PDMS Device Fabrication en modificatie van het oppervlak

Mijn naam is Ken Kotz. Ik ben postdoc hier bij het Bio MAs Resource Center, verbonden aan het Massachusetts General Hospital. Mijn belangrijkste onderzoeksproject houdt in dat ik neutrofielen isoleer met behulp van een immuno-affiniteitsopvangapparaat met microfluïdische structuren.

We gebruiken dit apparaat in vijf verschillende ziekenhuizen door het hele land om RNA te isoleren voor downstream genomische analyse. In essentie bestaat het uit een master van SU8-fotolak op silicium. We gaan een tweedelig elastomeer, PDMS, over deze master gieten, waarna het PDMS een mal vormt.

We halen de mastermal uit de behuizing en plaatsen deze in een Petrischaal. De master wordt met tape op de bodem van de Petrischaal vastgezet. Op de weegschaal wegen we een mengsel van PDMS, harder en basis hars af.

De verhouding is één deel harder op 10 delen hars. Meestal wegen we voor onze uitgesneden apparaten 20 tot 30 gram van de hars en respectievelijk twee tot drie gram van de harder af. Nadat we zowel de harder als de hars in het kleine weegschaaltje hebben gegoten, gebruiken we een standaard plastic vork om de twee componenten te mengen.

Zorg ervoor dat u krachtig mengt en het mengsel door elkaar vouwt om te garanderen dat de harder gelijkmatig over de hars is verdeeld. Gewoonlijk controleren we hoe goed de twee componenten zijn gemengd. Aan de hand van het aantal luchtbellen proberen we een gelijkmatige verdeling van kleine luchtbellen in het elastomeer te verkrijgen.

Vervolgens gieten we de PDMS bovenop de SU-8 master in de petrischaal. We plaatsen de master met de PDMS erop in een vacuümglasstolp en vacumeren de kamer om de lucht die erin is gemengd te ontgassen. Normaal gesproken duurt het ontgassingsproces 30 minuten tot een uur.

Na het ontgassen halen we de apparaten uit de vacuümkamer en plaatsen we ze in een oven bij 65 tot 80 °C. De minimale uithardingstijd bij deze temperaturen is drie tot zes uur. In ons laboratorium laten we de apparaten doorgaans een nacht in de oven staan.

Gewoonlijk gebruiken we een chirurgisch stalen mesje nummer 11. We maken rechte sneden van ongeveer een halve centimeter vanaf de rand van de siliconen master en we snijden rond de rand van de master om een grote schijf te vormen. We pellen de PDMS-mal van de master en plaatsen deze met de structuurzijde naar boven in een schone Petrischaal.

We halen de losgekomen mal uit de Petrischaal en plaatsen deze op een snijvlak met behulp van een mes of een op een lineaire rail gemonteerd mes. We snijden de apparaten die zich in de mal bevinden in secties. Elk gesneden apparaat wordt vervolgens teruggeplaatst in de Petrischaal voor verdere verwerking.

Om onze apparaten doorgaans te koppelen aan vloeistoffen, ponsen we gaten in het PDMS-apparaat. Voor het ponsen van de gaten gebruiken we een standaard spuit van drie mm. Aan de punt van de spuit van drie mm bevindt zich een stompe naald van roestvrij staal.

In de roestvrijstalen naald bevindt zich een draad die precies past op de binnendiameter van de naald. Deze draad is bevestigd aan de zuiger van de spuit. Door aan de zuiger te trekken en de naald terug te trekken, kan er een gat worden geponst of een plug uit het PDMS worden verwijderd. Draai het PDMS-apparaat om en stoot het uit door op de zuiger te duwen.

Het geheim bij het gebruik van ponsapparaten is om de zuiger zo verticaal mogelijk te houden en het ponsapparaat absoluut niet te draaien. Wanneer u door de PDMS ponst, tilt u het gehele apparaat, het volledige PDMS-apparaat, op met een pincet, draait u het om en verwijdert u de plug door op de zuiger te drukken. U pakt de plug met een pincet vast en voert deze af.

Trek vervolgens de zuiger opnieuw in, klap het apparaat weer naar beneden en verwijder het snijinstrument. Herhaal dit proces totdat alle gaten zijn geponst. Voor het bondingsproces bonden we onze PDMS-devices aan glazen objectglaasjes.

Voor onze apparaten gaan we de PDMS onomkeerbaar binden of covalent bevestigen aan glasplaatjes. Dit wordt bereikt door ze in een plasma-asser te plaatsen en bloot te stellen aan een reactief zuurstofplasma. De stappen hiervoor zijn: neem het PDMS-apparaat en plaats het op de lade van de plasma-asser.

Terwijl de kenmerken van het apparaat naar boven zijn gericht, kunt u elk standaard glazen microscoop OBJECTGLAS gebruiken. Wij gebruiken een iets groter objectglas van anderhalf inch om in ons apparaat te passen. U kunt deze direct uit de verpakking gebruiken.

Wij geven de voorkeur aan behandeling in een piranha-oplossing. Dit verwijdert alle organische verontreinigingen die zich op het oppervlak van het glazen objectglas kunnen bevinden. Nadat u het device en het objectglas op de lade van de plasma-asher heeft geplaatst, schuift u de lade in de plasma-asher en stelt u deze bloot aan het reactieve zuurstofplasma.

Na voltooiing van het programma van de plasma-asher openen we de kamer en verplaatsen we de plaat met onze devices naar het werkblad. Met een pincet tillen we het PDMS-device voorzichtig op, waarbij we er goed op letten dat we de hechtvlakken niet met onze vingers aanraken. We keren de hechtzijde om op het glas, op het objectglas, en vervolgens controleren we of er geen luchtbellen tussen het PDMS en het objectglas zitten.

We plaatsen het PDMS-apparaat, dat nu aan het glas is gebonden, op een warmteplaat bij 65 tot 75 °C gedurende 10 minuten om een betere chemische binding te verkrijgen. In dit gedeelte gaan we de oppervlakken van het PDMS en het glas chemisch modificeren; na het bonden in de cleanroom houden we een PDMS-oppervlak over met reactieve OH-groepen op het oppervlak. We hebben dit reactieve oppervlak nodig; het is hydrofiel en zal uiteindelijk diffunderen naar de bulk van het PDMS.

Aangezien oppervlaktechemie het beste direct na de plasmabehandeling kan worden uitgevoerd, gebruiken we een 5% oplossing van trimethoxysilaan-propyl-mercaptaan. Het is een 5% volumeoplossing; in essentie injecteren we deze via de inlaat en zorgen we ervoor dat het apparaat volledig wordt gevuld zonder luchtbellen.

Indien er luchtbellen aanwezig zijn, drukt u deze met een pincet naar buiten. Nadat de slan is geïnjecteerd, laat u dit 15 tot 30 minuten rusten bij kamertemperatuur. Meestal injecteren we een tweede volume slan 10 minuten na aanvang van de reactie.

Nadat de silanisering ongeveer een half uur heeft gereageerd, spoelen we alle apparaten door met drie tot vier apparaatvolumes pure ethanol. Het overschot dat we uitstoten, vegen we simpelweg weg met een chemische doek. Na het spoelen van de apparaten pakken we ze op en plaatsen we ze op een warmteplaat die is ingesteld op 100 °C, waarbij we de aanwezige ethanol laten verdampen. Dit helpt bij het conditioneren van het gesilaniseerde oppervlak.

Zodra het apparaat is gedroogd, kan het gedurende enkele maanden in een desiccator worden bewaard, of u kunt het apparaat direct meenemen naar de volgende stap. Nadat de apparaten zijn uitgehard, beschikken ze nu over een silaanlaag op zowel het glas- als het PDMS-oppervlak. De silaan is een capto-silaan met een thiolgroep, die zal reageren met onze heterobifunctionele crosslinker, GMBS.

Het is verdund in zuivere ethanol. Het reageert met water, dus u moet erop letten dat het niet wordt blootgesteld aan waterige omstandigheden. We injecteren het in de apparaten en we verwijderen eventuele luchtbellen met een pincet, zoals ik hier doe, om er zeker van te zijn dat alle oppervlakken verzadigd zijn met dit molecuul.

We dekken het af en laten het een half uur reageren. Nadat het GMBS een half uur heeft gereageerd, spoelen we de apparaten met gedeïoniseerd water om alle sporen van ethanol uit het apparaat te verwijderen. Vervolgens laten we neutravidin, een biotinebindend eiwit, doorstromen.

De neutravain wordt vervolgens voorgedilueerd tot een concentratie van 10 µg/mL. Indien er per ongeluk lucht in het apparaat wordt geïnjecteerd, moet het apparaat opnieuw worden gespoeld met ethanol om alle lucht effectief te verwijderen; ethanol bevochtigt de oppervlakken van het apparaat beter, waardoor eventuele luchtbellen die per ongeluk in het apparaat zijn gekomen, kunnen worden verwijderd. Zodra de apparaten zijn gespoeld met gedeïoniseerd water, vullen we het apparaat doorgaans met twee tot vier apparaatvolumes van de verdunde neutravain-oplossing.

Het Nutt travain zal reageren met het GMBS, dat via willekeurige primaire middelen op het Nutt travain aan het oppervlak is geïmmobiliseerd. Dit proces kan gedurende één uur bij kamertemperatuur plaatsvinden. Gewoonlijk plaats ik de apparaten overnacht in de koelkamer bij vier graden C.

Voordat we het antilichaam toevoegen, willen we echter al het ongebonden Aden in de oplossing uitspoelen. Dit doen we door een 1% BSA-oplossing, verdund in PBS, te laten doorstromen. Omdat deze chips zullen worden gebruikt voor downstream genomische analyse, zijn alle gebruikte oplossingen RNA-vrij.

Gewoonlijk spoelen we het apparaat met vier tot vijf volumes van de 1% BSA-oplossing. Daarna voegen we het antilichaam toe. Het antilichaam voor dit experiment is CD 66 B en antilichamen specifiek voor granulocyten in volbloed.

We gebruiken een concentratie van 10 tot 25 microgram per ml en injecteren het antilichaam. We injecteren 200 microliter antilichaam in elk apparaat. We voeren twee injecties van honderd microliter uit, één in elke poort van het apparaat.

Meestal injecteren we 100 µL in één poort, wachten we 30 minuten en injecteren we vervolgens nog eens 100 µL in de tegenoverliggende poort.