Het creëren van twee-dimensionale Patterned Substraten voor eiwit en Cell opsluiting

Het algemene doel van het volgende experiment is om een tweedimensionaal gepatronneerde ondergrond te ontwikkelen voor de controle van eiwitabsorptie en celgroei. Dit wordt bereikt door fotolitografie te gebruiken om een gepatronneerde master te fabriceren, die wordt gebruikt om een A-P-D-M-S stempel voor micro contact printing te produceren. Als tweede stap wordt de gepatronneerde goudsubstraat voorbereid, wat micro contact printing omvat om een patroon te produceren met regio's die eiwit absorberen en resistent zijn.

Vervolgens worden eiwitten en cellen toegevoegd aan de ondergrond om het patroon te visualiseren en te bestuderen. Resultaten van cellulaire groei en gedrag worden verkregen die goede eiwit- en celbeperking op deze patroonondergronden laten zien op basis van fluorescentie en gezichtscontrastmicroscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven andere bestaande methoden, zoals MicroCon-printing van eiwitten, is dat de glycol-getermineerde monolaag niet-specifiek eiwit en celabsorptie in de achtergrond van het patroon weerstaat.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat de juiste stempeltechniek voor elke geprinte patroon geoptimaliseerd moet worden. Om te beginnen met de voorbereiding van de gepatronneerde master centrum, de siliciumwafer op de spin coder, en tijdens de eerste stap van het tweecyclus spinprogramma, spoel de wafer met aceton. Tijdens de tweede stap van het spinprogramma zal het aceton verdampen en een schone, droge wafer achterlaten aan het begin van het spin, breng fotoresist aan op de wafer en spin vervolgens een coating aan met behulp van de eerder beschreven omstandigheden.

Bakken de foto resist gecoate wafer zacht bij 110 graden Celsius gedurende twee minuten met behulp van een hot plate met hoge uniformiteit. Vervolgens foto patroon. De foto resist gecoate wafer met behulp van een masker aligner systeem en een geschikt masker.

Plaats eerst de substraat op de vacuüm truck van de masker aligner. Plaats vervolgens het masker in de houder tray en zet de vacuüm aan om het masker op zijn plaats te houden om goed contact tussen het masker en de substraat te bevestigen. Verhoog de substraat tot het het masker raakt.

Gebruik de optica van de aligner om te bevestigen dat goed contact is gemaakt. Zet tenslotte de lamp aan om de substraat bloot te stellen aan UV-licht door het lithografische masker. Ontwikkel de gepatronneerde wafer in ontwikkelaar gedurende één minuut 45 seconden met zachte agitatie.

Spoel grondig met halfgeleiderkwaliteit, gedeïoniseerd water, en droog met een stroom stikstofgas controleer patroon ontwikkeling met behulp van een microscoop met een UV-filter. Begin deze procedure door een 10 tot een gewicht harsverharder voor te bereiden. Meng sigaar 180 2 volledig.

Bedek de foto gepatronneerde wafer met het mengsel in een wegwerp Petri schotel in een vacuümgedroogde Degas, de PDMS bedekt master totdat er geen bubbels zichtbaar zijn. Nadat u ervoor hebt gezorgd dat de master op de bodem van de schotel ligt, laat de stempel genezen in een oven bij 65 graden Celsius gedurende 1,5 uur. Wanneer de PDMS stempel is uitgehard, snijdt u de stempel uit de master en trimt u deze naar de juiste maat.

Bewaar de stempel in een afgedekte container met de functie zijde omhoog om hem te beschermen tegen stof en puin. Om de substraten voor metaaldepositie voor te bereiden, behandel eerst ronde glazen deksels met zuurstofplasma gedurende 10 minuten. Spoel vervolgens de deksels twee keer met gedeïoniseerd water en droog met een stroom stikstofgas tussen de spoelbeurten, na het spoelen met water, spoel twee keer met ethanol, opnieuw drogen met een stroom stikstofgas tussen de spoelbeurten.

Gebruik een systeem met meerdere pockets voor elektronenbundeldepositie om 50 angstroms titanium gevolgd door 150 angstroms goud te deponeren. Buig de evaporator niet tussen de depositie van de titaniumlaag en de goudlaag. Spoel de PDMS stempel met ethanol en droog grondig.

Breng met stikstofgas druppelsgewijs stemplos op de stempel aan totdat deze volledig is bedekt. Droog de stempel grondig met stikstofgas. De micro contact printing van HEXA Decaan bestand hangt af van de functies van de PDMS stempel en is een van de moeilijkste aspecten van deze procedure.

Succesvol stempelen vereist de ontwikkeling van een goede techniek die gelijkmatige druk toepast. Tijdens het stempelen. Voor conventionele micro contact printing in lucht, druk de stempel voorzichtig op het goudsubstraat en laat de monolaag gedurende 15 seconden vormen.

Alternatief, voor patronen die bestaan uit zeer kleine functies en hoge aspectverhoudingen, plaats het goudsubstraat in een Petri schotel met 18,2 mega om gedeïoniseerd water, waarbij ervoor wordt gezorgd dat het substraat ondergedompeld is. Druk vervolgens de stempel voorzichtig op het goudsubstraat en laat de monolaag gedurende 15 seconden vormen. Spoel vervolgens het gestempelde substraat twee keer met ethanol en droog met stikstofgas.

Na elke spoelbeurt plaatst u het substraat in een Petri schotel en bedekt u het substraat met backfilling oplossing. Verzegeld de schotel met param om verdamping te voorkomen. Laat de achtergrondmonolaag in het donker gedurende 12 tot 14 uur vormen.

Verwijder tenslotte de gepatronneerde deksel van de backfilling oplossing en spoel twee keer met ethanol en droog met stikstofgas na elke spoelbeurt. Om eiwit op de gepatronneerde deksel aan te brengen, plaats de deksel in een kleine Petri schotel of een celcultuur kamer Bedek met 500 microliters tot één milliliter delcos fosfaat gebufferde zoutoplossing. De DPBS moet het substraat volledig bedekken tijdens eiwit incubatie.

Om een ​​gelijkmatige eiwitbedekking te garanderen, voegt u een geconcentreerde oplossing van eiwit toe aan de DPBS en mengt u de oplossing door meerdere keren te pipetten. Incubeer het eiwitmengsel met het substraat bij 37 graden Celsius gedurende één uur. Na de incubatie spoelt u het substraat grondig met DPBS om ongebonden eiwit te verwijderen, zorg ervoor dat