Name: Autologe endotheliale voorlopercellen-zaaien Technologie en biocompatibiliteitstests voor cardiovasculaire apparaten in grote Animal Model (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Leer het zaaien van titanium implantaatbuizen met autologe endotheliale voorlopercellen om trombose te verminderen in een varkensmodel. Deze techniek verbetert de biocompatibiliteit van cardiovasculaire apparaten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Leica Microsystems bedanken voor hun waardevolle adviezen over beeldvorming titanium onderdelen en Gemini Bio-producten voor het verstrekken van de varkens serum gebruikt in deze studie. We ook graag de NIH bedanken voor hun steun door middel van Grant &quot;Autologe EPC-voering om biocompatibiliteit van de bloedsomloop te verbeteren apparaten te helpen&quot;, RC1HL099863-01. Verder zijn we dankbaar voor de steun van de National Science Foundation Graduate Research Fellowship van Alexandra Jantzen. We ook graag George Snel, Mike Lowe en Ianthia Parker bedanken voor de ondersteuning van met vele aspecten van de chirurgische procedure en het hanteren van ons onderzoek dieren. Steven Owen is van onschatbare waarde geweest in het bewerken van grote delen van onze seeding apparaat en snijden van titanium buizen.

<ol><li>Achneck, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+bleeding+and+clotting+in+the+cardiac+surgery+patient%3A+from+vascular+endothelium+to+circulatory+assist+device+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of bleeding and clotting in the cardiac surgery patient: from vascular endothelium to circulatory assist device surface.</a> Circulation. 122, 2068-2077 (2010).</li>
<li>Achneck, H. E., Sileshi, B., Lawson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+the+biology+of+bleeding+and+clotting+in+the+surgical+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular%22%5BJournal%5D)">Review of the biology of bleeding and clotting in the surgical patient.</a> Vascular. 16, 6-13 (2008).</li>
<li>Arvidsson, S., Askendal, A., Tengvall, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+plasma+contact+activation+on+silicon%2C+titanium+and+aluminium%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Blood plasma contact activation on silicon, titanium and aluminium.</a> Biomaterials. 28, 1346-1354 (2007).</li>
<li>Achneck, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biocompatibility+of+titanium+cardiovascular+devices+seeded+with+autologous+blood-derived+endothelial+progenitor+cells%3A+EPC-seeded+antithrombotic+Ti+Implants%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The biocompatibility of titanium cardiovascular devices seeded with autologous blood-derived endothelial progenitor cells: EPC-seeded antithrombotic Ti Implants.</a> Biomaterials. 32, 10-18 (2011).</li>
<li>Kang, C., Bonneau, M., Brouland, J. P., Bal dit Sollier, C., Drouet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+pig+models+of+venous+thrombosis+mimicking+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">In vivo pig models of venous thrombosis mimicking human disease.</a> Thromb Haemost. 89, 256-263 (2003).</li>
<li>Ueberrueck, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+ovine+and+porcine+animal+models+for+biocompatibility+testing+of+vascular+prostheses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of the ovine and porcine animal models for biocompatibility testing of vascular prostheses.</a> J Surg Res. 124, 305-311 (2005).</li>
<li>Velik-Salchner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+values+for+thrombelastography+%28ROTEM%29+and+selected+coagulation+parameters+in+porcine+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Normal values for thrombelastography (ROTEM) and selected coagulation parameters in porcine blood.</a> Thromb Res. 117, 597-602 (2006).</li>
<li>Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cell+principals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109, 1801-1809 (2007).</li>
<li>Achneck, H. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAchneck%2C+HE+%22American+Heart+Association+Scientific+Sessions%2C+Abstract+Oral+Sessions%2C+Medical+Aspects+End+Stage+Heart+Failure%3A+Transplantation+and+Device+Therapies%22">American Heart Association Scientific Sessions, Abstract Oral Sessions, Medical Aspects End Stage Heart Failure: Transplantation and Device Therapies</a>. , (2010).</li>
<li>Achneck, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerating+titanium+ventricular+assist+device+surfaces+after+gold%2Fpalladium+coating+for+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Regenerating titanium ventricular assist device surfaces after gold/palladium coating for scanning electron microscopy.</a> Microsc Res Tech. 73, 71-76 (2010).</li>
<li>Ford, J. W., Welling, T. H., Stanley, J. C., Messina, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKH26+and+125I-PKH95%3A+characterization+and+efficacy+as+labels+for+in+vitro+and+in+vivo+endothelial+cell+localization+and+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">PKH26 and 125I-PKH95: characterization and efficacy as labels for in vitro and in vivo endothelial cell localization and tracking.</a> J Surg Res. 62, 23-28 (1996).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De methode van cel-seeding Ti tubes hier gepresenteerde kunnen artsen en wetenschappers om snel en gelijkmatig endothelialize bloed-contactoppervlakken van implanteerbare apparaten. Aangezien wij isoleren en uit te breiden EPC&#39;s uit perifeer bloed monsters, is geen grote invasieve procedure nodig is om deze cellen te oogsten. Bovendien is de EPC&#39;s zijn autologe, dus de kans op een immuunreactie van de cel geplaatste implantaat wordt geëlimineerd. De principes aangetoond in zijn protocol kan worden gebruikt, niet alleen voor Ti buizen, maar voor veel andere biomaterialen, die gebruikt worden in de cardiovasculaire geneeskunde. Kritische stappen in dit protocol zijn zorgvuldige reiniging van de Ti-buizen, omdat we vonden dat een aanhanger van de film contaminant compromissen cel therapietrouw. Verder, een trage rotatiesnelheid (omgekeerd evenredig aan de buis diameter) is van essentieel belang tijdens het zaaien proces, zodanig dat EPC&#39;s langzaam af te wikkelen en zich houden aan de oppervlakte als de Ti buis beweegt. Onze methode van zaaien onmiddellijk vóór de implantatie voorkomt onpraktisch ex vivo cultuur tijden; cellen individueel hechten en later vormen een confluente blad in vivo, het vermijden van de mogelijkheid van embolisatie als een vel onmiddellijk na het herstel van de stroming. Onze voorafgaande studies tonen aan dat zodra de EPC&#39;s zijn uitgegroeid tot een confluente laag, ze een extra-cellulaire matrix waaraan zij vast houden te maken, bovendien het minimaliseren van eventuele vervelling van een endotheliale vel. Hoewel de mogelijkheid van embolische onthechting kan niet volledig worden uitgesloten, lijkt het veelvoudige lager risico dan trombose van het gehele apparaat oppervlak, het probleem dat deze therapie is ontworpen om te voorkomen. Onze aanpak van implantatie in de lage shear, protrombotische omgeving van de vena cava inferior maakt gebruik van een van de meest vertrouwde grote diermodellen voor onderzoek naar bloed compatibiliteit en trombose van apparaten 5,6. Merk op dat alle dierlijke zorg en experimenten werd uitgevoerd in overeenstemming met het National Institute of Health Richtlijnen voor de Zorg en gebruik van proefdieren en pas na goedkeuring van de Duke University Institutional Animal Care en gebruik Comite. Om met succes deze implantatie methode gebruiken om biomaterialen en apparaten te testen, is het belangrijk om geduldig schets maken van de IVC-segment en alle veneuze tak schepen ter voorbereiding van het apparaat inbrengen, zodanig dat er geen bloeden rond het apparaat voort uit een &#39;valse lumen&#39; afbinden. Een andere belangrijke stap is de toevoeging van DPBS in het toestel lumen zodanig dat de cellen aan de binnenkant buis oppervlak vochtig blijven tijdens de sluiting van de veinotomy en voordat reperfusie wordt gestart. Als het apparaat niet kan worden gevonden op de locatie waar het werd ingeplant, kan het zijn gemigreerd &#39;stroomopwaarts&#39; in het IVC. Dit kan worden voorkomen door het plaatsen van een hechting (4-O Prolene) door de aderwand en door middel van een 2 - 3 mm deel van de PVC-buis, zodat de buis is stevig verankerd in zijn huidige locatie. Mocht de onderzoeker moeite hebben met het vinden van de fluorescent gelabelde cellen in figuur 8 na explantatie in een overigens patent buis, is het waarschijnlijk dat de cellen hebben afgepeld als een coherent vel. Dit kan worden voorkomen door zeer zachte dissectie van de omliggende ader en dis-assemblage van de 3 Ti buissecties, na vaststelling van de ader, samen met de buis. Onze technologie biedt proof-of-concept voor de preventie van hart-apparaat trombose door middel van EPC-seeding. Deze technologie kan worden gebruikt in de ontwikkeling van &#39;biogeen&#39; implantaten bekleed met patiënten &#39;eigen endotheliale progenitorcellen. De haalbaarheidsstudie van onze varkens diermodel voorziet in de eerste stappen in de richting van vertaling van deze &#39;personalized medicine&#39; in de klinische praktijk.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Bedrijfsnaam </td><td> Catalogus Nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Acepromazine </td><td> Boehringer-Ingelheim </td><td> BIC670025 </td><td> NAC # 10280002 </td></tr><tr><td> Alconox Powered Precision Cleaner </td><td> Alconox </td><td> 1104 </td><td></td></tr><tr><td> Balfour Chirurgische Retractor </td><td> Adler </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Baytril </td><td> Bayer </td><td> APVMA 46028/0705 </td><td></td></tr><tr><td> Butterfly Naald (19G) </td><td> Terumo </td><td> SV19CLK </td><td></td></tr><tr><td> Chloorhexidine </td><td> 3M </td><td> 9200 </td><td></td></tr><tr><td> Klemmen (45 graden) </td><td> Aesculap </td><td> FC339T </td><td></td></tr><tr><td> DPBS (-/-) </td><td> Gibco </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS (+/+) </td><td> Gibco </td><td> 14040-133 </td><td></td></tr><tr><td> DuraPrep </td><td> 3M </td><td> 8635 </td><td></td></tr><tr><td> EBM-2 Medium </td><td> Lonza </td><td> CC-3156 </td><td> Uitvalsbasis voor zowel serum vrije en volledige groeimedium </td></tr><tr><td> EGM-2 SingleQuots </td><td> Lonza </td><td> CC-3162 </td><td> Gebruikt met EBM-2 voor zowel serum vrije en volledige groeimedium </td></tr><tr><td> Elektrocauterisatie Tool </td><td> Valleylab </td><td> SurgII-20 </td><td></td></tr><tr><td> Schuurlinnen </td><td> 3M </td><td> 60-0700-0425-8 </td><td> 240 grit </td></tr><tr><td> Euthasol Euthanasie Solution </td><td> Virback Animal Health </td><td></td><td> ANADA #: 200-071 </td></tr><tr><td> Fentanyl Patch </td><td> Actavis </td><td></td><td> NDC # 67767-120-18 </td></tr><tr><td> Flunixine </td><td> Schering-Plough </td><td></td><td> NAC #: 10470183 </td></tr><tr><td> Foley-katheter (16F) </td><td> Bard </td><td> 730116 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Sigma </td><td> H8264-500ML </td><td></td></tr><tr><td> Warmte Gun </td><td> Milwaukee </td><td> 8988-20 </td><td></td></tr><tr><td> Heparine </td><td></td><td></td><td> NDC #: 25021 </td></tr><tr><td> Histopaque-1077 </td><td> Sigma </td><td> H8889-500ML </td><td></td></tr><tr><td> Intubatie Tube </td><td> Mallinckrodt </td><td> 86113 </td><td></td></tr><tr><td> Isofluraan </td><td> MWI, Meridian </td><td></td><td> NDC # 13985-030 </td></tr><tr><td> IV Catheter (18G) </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 381547 </td><td></td></tr><tr><td> Ketamine </td><td> Fort Dodge </td><td></td><td> NDC # 0856-2013 </td></tr><tr><td> Niveau </td><td> Swanson </td><td> LLA001 </td><td></td></tr><tr><td> Luer-Lock dop van de tip </td><td> CML Supply </td><td> 909-001 </td><td></td></tr><tr><td> Marcaine </td><td> Hospira </td><td></td><td> NDC #: 0409-1560-10 </td></tr><tr><td> Metzenbaum Schaar </td><td> Adler </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Micro-introducer (5F) </td><td> Galt </td><td> KIT 002-01 </td><td></td></tr><tr><td> Mosquito Forceps </td><td> Adler </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Motor </td><td> Herbach en Rademan </td><td> H1-08 </td><td></td></tr><tr><td> Oxymorfon </td><td> Endo Labs </td><td></td><td> NDC: 63481-624-10 </td></tr><tr><td> PKH26 Dye Kit </td><td> Sigma </td><td> PKH26GL-1KT </td><td></td></tr><tr><td> Porcine Serum </td><td> Gemini Bio-producten </td><td> 100-115 </td><td> 2% concentratie in volle groei medium </td></tr><tr><td> Potts Schaar </td><td> Adler </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Precieze Vista Skin Stapler </td><td> 3M </td><td> 3998 </td><td></td></tr><tr><td> PVC-buizen </td><td> McMaster-Carr/Insultab </td><td> 7132K117 </td><td> uitgebreid ID 15,88 mm, herstelde ID 7,95 mm </td></tr><tr><td> Right Angle Medium Maat </td><td> Adler </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Scalpel Blade (# 10-15) </td><td> Bard </td><td> 373910 </td><td></td></tr><tr><td> Silicone Tubing </td><td> McMaster-Carr </td><td> 51735K26 </td><td> 16,64 mm OD, 9,52 mm ID </td></tr><tr><td> Injectiespuit (5 cc) </td><td> Becton-Dickinson (BD) </td><td> 309603 </td><td></td></tr><tr><td> Tegaderm </td><td> 3M </td><td> 90001 </td><td></td></tr><tr><td> Drie-weg Afsluitkraan </td><td> Kendall </td><td> 170060 </td><td></td></tr><tr><td> Ti Tube </td><td> Tico Titanium </td><td> N / A </td><td> Gespecificeerd als ½ &quot;OD, 0.065&quot; muur, 0.370 &quot;ID, 0,1737 pond / ft </td></tr><tr><td> Trypsine </td><td> Lonza </td><td> CC-5012 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine neutraliserende oplossing (TNS) </td><td> Lonza </td><td> CC-5002 </td><td> 0,03% </td></tr><tr><td> Vetropolycin </td><td> Pharmaderm Animal Health </td><td></td><td> NAC #: 12920110 </td></tr><tr><td> Vicryl Suture (3-0) </td><td> Ethicon </td><td> J808T </td><td></td></tr><tr><td> Water Bath ultrasoonapparaat </td><td> Branson </td><td> B200 </td><td></td></tr></tbody></table>

autologe endotheliale voorlopercellen-zaaien technologie en biocompatibiliteitstests voor cardiovasculaire apparaten in grote animal model

Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model

Implanteerbare cardiovasculaire apparaten zijn vervaardigd uit kunstmatige materialen (bv. titaan (Ti), geëxpandeerd polytetrafluorethyleen), waardoor het risico van de vorming thromboemboli 1,2,3 pose. We hebben een methode ontwikkeld om de binnenkant van Ti buizen lijn met autoloog bloed afgeleide menselijke of varkens endotheliale progenitor cellen (EPC&#39;s) 4. Door het implanteren van Ti buisjes met een confluente laag van varkens EPC&#39;s in de vena cava inferior (IVC) van varkens, testten we de betere biocompatibiliteit van de cel-gezaaid oppervlak in de protrombotische omgeving van een groot dier model en deze vergeleken met niet-gemodificeerde blank metaal 5,6,7 (figuur 1). Deze methode kan worden gebruikt om apparaten endothelialize binnen enkele minuten na implantatie en testen hun antitrombotische functie in vivo. Perifere bloed werd verkregen van 50 kg Yorkshire varkens en de mononucleaire cel-fractie gekweekt tot EPC 4,8 isoleren. Ti buizen (9.4 mm ID) werden pre-cut in drie 4,5 cm lengte-secties en opnieuw gemonteerd met warmte-shrink tubing. Een zaaien apparaat is gebouwd, die het mogelijk maakt voor langzame rotatie van de Ti buizen. We voerden een laparotomie op de varkens en geëxternaliseerde de darm en de urineblaas. Scherpe en stompe dissectie werd gebruikt om de IVC schets maken van zijn bifurcatie distaal van de juiste nierarterie proximale. De Ti buisjes werden vervolgens gevuld met fluorescent gelabelde autologe EPC schorsing en gedraaid op 10 RPH x 30 min voor een uniforme cel-coating 9 te bereiken. Na toediening van 100 USP / kg heparine, werden beide uiteinden van de IVC en een lumbale ader geklemd. Een 4 cm veinotomy werd uitgevoerd en het apparaat geplaatst en gevuld met fosfaat-gebufferde zoutoplossing. Omdat de veinotomy werd afgesloten met een 4-0 Prolene loopt hechtingen, was een klem verwijderd om de-lucht het IVC. Aan het einde van de procedure, de fascia werd benaderd met 0-PDS (polydioxanon hechtdraad), de subcutane ruimte afgesloten met 2-0 Vicryl en de huid geniet gesloten. Na 3 - 21 dagen, varkens werden gedood, het apparaat geëxplanteerde en-blok en vast. De Ti buizen werden gedemonteerd en de inwendige oppervlakken afgebeeld met een fluorescentiemicroscoop. We vonden dat de bare metal Ti buizen volledig afgesloten terwijl de EPC-geplaatste buizen bleef patent. Verder konden we een confluente laag van EPC&#39;s te tonen aan de binnen-bloed-contact oppervlak. Concluderend kan onze technologie worden gebruikt om de Ti buizen endothelialize binnen enkele minuten na implantatie met autologe EPC&#39;s van trombose van het apparaat te voorkomen. Onze chirurgische methode maakt het mogelijk voor het testen van de verbeterde biocompatibiliteit van dergelijke gewijzigde apparaten met minimaal bloedverlies en EPC geplaatste verstoring van het oppervlak.

Een methode voor het zaaien titanium bloed-contact biomaterialen met autologe cellen en het testen van biocompatibiliteit wordt beschreven. Deze methode maakt gebruik van endotheliale progenitor cellen en titanium buizen, zonder zaadjes binnen enkele minuten van de chirurgische implantatie in varkens venae cavae. Deze techniek is aan te passen aan vele andere implanteerbare biomedische apparaten.

Autologe endotheliale voorlopercellen-zaaien Technologie en biocompatibiliteitstests voor cardiovasculaire apparaten in grote Animal Model

Implanteerbare cardiovasculaire hulpmiddelen worden gefabriceerd uit kunstmaterialen (bijv. titanium (Ti), expanded polytetrafluoroethyleen), die het risico inhouden ...

Het algemene doel van dit experiment is om vasculaire implantaten te beplanten met autologe, uit bloed afgeleide endotheliale progenitorcellen en vervolgens het effect van deze behandeling op trombose in een groot diermodel te observeren. Dit wordt bereikt door een perifeer bloedmonster van varkens af te nemen om late outgrowth porcine endotheliale progenitorcellen te isoleren. Vervolgens, een implanteerbaar apparaat.De titaniumbuis in onze proof-of-principle studie is bevolkt met autologe PC's. Het apparaat wordt vervolgens geïmplanteerd in de vena cava inferior van het varken. De resultaten tonen aan dat er bescherming tegen trombose is, gebaseerd op de doorgankelijkheid van de met EPC's bevolkte titaniumbuis in tegenstelling tot de controle en de occlusie van de onbehandelde metalen buis.Duke surgery is toegewijd aan het bevorderen van baanbrekend, innovatief onderzoek. De volgende presentatie is een voorbeeld van hoe wij over afdelingen en disciplines heen samenwerken om de geneeskunde vooruit te helpen. Dr.EK heeft een onderzoekstraject geleid om een celbevestigingstechnologie te ontwikkelen die trombose voorkomt door het bloedcontactoppervlak van vasculaire hulpmiddelen te bekleden met de eigen progenitorcellen van de patiënt.Aangezien deze cellen zijn afgeleid van dezelfde patiënten die het implantaat zullen ontvangen, voorkomen we afstoting door het immuunsysteem. Ons succes en de hierin beschreven methoden zijn het resultaat van een grote teaminspanning. De chirurgische implantatie zal worden gedemonstreerd door Sean Gage van de afdeling vaatchirurgie, Whitney Lane, een medische student aan Duke, en mijzelf.Ik wil nu Alexander Janssen introduceren, een PhD-student van de afdeling Biomedical Engineering, die ons in detail door het proces van het zaaien van cellen zal leiden. Ik zal demonstreren hoe titanium buizen worden gezaaid met uit bloed afgeleide endotheliale progenitorcellen vlak voor implantatie in een varkensmodel. Deze methode dient als proof of concept en dezelfde basisprincipes kunnen worden toegepast op veel andere implanteerbare hulpmiddelen, zoals nitinol stents en mechanische circulatieondersteunende apparaten. EPC's worden geïsoleerd door de mononucleaire celfractie van varkensbloed uit te platen en verschijnen gewoonlijk na ongeveer zeven dagen.Ze kunnen worden herkend aan hun typische kasseimorfologie. Kweek de EPC's verder uit tot een totaal aantal van 9 miljoen cellen in cultuur. Spoel de geprepareerde EPC's tweemaal met serumvrij medium, waarbij u er zorg voor draagt dat de blootstelling aan licht tijdens en na de labeling wordt beperkt.Bedek de cellen vervolgens met een fluorescent label, PKH 26 en noteer hoeveel oplossing er is toegevoegd. Incubeer de cellen gedurende vier minuten bij kamertemperatuur. Stop de labelingsreactie door één minuut later een gelijk volume varkensserum aan de kleurolossing toe te voegen.Verdun de gecombineerde oplossingen één-op-één met volledig groeimedium. Aspireer vervolgens de vloeistof en spoel de cellen drie keer met volledig groeimedium, gevolgd door twee wasbeurten met DPBS zonder calcium- of magnesiumchloride. Bedek de cellen daarna met trypsine, waarbij het gebruikte volume wordt genoteerd, en incubeer ze bij 37 °C.Na drie minuten incubatie wordt met behulp van microscopie gecontroleerd of de cellen zijn losgekomen; indien dit het geval is, wordt er twee keer zoveel trypsine-neutralisatielosure toegevoegd als er eerder is toegevoegd. Combineer de celoplossingen in één enkele buis en meet de celdichtheid met een hemocytometer. Pellet tot slot de celsuspensie en resuspendeer de cellen in ten minste 4,5 milliliters serumvrij medium.Nadat het varken is voorbereid voor de operatie, maakt u met een scalpelmes nummer 15 een incisie in de middellijn, beginnend bij de tweede set mammae. Gebruik electrocauterisatie om voorzichtig door te snijden tot de voorlaatste set. Zet de dissectie voort tot aan de abdominale fascia.Til het peritoneum op met mosquito-tangetjes en maak er voorzichtig een opening in met Metzenbaum-scharen, externaliseer de urineblaas en plaats een 3-0 Vicryl beursnaad in de blaaswand. Maak een kleine punctie-incisie in het centrum hiervan en voer een 16 French Foley-katheter in via de incisie. Dien vervolgens intraveneuze vloeistoffen toe om de urineproductie tijdens de operatie te titreren naar ten minste 1 ml/kg/uur.Externalise vervolgens de kleine, vergrote darm en plaats twee bour-retractoren om het posterieure aspect van de peritoneumholte bloot te leggen en identificeer de Vena Cava Inferior (VCI) middels scherpe en botte dissectie. Maak de VCI voorzichtig vrij van het omringende weefsel. Skeletoise vervolgens het vat vanaf de rechter nierarterie proximaal van de bifurcatie van de VCI tot aan het distale uiteinde.Wees uiterst voorzichtig tijdens de dissectie van de Vena Cava Inferior (IVC), aangezien zelfs een zeer klein defect in de IVC kan leiden tot snelle bloedingen en exsanguinatie van het dier. Ligeer alle zijtakken van het IVC-segment; besteed speciale aandacht aan het disseceren en ligeren van de twee grote posterieure lumbale venen direct proximaal van de bifurcatie van de IVC. Aan de posterieure zijde bevindt zich vaak een grote lumbale vene.Dissekeer deze ader vrij en controleer deze met vatenlussen. Begin nu, parallel aan de operatie, met het zaaien van het implantaat met EPC's voordat deze procedure wordt gestart. De titanium buis-weefselsteunstructuren moeten volledig zijn geassembleerd en klaar voor gebruik in een steriel veld.Open de gasgesteriliseerde titanium buisassemblage in een spuit van 5 cc. Verwijder vervolgens de zuiger uit de spuit van 5 cc, maar gooi deze niet weg. Bevestig een dop aan de spuit. Gebruik een pipet om de spuit te vullen met de EPC-suspensie.Plaats vervolgens de zuiger terug. Verwijder de dop en steek het uiteinde van de spuit in de open siliconen slang van de opstelling totdat deze precies vastzit. Verwijder daarna eventuele luchtbellen door de celoplossing langzaam voort te duwen totdat deze de bovenkant van het hoofdstuk bereikt.Sluit de assemblage vervolgens af met een luer-dop en plak deze dicht in een steriele handschoen. Plaats deze volledige assemblage in een bewerkte spuitenhouder en zet deze in een incubator van 37 °C. Gebruik een meetinstrument om te controleren of de zittingkamers waterpas staan en laat de assemblage incuberen met een zachte rotatie.Zet de operatie voort direct na het afbinden van de Vena Cava Inferior (VCI) door 100 eenheden heparine per kilogram varken toe te dienen. Klem vervolgens onmiddellijk de VCI in een hoek van 45 graden distaal op de VCI en de lumbale ader, en daarna proximaal. Gebruik vervolgens een scalpelmes nr. 11 en pot-scharen om een longitudinale venotomie van vier centimeter te maken tussen de proximale en distale klemmen.Verwijder al het bloed uit de IVC en spoel het binnenste lumen met steriele DPBS. Plaats nu het EPC-bevolkte implantaat of een bare-metal controle in de IVC om te voorkomen dat de cellen uitdrogen en om lucht te verwijderen. Vul de IVC met DPBS met calciumchloride en magnesiumchloride.Sluit vervolgens de veinotomie met een doorlopende hechting van 4-0 proline en verwijder één proximale klem om de IVC te ontluchten door middel van een kleine hoeveelheid terugbloeding. Verwijder na de bloeding de distale klem om het implantaat op zijn plaats te houden. Plaats een fixatiehechting in de PVC-slang die door de vaatwand loopt.Sluit de fascia met OPDS op een CT-naald. Sluit de subcutane ruimte met twee o Vicryl via een doorlopende hechting. Sluit vervolgens de huid met nietjes.Dien tot 20 milliliter 0,25% Marcaine subcutaan toe langs de incisieplaats en dek de wond af met gaas en Tegaderm tegen de pijn. Dien flu Nixon en oxymorphone subcutaan toe indien nodig. Beëindig de anesthesie en plaats het varken, zodra het ontwaakt, gedurende de volgende zeven dagen terug in zijn kooi.Dien elke 24 uur atri toe als antibiotische profylaxe en zorg ervoor dat de fentanylpleister die vóór de operatie is aangebracht, in totaal drie dagen lang blijft plakken. Na drie dagen werden de geplaatste titanium buisimplantaten verwijderd en werden de binnenoppervlakken onderzocht. Bij een excitatiegolflengte van 550 nanometer werd in een andere buis een samenhangende laag van fluorescentie-gelabelde cellen aangetroffen.Snedecellen werden aanvullend gekleurd met een adhesiemarker voor bloedplaatjes-endotheelcellen om de celgrenzen te visualiseren. In deze procedure kan een breed scala aan kleurstoffen worden gebruikt. In tegenstelling hiermee raakt een onbehandeld titanium buisimplant volledig verstopt in de prothrombotische omgeving met lage schuifspanning van de vena cava inferior.Zoals geïllustreerd in afbeeldingen A en C, wordt de titanium buis waarin de cel is geplaatst getoond in afbeelding B en bleef deze vrij van stolsel na onze isolatieprocedure met varkensbloed. EPC's verschijnen na gemiddeld zeven dagen in kweek. Tijdens het uitvoeren van de chirurgische procedure is het zeer belangrijk om de IVC zorgvuldig en voorzichtig te skeletoniseren, omdat zelfs de kleinste scheur in de IVC of de zijtakken kan leiden tot uitbloeding van het varken. Na deze procedure kunnen andere bloedcontacterende materialen snel endotheeliseren om trombose te voorkomen.Endotheliale vasculaire stents, bijvoorbeeld met onze EPC's, bootsen de natuurlijke bekleding van de bloedvatwand na en kunnen stent-restenose en trombose na de plaatsing voorkomen. Onze quick seed-technologie maakt het mogelijk om intravasculaire hulpmiddelen binnen enkele minuten in de operatiekamer of het catheterisatielaboratorium te bekleden met endotheliale progenitorcellen die uit het eigen bloed van de patiënt zijn afgeleid. Hierdoor is een langdurige ex-vivo kweek niet langer nodig.Tijd op het apparaat zelf wordt vermeden en de technologie wordt praktisch voor vertaling naar de klinische praktijk.

autologous-endothelial-progenitor-cell-seeding-technology

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Endotheliale kolonievormende progenitor cellen (ECFCs) zijn een veelbelovend instrument om vasculaire homeostase en reparatie te bestuderen.

Isolatie en grootschalige expansie van volwassen humane endotheelcellen kolonievormende Progenitor Cellen

Hier beschrijven we een methode om menselijk navelstrengbloed afgeleide endotheel kolonie-vormende cellen (ECFCs) en beenmerg-afgeleide mesenchymale stamcellen (MSC's), ingebed in een collageen / fibronectine gel, subcutaan in immunodeficiënte muizen. Te leveren Deze cel / gel combinatie genereert een humane vasculaire netwerk dat verbindt met de muis vaatstelsel.

Bioengineering Human Microvasculaire Netwerken in immunodeficiënte muizen

Om onze kennis van cellulaire en moleculaire neotissue vorming te verbeteren, werd een muizenmodel van het TEVG recent ontwikkelde. De transplantaten werden geïmplanteerd infrarenale vena cava tussenvoeging enten in C57BL / 6 muizen. Dit model behaalt dezelfde resultaten als die bereikt bij onze klinische onderzoek, maar over een veel kortere tijd-cursus.

Implantatie van de vena cava inferior Interpositie Graft in muismodel

Een stap-voor-stap protocol voor de inter-positionele plaatsing van weefselengineering Vessels (Tevs) in de halsslagader van een schaap met end-to-end anastomose en real-time digitale evaluatie in vivo tot dierenoffers.

Chirurgische techniek voor de inplanting van Tissue Engineered vaattransplantaten en de daaropvolgende<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoring

Hier presenteren we een protocol om tissue engineered vaartuig enten die functioneel zijn voor het enten in muizen door dubbel zaaien gedeeltelijk geïnduceerde pluripotente stamcellen genereren (PiPSC) - afgeleide gladde spiercellen en PiPSC - afgeleide endotheelcellen op een gedecellulariseerde schip steiger bioreactor.

Generatie en enten van-Weefselmanipulatieproducten Schepen in een muismodel

We beschrijven een microchirurgische benadering voor het genereren van een arterioveneuze (AV) -lus als model voor het analyseren van vascularisatie in vivo in een geïsoleerd en goed gekarakteriseerd omgeving. Dit model is niet alleen nuttig voor het onderzoek naar angiogenese, maar ook optimaal geschikt voor engineering axiaal gevasculariseerd en transplantable weefsels.

De arterioveneuze (AV) Loop in een klein proefdiermodel voor Angiogenese en Gevasculariseerd Tissue Engineering Studie

Momenteel is de enige vorm van gevacuoliseerd samengestelde allotransplantation afhankelijk van lange-termijn-immuunsuppressie, moeilijk te ondersteunen voor niet-leven-kritieke indicaties. We presenteren een nieuwe varkens tibiale VCA model dat kan worden gebruikt voor het bestuderen van bot VCA en voorbeelden van het gebruik van chirurgische angiogenese om bot levensvatbaarheid zonder de behoefte van langdurig immuun-modulatie.

Chirurgische angiogenese in varkens tibiale Allotransplantation: een nieuwe groot dier bot gevacuoliseerd composiet Allotransplantation Model

Hier beschrijven we een pre-klinisch groot dier (Porcine) model van orthotopic harttransplantatie dat stevig is vastgesteld en gebruikt om nieuwe cardioprotective strategieën te onderzoeken.

Een preklinisch varkens model van Orthotopic harttransplantatie

Dit protocol is bedoeld om een 3D-bioprint patch te transplanteren op het epicardium van infarct muizen die hartfalen modelleren. Het bevat details met betrekking tot anesthesie, de chirurgische borstopening, permanente ligatie van de linker voorste aflopende (LAD) kransslagader en toepassing van een bioprinted patch op het infarct gebied van het hart.

Transplantatie van een 3D Bioprinted Patch in een Murine Model van Myocardikoesie Infarct

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de implantatie van een weefselgemanipuleerd vasculair transplantaat in de halsslagader van de muis met behulp van de manchettechniek, waardoor een geschikt diermodel wordt geboden voor het onderzoeken van mechanismen voor de regeneratie van vasculair weefsel.

Implantatie van weefselgemanipuleerd vasculair transplantaat in de halsslagader van muizen via manchettechniek

Deze studie presenteert een varkensmodel voor het evalueren van transplantaten met een kleine diameter in dijbeenslagaders. Het model bootst de menselijke vasculaire dynamiek na en beoordeelt uitgebreid de doorgankelijkheid van het transplantaat, de hemodynamica en de vasculaire remodellering. Het biedt een waardevol platform voor het testen van vasculaire transplantaten en het monitoren ervan met Doppler-echografie en angiografie.

Implantatie van een femurvasculair transplantaat in een varkensmodel om vasculaire transplantaten met een kleine diameter te testen

Leer het zaaien van titanium implantaatbuizen met autologe endotheliale voorlopercellen om trombose te verminderen in een varkensmodel. Deze techniek verbetert de biocompatibiliteit van cardiovasculaire apparaten.

Autologe endotheliale voorlopercellen-zaaien Technologie en biocompatibiliteitstests voor cardiovasculaire apparaten in grote Animal Model (Video) | JoVE Journal

Autologe endotheliale voorlopercellen-zaaien Technologie en biocompatibiliteitstests voor cardiovasculaire apparaten in grote Animal Model

Meer video's verkennen