Autologe endotheliale voorlopercellen-zaaien Technologie en biocompatibiliteitstests voor cardiovasculaire apparaten in grote Animal Model

Het algemene doel van dit experiment is om vasculaire implantaten te bevolken met autologe uit bloed afgeleide endotheliale progenitorcellen en vervolgens het effect van deze behandeling op trombose in een groot diermodel te observeren. Dit wordt bereikt door een perifeer bloedmonster van varkens te verkrijgen om late outgrowth porcine endotheliale progenitorcellen te isoleren. Vervolgens, een implanteerbaar apparaat.

De titaniumbuis in onze proof-of-principle studie is beplant met autologe PC's. Het apparaat wordt vervolgens geïmplanteerd in de vena cava inferior van het varken. De resultaten tonen aan dat er bescherming is tegen trombose, gebaseerd op de doorgankelijkheid van de met EPC's beplante titaniumbuis in vergelijking met de controlegroep en de occlusie van de onbehandelde metalen buis.

Duke Surgery zet zich in voor het stimuleren van baanbrekend en innovatief onderzoek. De volgende presentatie is een voorbeeld van hoe wij over departementen en disciplines heen samenwerken om de geneeskunde vooruit te helpen. Dr. EK leidt een onderzoeksproject om een celbevestigingstechnologie te ontwikkelen die trombose voorkomt door het bloedcontactoppervlak van vasculaire hulpmiddelen te bekleden met de eigen progenitorcellen van de patiënt.

Aangezien deze cellen zijn afgeleid van dezelfde patiënten die het implantaat zullen ontvangen, voorkomen we afstoting door het immuunsysteem. Ons succes en de hierin beschreven methoden zijn het resultaat van een grote teaminspanning. De chirurgische implantatie zal worden gedemonstreerd door Sean Gage van de sectie vasculaire chirurgie, Whitney Lane, een medische student aan Duke, en mijzelf.

Ik wil nu graag Alexander Janssen introduceren, een promovendus van de afdeling Biomedische Techniek, die ons in detail door het proces van celzaaien zal leiden. Ik zal demonstreren hoe titanium buizen worden gezaaid met endotheliale progenitorcellen afgeleid uit bloed, vlak voor implantatie in een varkensmodel. Deze methode dient als proof of concept en dezelfde basisprincipes kunnen worden toegepast op veel andere implanteerbare apparaten, zoals nitinol stents en mechanische circulatieondersteunende apparaten. EPC's worden geïsoleerd door de mononucleaire celenfractie van varkensbloed uit te platen en verschijnen gewoonlijk na ongeveer zeven dagen.

Ze kunnen worden herkend aan hun typische kasseimorfologie. Laat de EPC's in kweek uitgroeien tot een totaal aantal van 9 miljoen cellen. Spoel de voorbereide EPC's tweemaal met serumvrij medium, waarbij u er zorg voor draagt dat de blootstelling aan licht tijdens en na de labeling beperkt blijft.

Bedek de cellen vervolgens met een fluorescent label, PKH 26, en noteer hoeveel oplossing er is toegevoegd. Incubeer de cellen gedurende vier minuten bij kamertemperatuur. Stop de labelingsreactie door één minuut later een gelijk volume varkenserum aan de kleurstofoplossing toe te voegen.

Verdun de gecombineerde oplossingen één-op-één met volledig groeimedium. Aspireer vervolgens de vloeistof en spoel de cellen drie keer met volledig groeimedium, gevolgd door twee wasbeurten met DPBS zonder calcium- of magnesiumchloride. Bedek de cellen daarna met trypsine, waarbij het gebruikte volume wordt genoteerd, en incubeer ze bij 37 °C.

Na drie minuten incubatie wordt met behulp van microscopie gecontroleerd of de cellen zijn losgekomen; zo ja, voeg dan twee keer zoveel trypsinneutralisatielosung toe als eerder is toegevoegd. Combineer de celoplossingen in één enkele buis en meet de celdichtheid met een hemocytometer. Pellet tot slot de celsuspensie en resuspendeer de cellen in ten minste 4,5 milliliters serumvrij medium.

Nadat het varken voor de operatie is voorbereid, maakt u een incisie in de middellijn met een scalpelblad nummer 15 vanaf de tweede set mammae. Gebruik elektrocauterisatie om voorzichtig door te snijden tot de voorlaatste set. Voer de dissectie uit tot aan de abdominale fascia.

Til het peritoneum op met mosquito-klemmen en maak er voorzichtig een opening in met mets-andal-scharen; externaliseer de urineblaas en plaats een 3-0 Vicryl beursnaad in de blaaswand. Maak een kleine punctie-incisie in het centrum hiervan en voer een 16 French Foley-katheter via de incisie in. Dien vervolgens intraveneuze vloeistoffen toe om de urineproductie tijdens de operatie te titreren tot ten minste 1 ml/kg/u.

Externalise vervolgens de kleine, vergrote darm en plaats twee bour-retractoren om het posterieure aspect van de peritoneale holte bloot te leggen en de Vena Cava Inferior (IVC) te identificeren middels scherpe en botte dissectie. Maak de IVC voorzichtig vrij van het omringende weefsel. Skeletoniseer vervolgens het vat vanaf de rechter nierslagader proximaal tot aan de bifurcatie van de IVC distaal.

Wees uiterst voorzichtig tijdens de dissectie van de Vena Cava Inferior (VCI), aangezien zelfs een zeer klein defect in de VCI kan leiden tot snelle hemorragie en exsanguinatie van het dier; ligeer alle zijtakken van het VCI-segment. Besteed speciale aandacht aan het disseceren en ligeren van de twee grote posterieure lumbale venen direct proximaal van de bifurcatie van de VCI. Er bevindt zich vaak een grote lumbale vene aan de posterieure zijde.

Disseceer deze ader vrij en controleer deze met vaatlusjes. Begin nu, parallel aan de operatie, met het zaaien van het implantaat met EPC's voordat deze procedure wordt gestart. De titanium buis weefselzit-steigers moeten volledig zijn geassembleerd en klaar voor gebruik in een steriel veld.

Open de gasgesteriliseerde titaniumbuisassemblage in een spuit van five cc. Verwijder vervolgens de zuiger uit de spuit van five cc, maar gooi deze niet weg. Bevestig een dop aan de spuit. Gebruik een pipet om de spuit te vullen met de EPC-suspensie.

Plaats vervolgens de zuiger terug. Verwijder de dop en steek het lure-uiteinde van de spuit in de open siliconen slang van de opstelling tot deze precies aansluit. Verwijder daarna eventuele luchtbellen door de celoplossing langzaam vooruit te bewegen totdat deze de bovenkant van het kopstuk bereikt.

Sluit de assemblage vervolgens af met een Luer-dop en plak deze dicht in een steriele handschoen. Plaats deze volledige assemblage in een bewerkte spuitenhouder en zet deze in een incubator van 37 °C. Gebruik een meetinstrument om te controleren of de zittingkamers waterpas staan en laat de assemblage incuberen onder milde rotatie.

Zet de operatie voort direct na het ligeren van de IVC door 100 units heparine per kilogram varken toe te dienen. Klem vervolgens onmiddellijk de IVC in een hoek van 45 graden distaal op de IVC en de lumbale vene, en daarna proximaal. Gebruik vervolgens een scalpelmes nummer 11 en potscharen om een longitudinale venotomie van vier centimeter te maken tussen de proximale en distale klemmen.

Verwijder al het bloed uit de IVC en spoel het binnenste lumen met steriele DPBS. Plaats nu het implantaat met EPC's of een controle van onbehandeld metaal in de IVC om te voorkomen dat de cellen uitdrogen en om lucht te verwijderen. Vul de IVC met DPBS met calciumchloride en magnesiumchloride.

Sluit vervolgens de venotomie met een 4-0 proline doorlopende hechting en verwijder één proximale klem om de IVC te ontluchten via een kleine hoeveelheid terugbloeding. Na de bloeding wordt de distale klem verwijderd om het implantaat op zijn plaats te houden. Plaats een fixatiehechting in de PVC-slang die door de vaatwand gaat.

Sluit de fascia met OPDS op een CT-naald. Sluit de subcutane ruimte met twee draads lopende Vicryl. Zet vervolgens de huid dicht met nietjes.

Dien tot 20 milliliters 0,25% Marcaine subcutaan toe langs de incisielocatie en bedek de wond met gaas en Tegaderm tegen de pijn. Dien flu Nixon en oxymorphone subcutaan toe indien nodig. Beëindig de anesthesie en breng het varken, zodra het ontwaakt, gedurende de volgende zeven dagen terug naar zijn kooi.

Dien elke 24 uur atri toe als antibiotische profylaxe en zorg ervoor dat de fentanylpleister die vóór de operatie is aangebracht, in totaal drie dagen lang blijft kleven. Na drie dagen werden de geplaatste titanium buisimplantaten verwijderd en werden de binnenoppervlakken onderzocht. Bij een excitatiegolflengte van 550 nanometer werd in een andere buis een samenhangende laag fluorescent gelabelde cellen aangetroffen.

Sneden van de cellen werden aanvullend gekleurd met een adhesiemarker voor bloedplaatjes en endotheelcellen om de celgrenzen te visualiseren. In deze procedure kan een breed scala aan kleurstoffen worden gebruikt. Daarentegen raakt een onbehandeld titanium buisimplantaat volledig verstopt in de prothrombotische omgeving met lage afschuifspanning van de vena cava inferior.

Zoals geïllustreerd in afbeeldingen A en C, is de titanium buis waarin de cel is geplaatst weergegeven in afbeelding B en bleef deze vrij van stolsels na onze isolatieprocedure met piekbloed. EPC verschijnen na gemiddeld zeven dagen in cultuur. Tijdens het uitvoeren van de chirurgische procedure is het zeer belangrijk om de IVC voorzichtig en behoedzaam te skeletoniseren, omdat zelfs de kleinste scheur in de IVC of de zijtakken kan leiden tot uitbloeding van het varken. Na deze procedure kunnen andere materialen die in contact komen met bloed snel endotheeliseren om trombose te voorkomen.

Endotheliale vasculaire stents, bijvoorbeeld met onze EPC's, bootsen de natuurlijke bekleding van de bloedvatwand na en kunnen stent-restenose en trombose na de plaatsing voorkomen. Onze quick-seed technologie maakt het mogelijk om intravasculaire hulpmiddelen binnen enkele minuten in de operatiekamer of het catheterisatiecentrum te bekleden met endotheliale progenitorcellen die uit het eigen bloed van de patiënt zijn afgeleid. Hierdoor is langdurige ex-vivo kweek niet meer nodig.

Tijd op het apparaat zelf wordt vermeden en de technologie wordt praktisch voor vertaling naar de klinische praktijk.