Name: Lectine-based Isolatie en cultuur van de muis embryonale motoneuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Leer een lectine-gebaseerde methode om embryonale muismotoneuronen te isoleren en te kweken. Deze techniek verbetert de zuivering van neuronale culturen voor onderzoek naar motorneuronziekten en overleving.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Sandra Bargen voor een uitstekende technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door de research afdeling Protein (PRD, TP A1.2 (RC en TS), en de RUB Research Fond, Rektoratsprogramme -. Wissenschaftlicher Nachwuchs (AK) De monoklonale antilichamen 39.4D5 en F55A10 werden verkregen van de Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa City, IA).

Voor speciale reagentia: zie Tab. 1. Alle vermelde andere reagentia worden in celkweek grade kwaliteit verkregen van Sigma Aldrich. 1. PORN-H/laminin coating van gerechten / dekglaasjes <ol><li> Bereid te werken oplossing van 0,5 mg / ml Poly-DL-ornithine hydrobromide (PORN-H) in 150 mM boraatbuffer pH 8,35. <ol><li> Een voorraad oplossing van 50 mg PORNO / 1 ml boraatbuffer kan worden voorbereid en opgeslagen bij -20 ° C. </li></ol></li><li> Steriliseer dekglaasjes door de vlammen in 100% ethanol en laat ze drogen aan de lucht. </li><li> Bedek de ondergrond met voldoende PORNO-H-oplossing overnacht bij 4 ° C. </li><li> Op de volgende dagen Was driemaal uit met gesteriliseerd water en lucht-drogen dekglaasjes. </li><li> Bereid te werken oplossing van 2,5 ug / ml laminine in HBSS <ol><li> Porties kan worden opgeslagen bij -20 ° C. Dooi bij 4 ° C onmiddellijk voor gebruik. </li></ol></li><li> Bedek het oppervlak van de porno-H-gecoate dekglaasjes met de laminine-oplossing en laat ze minstens 2 uur incuberen bij kamertemperatuur tot gebruik. </li></ol> 2. Lectine coating van de zuivering plaat <ol><li> Bereid een oplossing van 10 mM Tris in gesteriliseerd water, pH 9,5. </li><li> Voeg lectine (het oplossen van de lectine (Sigma L9640) poeder in HBSS), tot een uiteindelijke concentratie van 10 ug / ml. </li><li> Smeer het oppervlak van een 10 cm celkweek schotel met 8 ml van de lectine-oplossing en laat het incubeer gedurende tenminste 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Was de plaat drie keer met HBSS en op te slaan in HBSS tot gebruik. </li><li> Bereid een 30mm KCl, 0,8% (w / v) NaCl depolarisatie-oplossing. Steriliseer door filtratie en bewaar bij kamertemperatuur (RT). </li></ol> 3. Motoneuron kweekmedium <ol><li> Dooi paard serum overnacht bij 4 ° C en inactiveren bij 55 ° C gedurende 30 min, Aliquot in 5 ml en bewaar bij -20 ° C. Ontdooien aliquot direct voor gebruik bij RT. </li><li> Store B27-supplement in 1 ml aliqouts bij -20 ° C. Dooi B27 supplement bij RT onmiddellijk voor gebruik. Vermijd bevriezen en ontdooien cycli. </li><li> Aliquot Glutamax in 0,5 ml porties en bewaar bij -20 ° C en gebruik het bij 1:100. </li><li> Bereid een voorraad oplossing van 10 ug / ml CNTF in gesteriliseerd water met 0,1% BSA. Bewaren bij -20 ° C. </li><li> Meng 46 ml neurobasal medium met 2,5 ml paard serum, 1 ml B27-supplement en 0,5 ml Glutamax direct voor gebruik. </li><li> Voeg CNTF tot een uiteindelijke concentratie van 10 ng / ml medium en pre-warm medium tot 37 ° C. </li></ol> 4. Ruggenmerg dissectie <ol><li> Offer een E12.5 zwangere muis en verwijder voorzichtig de embryo's. Voeg genoeg RT HBSS volledig dekking van de embryo's. </li><li> Verwijder de kop en staart en zet het embryo achterkant met gespreide ledematen. </li><li> Bevestig het embryo met een pincet en verwijder de buitenste huid met de andere tang. </li><li> Verwijder het ruggenmerg door het doorboren van de pincet eronder en til het op met zaag-achtige bewegingen aan beide zijden van het ruggenmerg. </li><li> Breng de geïsoleerde ruggenmerg naar een nieuwe schotel met HBSS en open de centrale kanaal van het ruggenmerg aan de rugzijde. </li><li> Verwijder de achterwortelganglia door het verwijderen van de omsluiten hersenvliezen van het ruggenmerg. </li><li> Verzamel de lumbale delen van het ruggenmerg van maximaal zes embryo's per lectine plaat in een eppendorf reactie buis gevuld met 1 ml HBSS en op te slaan op ijs totdat de bereiding klaar is. </li></ol> 5. Verrijking van motoneuronen van lectine-based zuivering Let op: Voordat u begint met de volgende stappen, de nieuwste hier voor te bereiden en voorverwarmen op de middellange (zie stap 3). <ol><li> Bereid een trypsine-oplossing door het oplossen van 1 g Trypsine in 100 ml HBSS, bewaren bij -20 ° C en dooi bij 4 ° C. </li><li> Mix 1g trypsine-remmer met 98 ml HBSS en 2 ml van 1 M HEPES pH 7,4, moet 1 ml monsters worden bewaard bij 4 ° C. </li><li> Breng de buis met het ruggenmerg naar een cel cultuur kap en verwijder voorzichtig 700 ul van de HBSS. </li><li> Voeg 7,5 ul trypsine-oplossing en meng door zorgvuldig het omkeren van de buis. </li><li> Voer trypsination gedurende 8 minuten bij 37 ° C. </li><li> Stop de reactie door het toevoegen van 30 ul trypsine-remmer en de pipet op en neer (vermaal) zorgvuldig 10-15 keer met een 1000 ui pipettip tot er geen meer mobiele aggregaten zichtbaar zijn. Herhaal de tritureren met een 20-200 ul pipet en de bijbehorende tip. </li><li> Pipetteer de cel oplossing in de HBSS gevulde lectine plaat en verspreiden de cellen door zachtjes het draaien van de plaat. </li><li> Houd de lectine plaat voor 60 min bij RT op een trillingsvrij oppervlak. Bedek het om vervuiling te voorkomen. </li><li> Verwijder de HBSS heel voorzichtig en was de plaat voorzichtig vier keer met voorverwarmd HBSS naar cel fragmenten en het niet is aangesloten / losse cellen te verwijderen. </li><li> Direct na de laatste wasstap, voeg 500 ul depolarisatie oplossing voor de plaat en laat het incubeer gedurende 1 minuut. </li><li> Vergemakkelijken het losmaken van de lectine gebonden cellen door schudden entikken op de plaat. </li><li> Vul de plaat met 2 ml voorverwarmd kweekmedium en over te dragen aan een 15 ml falcon buis. </li><li> Tel aantal cellen met een Neubauer telkamer. </li><li> Het bord van de cel op de laminine beklede dekglaasjes of platen in een voldoende aantal afhankelijk van de toepassing. </li><li> Voer een medium uit te wisselen over dag 1 en vervolgens elke tweede dag door een zorgvuldige vervanging van 50% van het oude medium. Gebruik altijd voorverwarmde, vers bereide nieuwe cultuur medium. </li></ol> 6. Representatieve resultaten: Embryonale motoneuronen kan worden verkregen bij de muis embryo's op E12 naar E14. 2-3% van de totale celpopulatie van het lumbale ruggenmerg bestaat uit motoneuronen en als de dorsale wortel ganglion neuronen zijn p75 NTR-positief ook, is het belangrijk om zich te ontdoen van deze cellen te krijgen vóór het begin van het lectine-based preplating procedure ( voor overzicht zie figuur 1 en figuur 2). Ten tweede, de hersenvliezen ook sterk delende cellen die moet ook worden uitgesloten, omdat ze niet goed kan worden verwijderd door de lectine-based preplating procedure (figuur 2 en figuur 3). In erge gevallen kunnen deze cellen overwoekeren de cultuur platen. De vertegenwoordiger foto's in Figuur 3B en 3D geven ook een indruk over de lagere celdichtheid na het wassen van de procedures zijn uitgevoerd (zie stap 5.9 van het protocol). Culturen van embryonale muis motoneuronen worden meestal gedurende maximaal vijf of zeven dagen. Gedurende deze periode de cellen brengen hun neurieten tot een maximale lengte (figuur 4). Neurieten lengtes zijn sterk afhankelijk van de ondergrond op de borden 8. De typische ondergrond is laminine, die wordt aangebracht op PORNO-H bedekt cultuur gerechten. Motoneuronen kan ook groeien op andere of meer gedefinieerd ondergronden, zoals extracellulaire matrices gegenereerd door water lysis 8. In geval van suboptimale coating, neurieten lengte en de groei conus gebied zijn afgenomen en celdood meestal toeneemt. Trofische ondersteuning speelt een cruciale rol voor de overleving van de embryonale muis motoneuronen in cultuur. Overleving van in eerste instantie plated cellen op dag zeven dalen tot 10% tot 20% zonder trofische steun 6. Brain afgeleide neurotrofe factor (BDNF) en ciliaire neurotrofe factor (CNTF) zijn de meest gebruikte factoren, maar anderen kunnen overleven bevorderen en [Leukemie remmende factor (LIF), Cardiotrophin-1 (CT-1), basic fibroblast groeifactor (bFGF ), insulin-like growth factor 1 (IGF-1) 9]. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Flow schema voor de bereiding van embryonale muis motoneuronen. De schematische tekening illustreert de verschillende stappen voor het kweken van muis embryonale motoneuronen. Afkortingen: SC: het ruggenmerg; HBSS: Hanks gebalanceerde zoutoplossing, MN: motoneuron. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2 Isolatie van het lumbale deel van het ruggenmerg van E12.5 muis A:.. E12.5 muis embryo. Voor de volgende stap worden de kop en de staart verwijderd en het lichaam is geplaatst in een dorsale-up positie B: Embryo in een dorsale-up positie. Pincet aan de linker-en rechterkant van het ruggenmerg zijn tot vaststelling van de embryo lichaam in zijn positie. Een van de forceps wordt vervolgens gebruikt om de huid snijden en te snijden onder het ruggenmerg van de andere wordt gebruikt om het embryo vast te stellen in zijn positie C:. Geïsoleerde ruggenmerg van E12.5 muis embryo. De onderdelen van het ruggenmerg (cervicaal, thoracaal, lumbaal) zijn aangegeven. Het ruggenmerg is omgeven door de hersenvliezen en een deel van de achterwortelganglia nog steeds hechten aan hun D:. Het ruggenmerg is overlangs gesneden op de rugzijde om het te openen naar de centrale kanaal E:. De hersenvliezen aan de ventrale zijde zijn nu genomen af ​​van de platte ruggenmerg. Opmerking: Tijdens het gehaald, het lumbale deel wordt gekenmerkt door een klein sneetje F:. Alleen het lumbale deel van het ruggenmerg wordt dan genomen voor verdere procedures. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3 Bepaling en isolatie van Islet-positieve cellen van de lumbale ruggenmerg van E12.5 muis embryo's A:.. De Islet-1 / 2 antilichaam labelt motoneuron kolommen in de embryonale lumbale ruggenmerg (rood, pijl) en Hoechst labels alle kernen binnen de sectie. Doorsnede van een E12.5 Lumar ruggenmerg. E12.5 muis embryo's werden onderdompeling-gefixeerd in 4% paraformaldehyde gedurende 6 uur, drie keer gewassen met fosfaat-gebufferde zoutoplossing en behandeld met sucrose volgens standaard procedures. Vriescoupes van 20 urn werden genomen met een cryostaat en de secties werden behandeld voor immunhistochemical kleuren volgens standaardprocedures 11. De secties software vervolgens gelabeld met Hoechst voor het lokaliseren van de celkernen. Merk op datde dorsale wortel ganglion neuronen zijn Islet-1/2-positive zo goed en dat de voorbereiding procedure sluit dit weefsel onderdelen uit het isolement procedure B:. Islet-1 label / 2 (rood, pijl) los lumbale ruggenmerg cellen van E12. 5 embryo's, links - voor en rechts - na lectine-based preplating. De cellen werden tegengekleurd met Hoechst om alle celkernen te visualiseren C:. Kwantificering van Islet-1/2-positive cellen voor en na het lectine-based preplating D:. Nkx6.1 label motoneuronen van E12.5 embryo's na een dag in de cultuur. De cellen werden tegengekleurd met Hoechst aan alle kernen cisualieze. Merk op dat 90% van alle cellen Nkx6.1 positief. Afkortingen: SC: het ruggenmerg, MN: motoneuron; DRG: dorsale wortel ganglion. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4 Karakterisering van E12.5 muis motoneuronen A en B:.. Verrijkt geïsoleerd E12.5 muis lumbale spinale motorneuronen p75 NTR uitspreken over 0 dagen in vitro (0div) en op dag 2 in vitro (2div). Cellen werden gefixeerd met 4% paraformaldehyde en vervolgens gekleurd voor p75 NTR volgens standaard procedures. Cellen werden tegengekleurd met behulp van Hoechst om alle kernen te visualiseren C:. Verrijkt motoneuronen na 5 dagen in vitro (5div) op PORN-H en laminine als cultuur substraten en in aanwezigheid van CNTF gekleurd voor β-III-tubuline. Merk op dat de cellen zijn uitgegroeid lange neurieten en weer de typische motoneuron morfologie met een langere (vertakte) proces en een of meer kortere processen (axonen en dendrieten). Afkortingen: MN: motoneuron; div: dag in vitro. <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="3"> Na dissociatie zonder Lectin-based preplating </td></tr><tr><td> Totaal aantal cellen / SC </td><td> Trypan blauw-positieve cellen [%] </td><td> Islet-1/2- positieve cellen [%] </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 995,0 </td><td> 13,1 </td><td> 9,5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 889,4 </td><td> 8,0 </td><td> 10,0 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 1.180.0 </td><td> 11,0 </td><td> 10,8 </td></tr><tr><td> Gemiddelde ± SD </td><td> 1.021.0 ± 147.1 </td><td> 10,7 ± 2,6 </td><td> 10,1 ± 0,7 </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td> Met lectine-based preplating </td></tr><tr><td> Aantal cellen na preplating / SC </td><td> Trypan blauw-positieve cellen [%] </td><td> Islet-1/2- positieve cellen [%] </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 189,6 </td><td> 9,9 </td><td> 70,5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 168,8 </td><td> 3,7 </td><td> 76,1 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 125,0 </td><td> 0,0 </td><td> 72,5 </td></tr><tr><td> Gemiddelde ± SD </td><td> 161,1 ± 33,0 </td><td> 4,5 ± 5,0 </td><td> 73,0 ± 2,8 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Samenvatting van de representatieve isolatie procedures voor de muis embryonale motoneuronen van het podium E12.5. Resultaten van drie verschillende isolatie procedures speciaal voor dit doel worden gegeven als het totaal aantal of percentage nummers ± SD. Afkorting: SC: het ruggenmerg; SD: standaard deviatie. <table border="1"><tbody><tr><td> Eilandje-1 / 2 positieve cellen met een p75-panning [%] </td><td> Eilandje-1 / 2 positieve cellen met lectine-gebaseerde panning [%] </td></tr><tr><td> 92,0 ± 3,5 1 </td><td> 73,0 ± 2,8 </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Vergelijking van de lectine-gebaseerde en p75-op basis van een panning motoneuron cel aantallen. Resultaten worden gegeven als percentage getallen ± SD.

<ol><li>Vallstedt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+levels+of+repressor+activity+assign+redundant+and+specific+roles+to+Nkx6+genes+in+motor+neuron+and+interneuron+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Different levels of repressor activity assign redundant and specific roles to Nkx6 genes in motor neuron and interneuron specification.</a> Neuron. 31, 743-755 (2001).</li>
<li>Tsuchida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographic+organization+of+embryonic+motor+neurons+defined+by+expression+of+LIM+homeobox+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes.</a> Cell. 79, 957-970 (1994).</li>
<li>Lin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+related+motor+neuron+pool+and+muscle+sensory+afferent+subtypes+defined+by+coordinate+ETS+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functionally related motor neuron pool and muscle sensory afferent subtypes defined by coordinate ETS gene expression.</a> Cell. 95, 393-407 (1998).</li>
<li>Wiese, S., Beck, M., Karch, C., Sendtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+mechanisms+for+survival+of+lesioned+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurochir%22%5BJournal%5D)">Signalling mechanisms for survival of lesioned motoneurons.</a> Acta Neurochir. , 21-35 (2004).</li>
<li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research%3A+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li>
<li>Bullen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+imaging+techniques+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Microscopic imaging techniques for drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).</li>
<li>Hazelwood, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entering+the+Portal%3A+Understanding+the+Digital+Image+Recorded+Through+a+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Imaging+Cellular+and+Molecular+Biological+Functions%22%5BJournal%5D)">Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope.</a> Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).</li>
<li>Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-selectin+facilitates+emigration+and+extravascular+locomotion+of+leukocytes+during+acute+inflammatory+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo.</a> J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).</li>
<li>Cara, D. C., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+as+a+tool+for+studying+recruitment+and+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).</li>
<li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LSP1+is+an+endothelial+gatekeeper+of+leukocyte+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration.</a> J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).</li>
<li>Heit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+accelerates%2C+but+is+not+required+for%2C+neutrophil+chemotaxis+to+fMLP%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP.</a> J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Het voordeel van deze lectine-based preplating techniek is dat het minder duur dan de p75 NTR-based panning procedure, en de lectine is stabieler dan antilichamen. De verrijking die in Fig. 2 en Tab. 1 laat zien dat de procedure maakt het mogelijk om de zuivering van vergelijkbare aantallen cellen en dat een meerderheid van deze cellen drukken de motoneuron marker Islet-1 / 2. De meest kritische stap is de isolatie procedure voor de lumbale ruggenmerg. Het verwijderen van de hersenvliezen en de DRG&#39;s (afb. 2) is essentieel voor de volgende zuivering procedure door lectine-based preplating. Als dit correct is geslaagd, bijna alle cellen drukken de p75 NTR (voor representatief beeld zie Fig. 3a). De reden voor het verschil tussen expressie van Islet-1 / 2 en p75 NTR is waarschijnlijk omdat lumbale motoneuronen verschillend uiten hogere en lagere niveaus van Islet-1 / 2 10. In het geval van lage niveaus van Islet-1 / 2 expressie dit zou kunnen zijn ontsnapt onze aandacht in de immuncytochemical vlekken en de daaropvolgende tellen als wij waren streng met betrekking tot de positieve versus negatieve cellen (tabel 1). Bovendien, Tabel 1 toont duidelijk aan dat de geïsoleerde cellen de procedure te overleven in een gezonde toestand, want er zijn slechts weinig trypan-blauw positieve cellen die aangeven dat de cellen onherstelbaar beschadigd zijn. Deze alteratief procedure maakt het ook mogelijk isolatie van motoneuronen van single embryo&#39;s en dus ook van gemengde genotype nesten van embryonale muizen. Kortom, dit alternatief voor de panning procedure met de p75 NTR antilichaam 6 is vergelijkbaar met of zelfs identiek zijn capaciteiten op het gebied van de mogelijke toepassingen bereiken en biedt een goedkoop en efficiënt alternatief zuiveringsmethode voor de muis embryonale motoneuronen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Poly-DL-ornithine hydrobromide </td><td> Sigma </td><td> P8638 </td><td></td></tr><tr><td> Laminine </td><td> Invitrogen </td><td> 23017-015 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> Dekglaasjes </td><td> Thermo </td><td></td><td> Ø 10 of 14mm </td></tr><tr><td> Lectine </td><td> Sigma </td><td> L5142 </td><td></td></tr><tr><td> Celcultuur schotel </td><td> Nunc </td><td> 150350 </td><td> Nunclon delta oppervlak </td></tr><tr><td> Paardenserum </td><td> Linaris </td><td> SHD3250ZK </td><td> Elke partij moet worden getest MN cultuur </td></tr><tr><td> B27 Supplement </td><td> Gibco </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Gibco </td><td> 35050-038 </td><td></td></tr><tr><td> CNTF </td><td> Sigma </td><td> N0513 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Applichem </td><td> A1391 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> 21103-041 </td><td></td></tr><tr><td> Pincet </td><td></td><td></td><td> Roestvrij staal, maat 4 of 5 </td></tr><tr><td> Trypsine </td><td> Worthington </td><td> LS003707 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine-remmer </td><td> Sigma </td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Islet-1 </td><td> DSHB </td><td> 39.4D5 </td><td> Celkweeksupernatant </td></tr><tr><td> Anti-Nkx6.1 </td><td> DSHB </td><td> F55A10 </td><td> Celkweeksupernatant </td></tr><tr><td> Anti-p75 NTR </td><td> Abcam </td><td> Ab8874 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 3. Tabel van specifieke reagentia en apparatuur.

lectine-based isolatie en cultuur van de muis embryonale motoneuronen

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Spinal motoneuronen ontwikkelen in de richting postmitotische stadia vroege embryonale ontwikkeling van het zenuwstelsel en vervolgens uitgroeien dendrieten en axonen. Neuro-epitheliale cellen van de neurale buis die uitdrukken Nkx6.1 zijn de unieke voorloper cellen voor spinale motoneuronen 1. Hoewel postmitotische motoneuronen de richting van hun definitieve standpunt en zichzelf te organiseren in kolommen langs de spinale kanaal 2,3. Meer dan 90% van al deze gedifferentieerde en gepositioneerd motoneuronen uiten de transcriptiefactoren Islet 1 / 2. Ze innerveren de spieren van de ledematen als die van het lichaam en de inwendige organen. Onder andere motorneuronen meestal uiten de hoge affiniteit receptoren voor de hersenen afgeleide neurotrofe factor (BDNF) en neurotrofine-3 (NT-3), de tropomyosine-gerelateerde kinase B en C (TrkB, TrkC). Ze drukken niet de tropomyosine-gerelateerde kinase A (TrkA) 4. Naast de twee hoge affiniteit receptoren, doe motoneuronen drukken de lage affiniteit neurotrofine p75 NTR. De p75 NTR kunnen binden alle neurotrofinen met soortgelijke maar een lagere affiniteit voor alle neurotrofinen dan de hoge affiniteit receptoren zou binden de volwassen neurotrofinen. Binnen de embryonale ruggenmerg, is de p75 NTR uitsluitend uitgedrukt door de wervelkolom motoneuronen 5. Deze is gebruikt om motoneuron isolatie technieken te ontwikkelen om de cellen van de overgrote meerderheid van de omringende cellen 6 te zuiveren. Isoleren van motorneuronen met de hulp van specifieke antilichamen (panning) tegen de extracellulaire domeinen van de p75 NTR heeft bleek een dure methode als de hoeveelheid van de antistof gebruikt voor een enkel experiment is hoog vanwege de grootte van de plaat wordt gebruikt voor panning worden. Een veel goedkoper alternatief is het gebruik van lectine. Lectine is aangetoond dat specifiek te binden aan p75 NTR ook 7. De volgende werkwijze beschrijft een alternatieve techniek met behulp van tarwekiemen agglutinine voor een preplating procedure in plaats van de p75 NTR antilichaam. De lectine is een zeer goedkoop alternatief voor de p75 NTR antilichaam en de zuivering met behulp van cijfers lectine zijn vergelijkbaar met die van de p75 NTR antilichaam. Motoneuronen van de embryonale ruggenmerg kunnen worden geïsoleerd door deze methode, te overleven en te groeien uit neurieten.

Een alternatieve manier van isoleren van muis embryonale motorneuronen van het ruggenmerg wordt beschreven. De methode houdt rekening met het feit dat de lectine kan binden aan de lage affiniteit zenuw groeifactor receptor p75NTR. Deze lectine-based preplating kan een zuivering vergelijkbaar met die met een specifiek antilichaam tegen de p75NTR.

Lectine-based Isolatie en cultuur van de muis embryonale motoneuronen

Spinale motoneuronen ontwikkelen zich naar postmitotische stadia tijdens de vroege embryonale ontwikkeling van het zenuwstelsel en laten vervolgens dendrieten en axonen uitgroeien. ...

Het algemene doel van deze procedure is het verkrijgen van een verrijkte kweek van embryonale motorneuronen van muizen. De procedure begint met het opofferen van een drachtige muis, het verwijderen van de embryo's en het dissekeren van het lumbale ruggenmerg. De volgende stap is het dissocieren van het ruggenmerg tot een enkelcellige suspensie door middel van enzymatische behandeling en incubatietijd.Voer vervolgens de lectine-gebaseerde zuivering uit om de motorneuronen van de overige cellulaire resten te scheiden. Bepaal daarna het totale aantal cellen en zaai de cellen uit op vooraf gecodeerde schaaltjes of dekglasjes. De laatste stap is het aanpassen van de dichtheid van de cultuur, afhankelijk van de experimentele procedure.Uiteindelijk kan, naarmate de gecultiveerde cellen groeien, de typische morfologie van motorneuronen worden waargenomen voor een succesvol resultaat. Bij het voorbereiden van de kweek van muismotorneuronen is het essentieel om verschillende materialen, stoffen en oplossingen te testen. Omdat de cellen gevoelig kunnen reageren op elke wijziging hierin, kunnen de motorneuronen in een hoge dichtheid worden gekweekt voor de isolatie van RNA of eiwitten.Er is echter een mogelijkheid dat de cellen actieve neuronale netwerken vormen, wat leidt tot overleving onafhankelijk van transportondersteuning. Daarom kan het in sommige gevallen beter zijn om de cellen bij een lage dichtheid te kweken voor RNA- of proteïneanalyse; deze procedure wordt gedemonstreerd door Rebecca Conrad en Terza Japan. Beiden zijn promovendi in ons laboratorium.Begin deze procedure met het bereiden van de werkoplossing van 0,5 mg/mL poly-DL-ornithine hydrobromide in 150 mM bide buffer met pH 8,35 en steriliseer de oplossing door filtratie. Steriliseer vervolgens de glazen dekglasjes door ze te vlammen in 100% ethanol. Laat ze daarna aan de lucht drogen en bedek het oppervlak van de dekglasjes overnacht bij 4 °C met voldoende porn H-oplossing voor de volgende dag.Was ze drie keer met gesteriliseerd water. Laat ze daarna aan de lucht drogen. Bereid de werkoplossing van 2,5 µg/mL.Bedek het oppervlak van de Poly-L-lysine gecoate dekglasjes met de laminine-oplossing in HBSS. Incubeer deze vervolgens gedurende ten minste twee uur bij kamertemperatuur tot aan het gebruik. De volgende stap is het bereiden van een oplossing van 10 millimol Tris in gesteriliseerd water met pH 9,5.Voeg na het filteren van de oplossing lectine toe aan het mengsel tot een eindconcentratie van 10 µg/mL. Coat vervolgens het oppervlak van een cellentestschotel van 10 cm met acht milliliter van de lectine-oplossing en incubeer deze gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur. Was de plaat vervolgens 3 keer met HBSS en bewaar de plaat in HBSS tot gebruik.Bereid daarna de depolarisatielosging met 30 millimolar kaliumchloride en 0,8% natriumchloride. Steriliseer het mengsel vervolgens door filtratie en bewaar het bij kamertemperatuur. Om met deze procedure te beginnen, wordt paardenserum gedurende de nacht ontdooid bij vier graden Celsius.Inactiveer het vervolgens gedurende 30 minuten bij 55 °C, verdeel het in porties van vijf milliliter en bewaar de aliquoten bij -20 °C. Ontdooi één aliquot direct bij kamertemperatuur voor gebruik; bewaar de B 27-supplementen vervolgens in aliquoten van één milliliter bij -20 °C.Ontdooi op kamertemperatuur vlak voor gebruik. Vermijd herhaaldelijke vries-dooi-cycli door glutamaat te verdelen in aliquoten van 0,5 milliliter en deze te bewaren bij -20 °C. Bereid vervolgens een stamoplossing voor van 10 µg/mL CNTF in gesteriliseerd water met 0,1% BSA en bewaar deze bij -20 °C.Meng ten slotte 46 milliliters neurobasaal medium met 2,5 milliliters paardenserum, één milliliter B 27 supplement en 0,5 milliliters glutamaat. Voeg CNTF direct toe tot een eindconcentratie in het medium van 10 nanograms per milliliter. Verwarm het voor tot 37 degrees Celsius.Offer op dit punt een zwangere muis van 12,5 embryonale dagen en verwijder de embryo's voorzichtig. Voeg HBSS op kamertemperatuur toe om de embryo's volledig te bedekken en plaats een embryo onder een microscoop. Verwijder vervolgens de kop en de staart en plaats het embryo met de rugzijde naar boven en de ledematen gespreid.Fixeer vervolgens het embryo met één pincet en verwijder de buitenste huid met het andere pincet. Verwijder daarna het ruggenmerg door met het pincet eronder te prikken en het ruggenmerg met zaagachtige bewegingen aan beide zijden omhoog te tillen. Breng het geïsoleerde ruggenmerg over naar een nieuwe schaal met HBSS.Open het centrale kanaal van het ruggenmerg aan de dorsale zijde. Verwijder vervolgens de dorsale wortelganglia door de omliggende hersenvliezen van het ruggenmerg te verwijderen. Breng daarna de ruggenmergen over naar een EOR-reactiebuis gevuld met 1 mL HBSS.Houd ze op ijs tot de voorbereiding voor de digestie van het ruggenmerg is voltooid. Verplaats de buis met de ruggenmergen naar een celkweekkast. Verwijder voorzichtig 700 µL HBSS en voeg vervolgens 7,5 µL van de ontdooide 1% trypsine-oplossing toe, die eerder is bereid zoals beschreven in het bijbehorende manuscript.Meng deze vervolgens door de buis voorzichtig om te keren. Voer de trypsinisatie uit gedurende acht minuten bij 37 °C. Stop daarna de reactie door 30 µL trypsineremmer toe te voegen; pipetteer dit voorzichtig 10 tot 15 keer op en neer met een 1000 µL pipetpunt totdat er geen celaggregaten meer zichtbaar zijn.Herhaal daarna de handeling met een pipet van 20 tot 200 microliter. Pipetteer de celoplossing in de met HBSS gevulde lectineplaat en verspreid de cellen door de plaat voorzichtig te draaien. Dek de lectineplaat af om contaminatie te voorkomen en bewaar deze gedurende 60 minuten op kamertemperatuur op een trillingsvrij oppervlak.Verwijder zeer voorzichtig de HBSS en was de plaat vier keer zorgvuldig met voorverwarmde HBSS om celfragmenten en niet-gehechte cellen te verwijderen. Voeg direct na de laatste wasstap 500 µL van de 30 mM kaliumchloride 0,8% natriumchloride depolarisatielosning toe aan de plaat en incubeer deze gedurende één minuut. Schud en tik tegen de plaat om het loslaten van de lectine-gebonden cellen te vergemakkelijken. Vul de plaat aan met 2 mL voorverwarmd kweekmedium. Draag het geheel vervolgens over naar een 15 mL Falcon-buis.Tel het aantal cellen met een Neubauer-telkamer. Plaats de cellen vervolgens op de met laminine gecoate dekglasplaatjes of platen. Verschoon het medium op dag één en daarna om de twee dagen door voorzichtig 50% van het oude medium te vervangen door voorverwarmd, vers bereid medium.Het hier getoonde medium is een dwarsdoorsnede van een embryonaal lumbaal ruggenmerg van 12,5 dag, gelabeld met herst voor de lokalisatie van de celkernen. De pijl geeft de motorneuronkolommen aan binnen het embryonale lumbale ruggenmerg, gelabeld met eyelet one two antilichaam. Een voorbeeld van eyelet one two gelabelde gedissocieerde cellen.Cellen uit het lumbale ruggenmerg van embryo's van 12,5 dagen vóór en na lectine-gebaseerde pre-plating worden respectievelijk in het linker- en rechterpaneel getoond. De kwantitatieve resultaten van eyelet one two-positieve cellen vóór en na lectine-gebaseerde pre-plating worden hier weergegeven. Hier is een voorbeeld dat de verrijkte motorneuronen op dag nul en dag twee laat zien; de cellen werden gefixeerd met 4%paraldehyde en vervolgens gekleurd voor P 75 NTR.Volgens standaardprocedures werden ze vervolgens tegengekleurd met hooks om alle kernen te visualiseren na vijf dagen in vitro op porn H en laminaat als cultuursubstraten en in aanwezigheid van CNTF voor beta drie tubuline-kleuring; de cellen hebben lange neurieten ontwikkeld en vertoonden de typische morfologie van motorneuronen, met één langer uitstulping en één of meer kortere uitstulpingen. Motorneuronen spelen een centrale rol in het lichaam van alle gewervelde en ongewervelde dieren.Deze isolatie is uiterst nuttig voor de analyse van overlevingsmechanismen van motorneuronen. Met de geïsoleerde cellen kan men selectief de activiteiten van andere interagerende cellen, proteïnen en koolhydraten analyseren, en farmacologische stoffen toepassen op de overleving en neurologische groei van deze cellen.

lectin-based-isolation-and-culture-of-mouse-embryonic-motoneurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We ontwikkelden een nieuw protocol om de efficiëntie van de in vitro differentiatie van muis embryonale stamcellen in motorneuronen te verbeteren. De gedifferentieerde ES-cellen verworven motorische neuronen heeft, zoals blijkt uit de expressie van neuronale en motor neuron markers met behulp van immunohistochemische technieken.

Efficiënte Differentiatie van muis embryonale stamcellen in de motorische neuronen

We beschrijven een snelle methode voor het isoleren en cultuur hippocampus en corticale neuronen van knaagdieren embryo's. Dit protocol stelt ons in staat uit te voeren experimenten waarbij bijna zuivere neuronale culturen zijn vereist.

Isolatie en Cultuur van Rat Embryonale neurale cellen: een Quick-protocol

Isolatie van embryonale neurale lijst van de neurale buis vergemakkelijkt het gebruik...

Isolatie en Cultuur van neurale lijst cellen van embryonale Murine Neural Tube

The video demonstrates the isolation of oculomotor, trochlear, and spinal motor neurons from a transgenic mouse embryo. The embryo expresses motor neurons labeled with a green fluorescent protein (GFP) for easy visualization and identification. The motor neurons are surgically isolated under a fluorescence microscope and maintained in a culture medium.

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from a Mouse Embryo

This video demonstrates a protocol for isolating and culturing primary cerebral cortex cells from the dorsolateral telencephalon of mouse embryos.

Isolation and Culturing of Cells from Mouse Embryo Dorsolateral Telencephalons

The video demonstrates the process of isolating and culturing dopamine neurons from the midbrain of mouse embryos. The isolated ventral midbrain floors are dissociated using enzymes. The resulting dopamine neurons are harvested and transferred into micro-islands inside multi-well plates. The cells are incubated with a dopamine neuron medium to maintain the cells at a high density inside the micro-islands.

Isolation and Culture of Primary Embryonic Mouse Midbrain Dopamine Neurons

We demonstreren een celkweekprotocol voor de directe studie van neuronale en gliale componenten van het enterische zenuwstelsel. Een gemengde neuron/glia-kweek op dekglasjes wordt bereid uit de myenterische plexus van een volwasen muis, waardoor het mogelijk is om de functie van afzonderlijke neuronen en gliacellen te onderzoeken door middel van elektrofysiologie, immunohistochemie, enz.

Een<em&gt; In-vitro</em&gt; Voorbereiding van Geïsoleerde enterische neuronen en Glia uit de myenterische Plexus van de Adult Mouse

Deze studie presenteert een techniek voor de isolatie van neuronen van WT-neonatale muizen. Het vereist de zorgvuldige dissectie van het ruggenmerg van de neonatale muis, gevolgd door de scheiding van neuronen uit het ruggenmergweefsel door mechanische en enzymatische splitsing.

Spinal Cord Neurons Isolatie en Cultuur van Neonatale Muizen

Het doel van deze techniek is om voor te bereiden een hoogverrijkt cultuur van primaire motoneurons (MNs) van lymfkliertest ruggenmerg. Om te beoordelen van de gevolgen van mutaties veroorzaakt MN ziekten, beschrijven we hier het isolement van deze geïsoleerd MNs en hun transfectie door magnetofection.

Modelleren ziekte van Charcot-Marie-Tooth In Vitro door muis primaire Motoneurons Transfecting

Hier introduceren wij een nieuwe microchirurgische techniek voor de isolatie van neurale stamcellen uit de E13 muis embryo ganglionaire eminentie.

Isolatie en cultuur van muis embryonale neurale stamcellen

Dit werk presenteert een protocol voor het opleveren van homogene celculturen van primaire Oculomotor, trochlear, en ruggengraat motorneuronen. Deze culturen kunnen worden gebruikt voor vergelijkende analyses van de morfologische, cellulaire, moleculaire en elektrofysiologische kenmerken van oculaire en spinale motorneuronen.

Isolatie en cultuur van Oculomotor, Trochlear en spinale motor neuronen van prenatale ISLMN: GFP transgene muizen

Leer een lectine-gebaseerde methode om embryonale muismotoneuronen te isoleren en te kweken. Deze techniek verbetert de zuivering van neuronale culturen voor onderzoek naar motorneuronziekten en overleving.

Lectine-based Isolatie en cultuur van de muis embryonale motoneuronen

Meer video's verkennen