Het visualiseren van Eiwitten en macromoleculaire complexen door Negative Stain EM: van Grid Voorbereiding op Image Acquisition

Het algemene doel van deze procedure is het visualiseren van gezuiverde eiwitmonsters via negatieve contrast elektronenmicroscopie. Dit wordt bereikt door eerst de elektronenmicroscopie-roosters voor te bereiden die het monster zullen ondersteunen. De tweede stap van de procedure is het bereiden van de negatieve contrastoplossing.

Vervolgens wordt het monster op het elektronenmicroscopieroster aangebracht en negatief gekleurd. Tot slot wordt het EM-rooster in een elektronenmicroscoop geladen en worden er beelden opgenomen onder passende optische omstandigheden. Conventionele brightfield DEM-beelden hebben een hoog contrast en zijn scherp gedetailleerd, waarbij individuele macromoleculen verspreid over een egale achtergrond te zien zijn.

Elektronenmicroscopie met negatieve contrastvleking is een eenvoudige methode om uw favoriete eiwit te visualiseren. Het kan worden gebruikt als routineonderzoek om uw gezuiverde eiwit te onderzoeken, zowel voor structurele analyse als voor andere biochemische en biofysische assays. Hier tonen we hoe u een negatief gevlekt monster voor elektronenmicroscopie voorbereidt.

Een visuele demonstratie van deze methode is nuttig, aangezien sommige stappen moeilijk aan te leren zijn aan de hand van tekstbeschrijvingen en figuren. Begin met het plaatsen van een enkele druppel collodium op het wateroppervlak in een groot bekerglas met water met behulp van een glazen pipette. Terwijl het collodium zich verspreidt, kan het stofdeeltjes van het wateroppervlak opvangen.

Verwijder een stoffige film van collodionplastic en vervang deze door een nieuwe druppel. Plaats vervolgens tussen de 50 en 100 EM-grids één voor één op de drijvende plastic film, met de glanzende kant naar beneden. Selecteer grids van 400 mesh voor routinematige negatieve kleuring en selecteer grids van 200 mesh.

Voor het verzamelen van tilt-paar afbeeldingen. Selecteer een stuk kreukvrij papier met een lage absorptiesnelheid dat iets groter is dan het oppervlak van de grids. Plaats het papier bovenop de grids en wacht tot het papier volledig nat is.

Het papier mag het water niet te snel absorberen. We gebruiken papier uit een goedkoop notitieblok. De roosters zijn nu ingeklemd tussen de plastic folie en het papier.

Gebruik een pincet om het papier in een Petrischaal te plaatsen om langzaam aan de lucht te drogen. Vermijd snellere droogmethoden, omdat deze tot rimpels kunnen leiden. De koolstofcoatingsmachine die in ons laboratorium wordt gebruikt, is een Creston 2 0 8 C high vacuum turbo carbon coer.

Uitgerust met een Creston-filmdiktemonitor. De monitor maakt gebruik van een kwartsbalans die gevoelig is voor koolstofafzettingen. Het hier beschreven protocol vereist dit apparaat echter niet. Begin met het slijpen en laden van de koolstofstaven in een koolstofcoatingmachine.

Breng vervolgens een laag aan op een objectglas met vacuümvet, waarbij de helft van het gematteerde gedeelte onbedekt blijft. Na het koolstof-coaten worden de ingevette regio's van het objectglas gebruikt om de dikte van de koolstoflaag te schatten. Plaats het papier met grids op de tafel onder de stolp van de koolstof-coatmachine. Positioneer het ingevette glas.

Schuif het object naast de roosters. Pomp de vacuümkamer op tot ten minste 10 micro tours, anders zal vonkvorming veel grote deeltjes in het rooster genereren. Verhoog nu de stroom zeer langzaam.

De scherpe punt van de koolstofstaaf zal extreem helder worden. Observeer dit niet met het blote oog terwijl de coating begint. De glazen dia zal van kleur veranderen naar donkergrijs naarmate de koolstoflaag zich opbouwt; onderbreek de stroom bij de gewenste koolstofdikte, rekening houdend met de transparantie van de stolp. Zodra de donkerte van de dia is gekalibreerd aan de koolstofdikte, is deze methode bij het maken van deze beoordeling net zo nauwkeurig als de duurdere filmdiktemonitor.

Wanneer het proces is voltooid, laat u de vacuümkamer ontluchten en verwijdert u de gecoate grids voor later gebruik. De dunne plastic laag heeft geen invloed op de kwaliteit van het negatief gekleurde beeld, maar kan worden verwijderd door de grids voor gebruik enkele uren in chloroform te weken. Maak een verse urin L-formaatoplossing of gebruik een oplossing die minder dan twee weken donker is bewaard.

Een goede verse oplossing heeft een gele kleur, een pH van rond de vier en vloeit zeer schoon zonder neerslag. Begin met het gebruik van een commercieel beschikbaar systeem om de koolstofgecoate grids te glow-dischargen.

Plaats vervolgens twee druppels van 20 µL gedestilleerd water en twee druppels van 25 µL verse uriniformaatoplossing op een stukje Parafilm. Houd met behulp van reverse force anti-capillaire pincetten een gloei-ontlaad rooster vast, met de koolstofgecoate zijde naar boven. Cruciaal is dat deze pincetten geen vloeistof uit de roosters wegzuigen.

Breng nu twee microliters van het eiwitmonster aan op het raster en wacht tot de eiwitten in het raster zijn geabsorbeerd. Dit duurt gewoonlijk 30 seconden, maar zeer verdunde monsters vereisen meer tijd, wat invloed kan hebben op de bufferconcentraties. Blot na afloop het eiwitmonster weg met filterpapier.

Was daarna het raster twee keer door het oppervlak kortstondig tegen een druppel water aan te tikken en het binnen enkele seconden droog te deppen. Nadat het water het raster kort heeft geraakt, herhaalt u dit met een druppel kleurstof en dept u het snel droog. Gebruik dezelfde techniek om het raster gedurende 20 seconden in contact te laten komen met een tweede druppel kleurstof.

Laat het raster tenslotte aan de lucht drogen in de zuurkast, of bij voorkeur in een vacuüm vóór de EM-sessie. Controleer de uitlijning van de elektronenmicroscoop door een geoptimaliseerd uitlijningsbestand te laden indien beschikbaar; dit zou de microscoop terugbrengen in een nagenoeg perfecte staat. Plaats nu het EM-raster in een standaard specimenhouder met enkele kanteling. Plaats vervolgens de houder in de objecttafel.

Wacht vervolgens tot de pompcyclus is voltooid en plaats de houder in de kolom. Begin nu met het zoeken naar een monstergebied met een goede kleuring. Stel handmatig scherp met de methode van minimaal contrast of door een CC, D-camera te gebruiken en de live four te berekenen.

Uw powerspectrum. Stel vervolgens de diepe focus in naar behoefte, meestal op negatief 1,5 micron. De concentratie van de kleuring kan variëren over het rooster, zoek daarom naar eiwitten met een wit contrast.

Vermijd gebieden met een ongelijkmatige kleuring of een positieve kleuring waarbij het eiwitcontrast zwart wordt. Gebruik de beschreven methode voor het maken van grids en het visualiseren van negatief gekleurde monsters. Verschillende bekende eiwitten zijn voor demonstratiedoeleinden afgebeeld.

Let op de details en het scherpe contrast. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u monsters van negatief gekleurde macromoleculen genereert voor observatie in een elektronenmicroscoop. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in ongeveer vier uur worden uitgevoerd.

Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals 3D-reconstructie, worden uitgevoerd om moleculaire structuren beter te begrijpen.