Beeldvorming van Oestrogeen Receptor-α in Rat Pial arteriolen met behulp van een Digital Microscope Immunofluorescente

Het algemene doel van deze procedure is om een eenvoudige techniek te beschrijven voor het optimaliseren van de kleuring en visualisatie van oestrogeenreceptor alfa met behulp van dwarsdoorsneden van peel-arteriën verkregen uit de hersenen van vrouwelijke ratten. Dit wordt bereikt door eerst met Evan's blue-kleurstof gemarkeerde peel-arteriën van het hersenoppervlak te verwijderen en deze na sectie met een cryostaat in ringen van acht micron te snijden. De dwarsdoorsneden worden op objectglazen gemonteerd en geïncubeerd met het primaire antilichaam tegen oestrogeenreceptor alfa.

Vervolgens worden de coupes geïncubeerd met het secundaire antilichaam en tegenkleuring met gebruik van monteermedia die dpi bevatten. Ten slotte worden de fluorescentiegelabelde segmenten van het peel-vat afgebeeld en omgezet in 2D-beelden met behulp van software voor uitgebreide scherpte diepte (extended depth focus). Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de oestrogeenreceptor alfa in de arteriolen van de peel tonen door gebruik te maken van een Nikon-immunofluorescentiemicroscoop met uitgebreide scherpte software.

Mijn naam is dr. Marguerite Littleton Kearney. Vandaag zal dr. Neil Farani, postdoctoraal onderzoeker in mijn laboratorium, een eenvoudige procedure demonstreren om de visualisatie en kleuring van oestrogene receptor alfa in peel te optimaliseren.

Dissekeer de arteriën uit een rattenbrein dat is geperfuseerd met Evans-blauw en bewaard is bij -70 °C. Identificeer met behulp van een dissectiemicroscoop de pialarteriën op het oppervlak van het brein en verwijder deze met fijne pincetten. Verwijder zorgvuldig elk aanhechtend hersenweefsel.

Plaats de arteriën in een klein reageerbuisje op ijs. Fixeer de arteriën gedurende 30 minuten in 2% koud formaldehyde in 0,1 M PBS. Om de arteriën voor te bereiden op het maken van coupes, wordt er inbeddingsmedium gegoten op een vriesplaat die is ingesteld op -20 °C.

Plaats een sectie van de slagader plat op het koelblok en wacht tot deze is bevroren. Zodra deze stevig is bevroren, plaatst u de slagader rechtop in het inbeddingsmedium op de vriesdisk van de cryostaat. Zorg ervoor dat de punt van de slagader naar voren is gericht.

Houd de arterie met een pincet vast tot deze volledig is ingevroren. Plaats de vriesplaat met de arterie in de kop van de cryostaat en snijd vervolgens arteriele ringen van acht micron dikte direct op een objectglas. Monteer de arteriele coupes op chroom-kaliumgelatine.

Strijk de coupes glad met twee penselen om de arteriële ringen recht te leggen. Bewaar de geprepareerde coupes in een objectglasdoosje in de koelkast bij 4 °C gedurende de nacht. Haal de coupes uit de koelkast en laat ze op het aanrecht komen tot kamertemperatuur.

Was de preparaten met 1 tot 1,5 milliliter 0,1 molair PBS. Laat het PBS na 10 minuten weglopen en herhaal dit nog twee keer. Incubeer de preparaten na de laatste PBS-was gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in één milliliter 50 millimolair ammoniumchloride. Om endogene fluorescentie te verminderen, worden de preparaten zoals eerder beschreven 3 keer gewassen in 0,1 molair PBS gedurende 10 minuten per wasbeurt. Blok vervolgens de preparaten gedurende 30 minuten in een PBS-oplossing met 0,1% Triton X 100 plus 1% normaal geiten serum om aspecifieke binding van het primaire antilichaam te verminderen.

Incubeer na het blokkeren de coupes met het primaire antilichaam tegen ER alpha, verdund tot een concentratie van 1:500 in de blokkeringsoplossing, gedurende de nacht bij 4 °C. Haal de coupes uit de koelkast en laat ze op kamertemperatuur komen. Was alle ongebonden primaire antilichamen weg met 1 tot 1,5 ml 0,1% PBS, 3 keer gedurende 10 minuten.

Incubeer de coupes telkens gedurende twee uur in het donker bij kamertemperatuur met Oregon Green, 4 88 secundaire anti-rabbit antilichamen in blokkeringsoplossing. Was de coupes na incubatie drie keer met 0,1 molair PBS, telkens 10 minuten per wasbeurt, en breng ze vervolgens naar een geventileerde zuurkast. Plaats een druppel monteermedium met DAP op de preparaten en plaats vervolgens een dekglas over het monster. Breng transparante nagellak aan om de randen van het dekglas af te dichten en laat dit volledig drogen.

Plaats de bereide preparaten met de gekleurde segmenten van het vaatweefsel onder de microscoop en stel deze in om de fluorescentie-gelabelde gebieden van belang te visualiseren. De visualisatie van de gekleurde ER alpha is de moeilijkste stap van deze procedure. Zoek het niveau van de doorsnede van het vat waar de receptoren het duidelijkst zichtbaar zijn.

Begin bij een vergroting van 100 keer en verhoog vervolgens de vergroting naar 600 keer. Gebruik de camera om beelden vast te leggen in de DPI- en ZI-kanalen voor respectievelijk celkernen en DR-alpha, en gebruik vervolgens software om meerdere aanzichten van vaatsegmenten om te zetten in 2D-beelden. Hier worden de resultaten van de immunofluorescente kleuring voor ER-alpha in het groen getoond, met tegenkleuring met DPI.

In blauw in een ring van een gepelde arterie, geïsoleerd uit een rattenbrein van een vrouwtje, suggereren de samengevoegde beelden de aanwezigheid van intranucleaire oestrogene receptor alfa. Door gebruik te maken van een combinatie van Z-stack beelden kan een gefocuste afbeelding van de ER alpha immunofluorescentie worden verkregen om rekening te houden met autofluorescentie; negatieve controles voor zowel het primaire als het secundaire antilichaam moeten worden uitgevoerd. Let op de duidelijke autofluorescentie langs de endotheliale zijde van een arterie die niet is geïncubeerd met het secundaire antilichaam.

Na het bekijken van deze video zou u inzicht hebben in hoe u arteriën uit het breinoppervlak kunt isoleren en pellen, en hoe u dwarsdoorsneden van acht micron dikke ringen kunt voorbereiden. Daarnaast zou u bekend moeten zijn met fluorescentie-gelabelde oestrogeenreceptor alfa en hoe u deze receptoren kunt visualiseren met behulp van een digitale immunofluorescentiemicroscoop en de bijbehorende software van Nikon.