderhoud van organotypische slice-culturen.
- Afhankelijk van confocale of widefield-systemen met dichroïsche spiegels, banddoorlaatfilters en gevoelige camera's voor de scheiding van donor en acceptor.
- Vereist perfusiesystemen voor de toevoer van ACSF en omgevingscontrole tijdens de imaging.
- Omvat de optimalisatie van de excitatiegolflengte (435 nm), de belichtingstijd (40–90 ms) en de acquisitiefrequentie (0,2–0,5 Hz) om een balans te vinden tussen signaalkwaliteit en fototoxiciteit.
- Beperkt door variabiliteit in sensor-expressie en de noodzaak van achtergrondsubtractie om nauwkeurige FRET-ratioberekeningen te garanderen.
Veelgestelde vragen over Biofarmacie
Visualisatie en Live beeldvorming van Oligodendrocyte organellen in Organotypic hersenen plakjes met behulp van Adeno-associated Virus en confocale microscopie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Twee-foton beeldvorming van Microglial processen attractie naar ATP of serotonine in Acute hersenen plakjes
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Fluorescentiemicroscopie voor ATP-internalisatie gemedieerd door macropinocytose in menselijke tumorcellen en tumor-xenogetransplanteerde muizen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een organotypische Slice Assay voor High-Resolution Time-Lapse Imaging van neuronale migratie in de postnatale Brain
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Het in kaart brengen Remmende neuronale circuits door Laser Scanning fotostimulatie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Functionele Beeldvorming Calcium in ontwikkelingslanden Cortical Networks
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Imaging Calcium Reacties in GFP-gelabelde neuronen van de hypothalamus Mouse Brain Slices
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Imaging intracellulaire Ca 2+ Signalen in Striatale Astrocyten van volwassen muizen met behulp van genetisch gecodeerd Calcium Indicatoren
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Multi-foton intracellulaire Natrium Imaging In combinatie met UV-gemedieerde Focal uncaging van glutamaat in CA1 pyramidale neuronen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Twee-foton Calcium Imaging in neuronale Dendrites in hersenen plakjes
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026