Name: Experimentele Generatie van Carcinoom-geassocieerde fibroblasten (cafes) van Human Borst fibroblasten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 43 s
Description: Leer hoe u carcinoom-geassocieerde fibroblasten genereert uit humane borstfibroblasten met een co-implantatie tumorxenograftmodel. Deze methode maakt het mogelijk om de rol van myofibroblasten in tumorprogressie te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken dr. Robert A. Weinberg (Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge) voor de genereuze steun en begeleiding van dit werk en de heer Kieran Mellody (University of Manchester, Manchester), voor een kritische redactie van dit manuscript. Dit project werd ondersteund door Research Verenigd Koninkrijk (CR-VK) te verlenen nummer C147/A6058 (AO)

1. Isolatie van de primaire gekweekte menselijke normaal door de melkklieren fibroblasten Experimentele procedures voor het isoleren van primaire gekweekte menselijke fibroblasten normaal door de melkklieren worden beschreven in Fig. 1A. <ol><li> Bereid de cel dissociatie buffer, zoals eerder 12 beschreven: Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) met 10% foetaal kalf serum (FCS), penicilline-streptomycine (200 eenheden / ml), collagenase type I (1 mg / ml) en hyaluronidase ( 125 eenheden / ml). </li><li> Was het borstweefsel ontleed van een verlaging van mammoplasty (~ 0,5 gram) enkele malen in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Hak het weefsel in kleine fragmenten (&lt;1.5 mm 3) met behulp van steriele scheermesjes. </li><li> Overdracht van het weefsel fragmenten in een 15 ml conische buis met een geschikte hoeveelheid van de bovenstaande cel dissociatie buffer (10 ml per 0,5 gram weefsel) en vortex gedurende 1 minuut op maximale snelheid. </li><li> Digest het weefsel fragmenten in de cel dissociatie buffer fof 12 tot 18 uur bij 37 ° C met langzame agitatie. * Merk op dat er nog steeds zijn veel stukken van onverteerd weefsel fragmenten die nog in de buis. </li><li> Incubeer de buis gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur zonder agitatie. Breng de resulterende stromale cel-verrijkte supernatant in een nieuwe conische buis met behulp van een 5 ml serologische pipet. </li><li> Centrifugeer de stromale fractie gedurende 5 min bij 250 xg en resuspendeer de celpellet in PBS. Centrifugeer opnieuw gedurende 5 min bij 250 xg en resuspendeer de celpellet in DMEM aangevuld met 10% FCS. Cultuur van de cellen in DMEM met 10% FCS in een 15 cm petrischaal bij 37 ° C en 5% kooldioxide. </li><li> Propageren van de cellen tot confluent. Het zal meestal 8-10 dagen. Bewaar de cellen bij -80 ° C met behulp van bevriezing medium (10% dimethylsulfoxide en 20% FCS in DMEM). Bereid 5 bevroren flacons als een origineel voorraad. Dooi een flacon en uitbreiden van de cellen om 5 flacons voor te bereiden op de secundaire voorraad met fibroblasten gepasseerd binnen de vijf inwonersdubbelingen (PD) voor de volgende experimenten. Deze procedures te minimaliseren kloonselectie en cultuur benadrukken dat kan optreden tijdens langdurige weefselkweek. * Merk op dat de P1.1-7 ook kan worden gebruikt voor het isoleren van cafe's van borst carcinomen verkregen door een borstamputatie 12. </li></ol> 2. Genereren van GFP-gelabelde, puromycine-bestendig, onsterfelijke, menselijke normaal door de melkklieren fibroblasten <ol><li> Om vereeuwigen van de primaire menselijke normaal door de melkklieren fibroblasten geïsoleerd in P1.7), invoering van een retrovirale pMIG (MSCV-IRES-GFP) vector 12, uitdrukken zowel hTERT en GFP. De cultuur van de cellen gedurende 4-5 dagen en dan sorteren GFP-positieve cellen met behulp van flow cytometrie. </li><li> Introduceer een retrovirale pBabe-puro construct dat codeert voor een puromycine resistentiegen in het GFP-gelabelde vereeuwigd fibroblasten. De cultuur van de cellen gedurende 5-7 dagen in de aanwezigheid van puromycine (eindconcentratie: 1 ug / ml) aan de GFP-positieve (GFP +), puromycine-resistente (R puro isoleren </li><li> Naast, na te gaan of deze fibroblasten actieve virussen, wat kan leiden tot de horizontale overdracht van genen die coderen voor GFP en puromycine weerstand, groeien 2.5x10 5 GFP + R puro onsterfelijke, menselijke borstklieren fibroblasten in een 6 cm petrischaaltje voor 2 dagen. Produceren </li><li> Filtermedium geconditioneerd door deze fibroblasten met behulp van een injectiespuit (poriegrootte: 0,45 pm) en voeg deze toe op 10T1 / 2 muis fibroblastische cellen voor 12u in de aanwezigheid van protamine sulfaat (5 pg / ml) die de efficiëntie van het virus infectie toeneemt. Het medium wordt dan gewijzigd in 10% FCS-DMEM voor extra 2 dagen. </li><li> Onderzoek de cellen door een fluorescentie microscopie. 10T1 / 2 cellen geïnfecteerd met GFP virus zal GFP-positieve. Behandel ook de cellen met puromycine (1 ug / ml) gedurende 5-7 dagen en let op de plaat als een puro R 10T1 / 2 cellen aanwezig zijn en vormen kolonies na het puromycine behandeling. </li><li> Merk op dat de horizontale gen transfer door actieve virussen die door de ouders GFP + R puro menselijke fibroblasten borstklieren kunnen maken van de omringende muriene cellen en / of carcinoom cellen GFP + R puro binnen de tumor xenotransplantaten. Dit kan belemmeren de processen van het isoleren van de aanvankelijk ingespoten GFP + R puro menselijke fibroblasten borstklier van de tumor xenotransplantaten. </li></ol> 3a. Coinjection van de menselijke fibroblasten borstklier met een mammacarcinoom cellen in een muis immunodeficiënte Experimentele procedures voor het genereren van exp-cafe's zijn weergegeven in Fig. 1Ba. <ol><li> Mix 6 1x10 MCF-7-ras menselijke borstcarcinoom cellen en 3x10 6 GFP + R puro, onsterfelijke, menselijke fibroblasten borstklieren gegenereerd in P2.2). Bereid de cellen in 400 pi kweekmedium met 50% (v / v) Matrigel per injectie. </li><li> Injecteer de cel mengsel subcutaan in een immunodeficiënte naakt muis. Wanneer CAFS onafhankelijk gewonnen uit verschillendetumoren, implantaat elk mengsel in links en rechts flanken van verschillende muizen. </li></ol> 3b. Injectie van menselijke fibroblasten in een borstklier immunodeficiënte muis <ol><li> Voor het genereren van controle fibroblasten tegen exp-cafe's, voor te bereiden 3x10 6 GFP + R puro onsterfelijke, menselijke fibroblasten borstklieren gegenereerd in P2.2 in 400 pi kweekmedium met 50% (v / v) Matrigel per injectie (Fig. 1BB). NIET mengen van de fibroblasten met een carcinoom cellen. </li><li> Implantaat de fibroblasten opgesteld P3b.1 in subcutaan plaatsen van naakt muizen. </li></ol> * Merk op dat de geïnoculeerde fibroblasten zal de fibroblastische weefsel, maar niet tumor vormen onder de huid. 4a. Dissectie van tumor xenograft <ol><li> Euthanise de muis drager zijn van een subcutane humane borstkanker xenotransplantaatmodellen 42 dagen post-implantatie (Fig. 1Ba). * Merk op dat wanneer andere carcinoom cellen en / of fibroblasten zijn coimplantedKan fibroblasten moeten worden geïncubeerd langer dan 42 dagen binnen de tumor xenograft om hun myofibroblastic fenotype te initiëren. </li><li> Oogst de tumor xenograft uit de flank van de muis door stompe dissectie met behulp van een tang en schaar. Dompel het tumorweefsel in PBS. </li></ol> 4b. Dissectie van fibroblast xenograft <ol><li> Euthanise de muis het herbergen van de fibroblast xenograft 42 dagen post-implantatie (Fig. 1BB). </li><li> Ontleden van de onderhuidse fibroblast xenograft met behulp van een tang en schaar. Plaats de fibroblastische weefsel in PBS. * Merk op dat een fibroblast xenograft, die verschijnt als een klein doorzichtig weefsel, kan moeilijk zijn te vinden onder de huid. </li></ol> 5. De voorbereiding van de primaire gekweekte cellen uit xenotransplantaten <ol><li> Gebruik een steriele bioveiligheid kabinet om de tumor (~ 0,5 gram) of fibroblastische weefsel (~ 0,1 gram) ontleden. Breng het weggesneden weefsel op de top van een 15 cm cultuur dISH met 1 ml PBS. Hak de weefsels in kleine stukjes weefsel (&lt;1.5 mm 3) met behulp van steriele scheermesjes. * Merk op dat als de fibroblast xenograft weegt minder dan 0,1 gram, een paar extra fibroblast xenografts te verzamelen en meng ze samen om het aantal cellen voor de isolatie te verhogen. </li><li> Overdracht van het weefsel fragmenten in een 15 ml conische buis met daarin de cel dissociatie buffer (10 ml per 0,5 gram weefsel) en vortex gedurende 1 minuut op maximale snelheid. </li><li> Incubeer de celsuspensie gedurende 3 uur bij 37 ° C onder voortdurend langzaam agitatie. </li></ol> 6. Isolatie van puromycine-resistente cellen in cultuur <ol><li> Centrifugeer de celsuspensie gescheiden ofwel uit tumor of fibroblast xenograft gedurende 5 min bij 250 xg en resuspendeer de celpellet in PBS. Centrifugeer opnieuw gedurende 5 min bij 250 X g. Resuspendeer de resulterende celpellet in 10% FCS-DMEM. Cultuur van de cellen in een 15 cm petrischaal in de aanwezigheid van puromycine (1 pg / ml) bij 37 ° Cen 5% kooldioxide om eventuele vervuilende carcinoom cellen en / of muizen stromale cellen te elimineren. Propageren de cellen tot de samenvloeiing (2-4 weken). Bewaar de cellen bij -80 ° C met behulp van bevriezing medium. * Merk op dat de resulterende puro R-cellen, genaamd 42-dagen-oude exp-CAF1 (Fig. 1Ba) of controle fibroblast-1-cellen (Fig. 1BB), zijn onsterfelijk en positief voor GFP. Het wordt aanbevolen om te controleren of deze cellen produceren met behulp van actieve virussen 10T1 / 2 cellen, zoals beschreven in P2.3-6. </li></ol> 7a. Isolatie van exp-CaF2 cellen in cultuur Verder te versterken de geactiveerde myofibroblastic fenotype van cafe's, meng de 42-dagen-oude exp-CAF1 cellen met MCF-7-ras-cellen en opnieuw injecteren ze subcutaan in een naakt muis voor een periode van 200 dagen. Ontleden en dissocieren de tumor xenograft in een single-cell vering en de cultuur van de cellen in een 15 cm petrischaal met 10% FCS-DMEM in de aanwezigheid van puromycine (1 pg / ml), zoals aangegeven in de P60.1. Propageren de cellen tot de samenvloeiing (8-10 dagen). Bewaar de cellen bij -80 ° C met behulp van bevriezing medium. De resulterende puro R-cellen zijn genoemd 242-dagen-oude exp-CaF2 cellen (Fig. 1Ba). 7b. Extractie van controle fibroblast-2 cellen in cultuur Voor het genereren van controle fibroblasten tegen exp-CaF2 cellen, alleen injecteren 42-dagen-oude-controle fibroblast-1-cellen, zonder carcinoom cellen subcutaan in een naakt muis bovendien gedurende 200 dagen. Ontleden en dissocieren de fibroblastische weefsel in een enkele cel schorsing en de cultuur van de cellen in een 15 cm petrischaal met 10% FCS-DMEM in de aanwezigheid van puromycine (1 pg / ml), zoals aangegeven in P6.1. Propageren de cellen tot de samenvloeiing (3-4 weken). Bewaar de cellen bij -80 ° C met behulp van bevriezing medium. De resulterende puro R-cellen zijn genoemd controle fibroblast-2 cellen (Fig. 1BB). 8. Representatieve resultaten: Controle fibroblast-2 en exp-CaF2 cells, die zijn gewonnen uit borsttumor xenotransplantaten, gekleurd sterk positief voor mesenchymale markers, inclusief het menselijk-specifieke vimentine, prolyl-4-hydroxylase, collageen 1A, fibronectine, S100A4, en fibroblast oppervlakte-eiwit (Fig. 2A) 11, met vermelding van de mens oorsprong en de aard van deze mesenchymale cellen. Daarentegen was de cytokeratine, een marker voor epitheliale cellen, niet gekleurd in deze GFP + fibroblasten (Fig 2B). Deze bevindingen stellen daarom voor dat de afgezogen exp-CaF2 en controle fibroblast-2-cellen zijn ontstaan ​​uit de ouderlijke menselijke borstklieren fibroblasten in eerste instantie geïntroduceerd in de muis xenotransplantaten. Belangrijk is dat een groter deel van de exp-CaF2 cellen gekleurd positief voor α-SMA en de extracellulaire matrix glycoproteïne tenascine-C 5, die beide markers van myofibroblasten in vergelijking met 42-dagen-oude exp-CAF1 en controle fibroblast-2 cellen (Fig . 2C, D) 11. Deze gegevens wijzen erop dat de inwoner de menselijke borstklieren glasvezelnetoblasten geleidelijk evolueren naar CAF myofibroblasten binnen de tumor xenotransplantaten. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3201/3201fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1 Schematische weergave van de isolatie van humane mamma-fibroblasten. A) De vermindering mammoplasty weefsel werd gehakt met behulp van steriele scheermesjes (P1.2) en overgebracht in een 15 ml conische tube (P1.3). De kleine weefsel fragmenten werden verteerd in de cel dissociatie buffer (P1.4) en voorbereid voor cultuur in vitro (P1.5-7). Om vereeuwigen de geïsoleerde primaire menselijke borstklier fibroblasten, een retrovirale pMIG (MSCV-IRES-GFP) vector uitdrukken zowel hTERT en GFP, werd geïntroduceerd, en de resulterende GFP-positieve cellen werden gesorteerd met behulp van flow cytometrie (P2.1). Een retrovirale pBabe-puro vector coderend voor een puromycine resistentiegen werd vervolgens ingebracht in deze cellen. Bij de behandeling puromycine, GFP-gelabelde (GFP +) puromycine-resistente (Puro R), immortalised menselijke borstklieren fibroblasten werden geïsoleerd (P2.2). Ba) Voor het genereren van exp-cafe's, GFP + R puro onsterfelijke, menselijke borstklieren fibroblasten werden coinjected met MCF-7-ras mammacarcinoom cellen subcutaan in een immuundeficiënte naakt muis (P3a). De tumor xenograft werd gereseceerd op 42 dagen na de implantatie (P4A) en gescheiden in een single-cell suspensie (P5). Deze cellen werden vervolgens gekweekt in vitro, in aanwezigheid van puromycine aan een vervuilende carcinoom cellen en muis stromale cellen (P6) te elimineren. De resulterende puromycine-resistente cellen werden genoemd experimenteel gegenereerd CAF1 (exp-CAF1) cellen. Deze cellen, gereseceerd 42 dagen na de implantatie werden weer gemengd met MCF-7-ras-cellen en subcutaan geïmplanteerd in een muis gastheer als voorheen (P7a). De resulterende tumor werd toegestaan ​​om te groeien voor een periode van 200 dagen, dan ontleed, gedissocieerd, en gekweekt in de aanwezigheid van puromycine. De geïsoleerdepuromycine-resistente cellen werden genoemd exp-CaF2 cellen (242-dagen-oud). Bb) Om te bepalen cellen te isoleren tegen de exp-cafe's, GFP + R puro onsterfelijke, menselijke borstklieren fibroblasten werden subcutaan geïnjecteerd in een naakt muis als zuivere culturen zonder MCF-7-ras-cellen (P3b). De fibroblastische weefsel, ontleed 42 dagen post-implantatie (P4b), werd gedissocieerd in single-cell suspensies (P5) en puromycine-resistente cellen, genaamd controle fibroblast-1-cellen, werden geïsoleerd zoals eerder beschreven (P6). Deze fibroblasten werden opnieuw subcutaan geïmplanteerd in een muis zonder naakt MCF-7-ras-cellen bovendien gedurende 200 dagen (P7b). De fibroblastische weefsel werd ontleed, gedissocieerd, en gekweekt in de aanwezigheid van puromycine. De geïsoleerde puromycine-resistente cellen werden genoemd controle fibroblast-2 cellen (242-dagen-oud). <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3201/3201fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2 <strong exp-cafe en de controle fibroblasten afkomstig zijn uit ouderlijke menselijke borstklieren. immunofluorescentie analyses van fibroblast-2 f. exp-caf2 cellen. beide soorten cellen positief vlek voor mesenchymale markers inclusief vimentine prolyl-4-hydroxylase collageen fibronectine s100a4 fibroblast oppervlakte-eiwit.>(B) In tegenstelling, pan-cytokeratin, een marker voor epitheliale cellen , wordt niet gedetecteerd in exp-CaF2 cellen die GFP (groen). Celkernen zijn gekleurd met 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (blauw). Schaalbalk, 50 pm (verwezen Kojima et al.. 11) (C) Immunofluorescentie van exp-CaF2 cellen en controle fibroblast-2 cellen (controle F.) met behulp van antilichamen tegen α-SMA (rood) of tenascine-C (TN-C) (rood). Celkernen zijn gekleurd met DAPI (blauw). Schaalbalk, 50 pm. (D) 48% van de exp-CaF2 cellen positief vlek voor α-SMA, terwijl een4% van de 42-dagen-oude exp-CAF1 en 2,5% van de controle fibroblast-2 celpopulaties zijn positief voor α-SMA. (Hierna van Kojima et al.11)

<ol><li>Ronnov-Jessen, L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+by+proxy%3A+can+the+microenvironment+be+both+the+cause+and+consequence%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Breast cancer by proxy: can the microenvironment be both the cause and consequence?</a> Trends Mol. Med. 15, 5-13 (2009).</li>
<li>Mueller, M. M., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friends+or+foes+-+bipolar+effects+of+the+tumour+stroma+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 4, 839-849 (2004).</li>
<li>Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+fibroblasts+in+cancer+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression.</a> Nature. 432, 332-337 (2004).</li>
<li>Kalluri, R., Zeisberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).</li>
<li>De Wever, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tenascin-C+and+SF%2FHGF+produced+by+myofibroblasts+in+vitro+provide+convergent+pro-invasive+signals+to+human+colon+cancer+cells+through+RhoA+and+Rac%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Tenascin-C and SF/HGF produced by myofibroblasts in vitro provide convergent pro-invasive signals to human colon cancer cells through RhoA and Rac.</a> 18, 1016-1018 (2004).</li>
<li>Serini, G., Gabbiani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+myofibroblast+activity+and+phenotypic+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation.</a> Exp. Cell. Res. 250, 273-283 (1999).</li>
<li>Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinoma-associated+fibroblasts+are+a+rate-limiting+determinant+for+tumour+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression.</a> Semin. Cell. Dev. Biol. 21, 19-25 (2010).</li>
<li>Pietras, K., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+interactions+with+the+tumor+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma.</a> Exp. Cell. Res. 316, 1324-1331 (2010).</li>
<li>Polyak, K., Haviv, I., Campbell, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-evolution+of+tumor+cells+and+their+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Co-evolution of tumor cells and their microenvironment.</a> Trends in Genetics. 25, 30-38 (2009).</li>
<li>Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+associated+fibroblasts+in+cancer+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis.</a> Semin. Cell. Dev. Biol. 21, 33-39 (2010).</li>
<li>Kojima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine+TGF-beta+and+stromal+cell-derived+factor-1+%28SDF-1%29+signaling+drives+the+evolution+of+tumor-promoting+mammary+stromal+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 20009-20014 (2010).</li>
<li>Orimo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+fibroblasts+present+in+invasive+human+breast+carcinomas+promote+tumor+growth+and+angiogenesis+through+elevated+SDF-1%2FCXCL12+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion.</a> Cell. 121, 335-348 (2005).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Het ontbreken van CAF-specifieke markers en de mate van heterogeniteit waargenomen bij cafe&#39;s maken de karakterisering van dit celtype een uitdaging op zich. Studeren CAFS in vitro werd ook gehinderd door de extra complicatie dat deze cellen senesce en stoppen prolifererende wanneer gekweekt voor een lange periode. Onze vorige poging om direct vereeuwigen primaire CAFS met behulp van een retrovirale hTERT cDNA construct werd geen succes. Daarom, naar aanleiding van de tumor het bevorderen van eigenschappen ...

<table border="1"><tr><td> Materiaal Naam </td><td> Type </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Commentaar </td></tr><tr><td> DMEM </td><td></td><td> Invitrogen </td><td> 61965-026 </td><td></td></tr><tr><td> Foetaal kalf serum </td><td></td><td> GIBCO </td><td> 10270 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilline-streptomycine </td><td></td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase type I </td><td></td><td> Sigma </td><td> C0130-1G </td><td></td></tr><tr><td> hyaluronidase </td><td></td><td> Sigma </td><td> H4272 </td><td></td></tr><tr><td> Vimentine (V9) antilichaam </td><td></td><td> Novocastra Laboratories </td><td> NCL-L- VIM-V9 </td><td></td></tr><tr><td> Tenascin C (BC-8) antilichaam </td><td></td><td></td><td></td><td> een geschenk van Dr. <strong&gt; Luciano Zardi </td></tr><tr><td> α-SMA-Cy3 (1A4) antilichaam </td><td></td><td> Sigma </td><td> C6198 </td><td></td></tr><tr><td> Prolyl-4-hydroxylase </td><td></td><td> Dako </td><td> M0877 </td><td></td></tr><tr><td> (5B5) antilichaam </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Collageen type 1 1A antilichaam </td><td></td><td> Sigma </td><td> HPA011795 </td><td></td></tr><tr><td> Pan-cytokeratine antilichaam </td><td></td><td> Sigma </td><td> C5992 </td><td></td></tr><tr><td> Fibronectine antilichaam </td><td></td><td> BD Biosciences </td><td> 610077 </td><td></td></tr><tr><td> S100A4/FSP-1 (fibroblast- specifiek eiwit-1) antilichaam </td><td></td><td> Dako </td><td> A5114 </td><td></td></tr><tr><td> Fibroblast oppervlakte-eiwit (Kloon 1B10) antilichaam </td><td></td><td> Abcam </td><td> ab11333 </td><td></td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> MSCV-IRES-GFP construct </td><td></td><td></td><td></td><td> Verzoek aan de de auteurs </td></tr><tr><td> pBabe-puro te bouwen </td><td></td><td></td><td></td><td> Aankoop van Addgene </td></tr><tr><td> Puromycine </td><td></td><td> Sigma </td><td> P8833 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI </td><td></td><td> Sigma </td><td> D9564 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml conische buis </td><td></td><td> Corning </td><td> 430766 </td><td></td></tr><tr><td> Naakt muis </td><td></td><td> Taconic </td><td> NCRNU-F </td><td> Vrouwelijk naakt NCR </td></tr><tr><td> C3H/10T1/2 cellen </td><td></td><td> ATCC </td><td></td><td> CCL-226 </td></tr></table>

experimentele generatie van carcinoom-geassocieerde fibroblasten (cafe&#39;s) van human borst fibroblasten

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomen zijn complexe weefsels bestaan ​​van neoplastische cellen en een niet-kwaadaardige ruimte aangeduid als de &#39;stroma&#39;. Het stroma bestaat uit extracellulaire matrix (ECM) en een verscheidenheid van mesenchymale cellen, waaronder fibroblasten, myofibroblasten, endotheelcellen, pericyten en leukocyten 1-3. De tumor-geassocieerde stroma wordt ingespeeld op de aanzienlijke paracriene signalen uitgebracht door naburige carcinoom cellen. Tijdens het ziekteproces, het stroma wordt vaak bevolkt door carcinoma-geassocieerde fibroblasten (cafe&#39;s), inclusief een groot aantal myofibroblasten. Deze cellen zijn eerder verkregen uit veel verschillende soorten van de menselijke carcinomen voor hun in-vitro-cultuur. Een subpopulatie van cafe&#39;s is te onderscheiden door hun up-regulatie van α-gladde spiercel actine (α-SMA) expressie 4,5. Deze cellen zijn een kenmerk van &#39;geactiveerd fibroblasten&#39; die dezelfde eigenschappen delen met myofibroblasten commonly waargenomen in gewonden en fibrotische weefsels 6. De aanwezigheid van deze myofibroblastic CAF deelverzameling is sterk gerelateerd aan high-grade &#39;maligniteiten en geassocieerd met een slechte prognose bij patiënten. Veel laboratoria, inclusief onze eigen, hebben aangetoond dat de cafe&#39;s, bij injectie met een carcinoom cellen in immunodeficiënte muizen, zijn in staat om aanzienlijk te bevorderen tumorgenese 7-10. CAFS bereid uit carcinoom patiënten, echter, vaak ondergaan veroudering tijdens de voortplanting in de cultuur het beperken van de uitgebreidheid van hun gebruik in heel lopende experimenten. Om dit probleem, ontwikkelden we een nieuwe techniek om experimenteel te genereren onsterfelijke, menselijke borstklieren CAF cellijnen (exp-cafe&#39;s) uit humane fibroblasten borstklieren, met behulp van een coimplantation borsttumor xenograft model. Om de exp-cafe&#39;s, ouders menselijke fibroblasten borstklieren, verkregen uit de reductie mammoplasty weefsel te genereren, werden voor het eerst immortalised met hTERT, de katalytische subeenheid van het telomerase holoenzyme, en ontworpen om te uiten GFP en een puromycine resistentiegen. Deze cellen werden coimplanted met MCF-7 menselijke borstcarcinoom cellen die een geactiveerd ras-oncogen (MCF-7-ras-cellen) in een muis xenograft. Na een periode van incubatie in vivo, werden de aanvankelijk ingespoten mens borstklieren fibroblasten uit de tumor xenotransplantaten op basis van hun puromycine weerstand 11. Merkten we dat de bewoner menselijke fibroblasten borstklieren hebben gedifferentieerd, de aanneming van een myofibroblastic fenotype en tumor-bevorderende eigenschappen verworven in de loop van tumorprogressie. Belangrijk is dat deze cellen, gedefinieerd als exp-cafe&#39;s, op de voet na te bootsen van de tumor-bevorderende myofibroblastic fenotype van CAFS geïsoleerd van borstcarcinomen ontleed van patiënten. Onze tumor xenograft afgeleid exp-cafe&#39;s daarom voorzien in een effectief model om de biologie van CAFS studie in de mens breast carcinomen. De beschreven protocol kan ook worden uitgebreid voor het genereren en karakteriseren van de verschillende bevolkingsgroepen CAF afgeleid van andere vormen van menselijke carcinomen.

Carcinoom-geassocieerde fibroblasten (cafe&#39;s), rijk aan myofibroblasten aanwezig in de tumor stroma, spelen een belangrijke rol in het besturen van tumorprogressie. We ontwikkelden een coimplantation tumor xengraft model voor het genereren van experimenteel CAFS uit humane fibroblasten borstklieren. Het protocol beschrijft hoe om vast te stellen CAF myofibroblasten dat het vermogen om tumorgenese bevorderen verwerven.

Experimentele Generatie van Carcinoom-geassocieerde fibroblasten (cafe&#39;s) van Human Borst fibroblasten

Carcinomen zijn complexe weefsels die bestaan uit neoplastische cellen en een niet-kankerous compartiment, aangeduid als het 'stroma'. Het stroma bestaat uit ...

Deze video beschrijft een procedure om carcinoom-geassocieerde fibroblasten of CAF's te genereren uit primair gecultiveerde menselijke fibroblasten. Carcinomen zijn complexe weefsels bestaande uit neoplastische cellen en een niet-kankerous compartiment dat het stroma wordt genoemd. Het tumor-geassocieerde stroma bestaat uit extracellulaire matrix en een verscheidenheid aan stromale cellen, waaronder fibroblasten, myofibroblasten, endotheelcellen, pericyten en leukocyten; carcinoom-geassocieerde fibroblasten zijn rijk aan myofibroblasten, een kenmerk van geactiveerde fibroblasten die binnen de tumor aanwezig zijn.Stromale cellen spelen een belangrijke rol bij het stimuleren van tumorprogressie. Deze kunnen in vitro worden gegenereerd door eerst primaire humane mammaire fibroblasten te isoleren uit gezond borstweefsel verkregen via een reductiemammoplastiek. Het verkregen weefsel wordt gedissocieerd tot een enkelcellige suspensie, waarna het wordt geïmmortaliseerd door virale transductie en genetisch wordt gemodificeerd om GFP en een puramycine-resistentiegen tot expressie te brengen.De cellen worden vervolgens samen met menselijke borstcarcinoom MCF7-cellen subcutaan in een immuunde

experimental-generation-carcinoma-associated-fibroblasts-cafs-from

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Cancer Associated Fibroblasten (CAF) te vergemakkelijken tumorinitiatie, groei en progressie door te geven dat bevordert de proliferatie, angiogenese en ontsteking. Hier beschrijven we een methode om pure populaties van normale fibroblasten en CAF isoleren van verse muis en humane weefsels door celsortering, met PDGFRα als oppervlaktemerker.

Isolatie van normale en kankergeassocieerde fibroblasten van verse weefsels door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)

Hier presenteren we een protocol voor co-cultuur in drie dimensies, wat nuttig is voor het onderzoeken van interacties tussen meerdere cellen en het beïnvloeden van het gedrag van kankercellen door de extracellulaire matrix. In dit experimentele model worden kankercellen gekweekt op collageengels ingebed met humane kanker-geassocieerde fibroblasten.

Driedimensionale Co-cultuur Model voor Tumor-stromale Interactie

Fibroblastgedrag ligt ten grondslag aan een spectrum van klinische entiteiten, maar ze blijven slecht gekarakteriseerd, grotendeels vanwege hun inherente heterogeniteit. Traditioneel fibroblastenonderzoek is afhankelijk van in vitro manipulatie, waardoor in vivo fibroblastgedrag wordt gemaskeerd. We beschrijven een FACS-gebaseerd protocol voor de isolatie van muishuidfisbroblasten dat geen celcultuur vereist.

Muizen Dermaal Fibroblast Isolation door FACS

Het doel van dit protocol is om een 3D in vitro model te vestigen om de differentiatie van met kanker geassocieerde fibroblasten (CAFs) in een tumor bulk-achtige omgeving te bestuderen, die kan worden aangepakt in verschillende analysesystemen, zoals immunofluorescentie, transcriptionele analyse en Life Cell Imaging.

Een 3D-Spheroid-model als een fysiologisch systeem voor de differentiatie van kanker-geassocieerde fibroblasten en invasies in vitro studies

Het doel van deze methode is om fibroblast-afgeleide 3D-matrices te verkrijgen als een natuurlijke steiger voor volgende cellulaire assays. Fibroblasten worden in een voorbehandelde kweek plaat geseeid en gestimuleerd met ascorbinezuur voor matrix generatie. Matrices zijn decellularized en geblokkeerd voor de kweek van relevante cellen (bijv. endotheel cellen).

Fibroblast-afgeleid 3D-matrix systeem dat van toepassing is op endotheliale buis vorming assay

Een protocol om kankercellen en fibroblasten samen te injecteren en de tumorgroei in de loop van de tijd te volgen, wordt verstrekt. Dit protocol kan worden gebruikt om de moleculaire basis voor de rol van fibroblasten als regulatoren van tumorgroei te begrijpen.

Een muismodel om de rol van kanker-geassocieerde fibroblasten in tumorgroei te onderzoeken

Dit artikel heeft tot doel een protocol te bieden voor de isolatie en kweek van primaire kanker-geassocieerde fibroblasten uit een syngenetisch muizenmodel van triple-negatieve borstkanker en hun toepassing voor de preklinische studie van nieuwe nanodeeltjes die zijn ontworpen om zich te richten op de tumormicro-omgeving.

Isolatie van primaire kanker-geassocieerde fibroblasten uit een syngenetisch muizenmodel van borstkanker voor de studie van gerichte nanodeeltjes

Meercellige 3D-tumorsferoïden werden bereid met longadenocarcinoomcellen, fibroblasten en monocyten, gevolgd door de isolatie van kanker-geassocieerde fibroblasten (CAFs) uit deze sferoïden. Geïsoleerde CAFs werden vergeleken met normale fibroblasten om de mitochondriale gezondheid te beoordelen door het mitochondriale transmembraanpotentieel, reactieve zuurstofsoorten en enzymatische activiteiten te bestuderen.

Beoordeling van mitochondriale gezondheid in kankergeassocieerde fibroblasten geïsoleerd uit 3D meercellige longtumorenferoïden

Dit protocol schetst methoden voor het kweken, manipuleren en analyseren van muizen CAF's, inclusief in vitro/in vivo functionele assays, transcriptomics en computationele analyse. Bovendien beschrijft het een webgebaseerd platform dat is ontwikkeld om de openbaar beschikbare transcriptomen van laseropname van micro-ontlede stromale en epitheliale componenten uit een verzameling menselijke borstkankertumoren te analyseren.

Kanker-geassocieerde fibroblasten van borsttumoren bij muizen als hulpmiddelen voor moleculaire en computationele studies

Dit protocol biedt een uitgebreide procedure om fibroblasten te isoleren, uit te breiden en onsterfelijk te maken van radicale prostatectomieën. Bovendien beschrijft het tests die zijn ontwikkeld om de functionele effecten van overspraak tussen fibroblast en tumorcellen te beoordelen, waarbij gebruik wordt gemaakt van zowel behandeling met geconditioneerd medium als co-kweek.

Isolatie, kweek en karakterisering van prostaatkanker-geassocieerde fibroblasten

Dit protocol beschrijft een methode om kankerorganoïden, carcinoma-geassocieerde fibroblasten (AF's) en niet-tumor-geassocieerde fibroblasten (CF's) gelijktijdig te isoleren van dezelfde patiënt met slokdarmplaveiselcelcarcinoom (ESCC). Het gebruik van deze patiënt-gematchte materialen zou problemen door interpatibulaire variabiliteit kunnen voorkomen en een passend experimenteel platform bieden voor ESCC-onderzoek.

Vestiging van tumororganoïden, carcinoom-geassocieerde fibroblasten en tegenhangende fibroblasten van dezelfde slokdarmkankerpatiënt

Leer hoe u carcinoom-geassocieerde fibroblasten genereert uit humane borstfibroblasten met een co-implantatie tumorxenograftmodel. Deze methode maakt het mogelijk om de rol van myofibroblasten in tumorprogressie te bestuderen.

Experimentele Generatie van Carcinoom-geassocieerde fibroblasten (cafe's) van Human Borst fibroblasten

Meer video's verkennen