Teratoom Generation in de testis Capsule

Het algemene doel van deze procedure is om de pluripotentie te bepalen door teratomen te genereren in het tunica albuginea van immuungecompromitteerde muizen met behulp van humane pluripotente stamcellen of H PSCs. Begin met het oogsten van een cultuur van de vermoedelijke H PSCs die op pluripotentie moeten worden getest. Voer vervolgens een chirurgische ingreep uit om de testikels van de muis bloot te leggen en injecteer de cellen in het kapsel van de testikel.

Plaats de testikels terug op hun oorspronkelijke plaats en sluit de muis chirurgisch weer. Onderzoek na zes tot 12 weken de resulterende tumor via histologie op de aanwezigheid van cellen uit elke kiemlaag. Uiteindelijk kunnen de resultaten aantonen dat een HPSC-lijn echt pluripotent is door aan te tonen dat deze kan differentiëren in cellen van alle drie de kiemlagen in een immuungecompromitteerde muis. Hoewel er recentelijk nieuwe methoden zijn gerapporteerd om de pluripotentie van menselijke stamcellen aan te tonen, blijft de teratooma-assay de gouden standaard in het vakgebied; de procedure zal worden gedemonstreerd door tron, een senior technicus in mijn lab Culture.

Breng de menselijke pluripotente stamcellen tot confluentie en dissocieer de hPSCs vervolgens met Accutane. Tel de cellen en resuspendeer 1 miljoen hPSCs per injectie. Scheer eerst de buik van geanestheseerde mannelijke muizen van zes weken oud van een immuungecompromitteerde muizenstam met een trimmer. Reinig de voorwand van de buik van de muis met een povidonjodiumoplossing, beginnend vanuit het midden van de buik en werkend in met de klok mee naar buiten.

Was daarna het geschoren gebied met 70% ethanol. Herhaal dit proces drie keer, waarbij elke keer de wattenstaafjes worden vervangen. Om de chirurgische ingreep uit te voeren, wordt het dier overgebracht naar een warmtemat in een steriele zuurkast met steriele chirurgische scharen.

Maak een longitudinale incisie van één centimeter door de huid en het peritoneum net onder het niveau van het heupgewricht, terwijl het peritoneum met een pincet wordt vastgehouden. Reik met een ander steriel pincet naar de rechterheup en trek het witte vetweefsel samen met de daaraan bevestigde testikels naar buiten. Vul nu een tuberculinespuit van 1 CC met de te injecteren hpsc. Injecteer langzaam 20 tot 30 microliters H PSCs in het centrum van het kapsel van de testis, weg van alle grote bloedvaten.

Verwijder de naald langzaam met een pincet om reflux van de cellen te voorkomen. Plaats de testikels en het vetweefsel terug op hun oorspronkelijke positie in de buikholte. Sluit het peritoneum met twee of drie resorbeerbare hechtingen en sluit de huid met autoclips.

Dien na de operatie tweemaal daags pijnstilling toe indien nodig. Controleer het dier gedurende zes tot 12 weken op tastbare tumorgroei. Wanneer de tumor een grootte van ongeveer vijf millimeter heeft bereikt, verwijder dan de tumor uit de geofferde muis voor documentatie.

Fotografeer de tumor en meet zowel de grootte als het gewicht. Snijd de tumor vervolgens in kleine stukjes en fixeer deze in een 4%paraldehyde-oplossing voor histopathologisch onderzoek. Gewoonlijk wordt een teratoom na zes tot 12 weken waargenomen.

In dit voorbeeld werden 1 miljoen menselijke WA09 pluripotente stamcellen in de capsule van de testis van een immuungecompromitteerde muis geïnjecteerd. Een nauwkeurige bestudering van het teratoom onthult heterogeniteit en vele gehechte cysten. Zoals verwacht.

Histopathologische analyses wijzen op de aanwezigheid van cellen uit elk van de drie kiemlaagjes. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om een positieve controle-cellijn op te nemen waarvan bekend is dat deze zeer potent is, om er zeker van te zijn dat de assay correct is uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed beeld moeten hebben van hoe u kunt bepalen of een menselijke stamcellijn pluripotent is of niet.