Het visualiseren van Eiwitten en macromoleculaire complexen door Negative Stain EM: van Grid Voorbereiding op Image Acquisition
December 22nd, 2011
Visualiseren eiwit monsters door negatieve kleuring elektronenmicroscopie (EM) is uitgegroeid tot een populaire structurele analyse-methode. Het is nuttig voor kwantitatieve structurele analyse, zoals het berekenen van een 3D-reconstructie van de moleculen wordt bestudeerd, en ook voor kwalitatieve onderzoek naar de kwaliteit van het eiwit preparaten. In dit artikel geven we gedetailleerde protocollen voor de voorbereiding van de EM roosters, het kleuren van de steekproef en visualiseren van het monster in een elektronenmicroscoop. Beginnende gebruikers kunnen eenvoudig de volgende protocollen en te benutten negatieve EM vlek als een routine-test, in aanvulling op andere biochemische testen, voor het evalueren van hun eiwit monsters.
Het algemene doel van deze procedure is om gezuiverde eiwitmonsters te visualiseren door middel van elektronenmicroscopie met negatieve kleuring. Dit wordt bereikt door eerst de roosters voor elektronenmicroscopie voor te bereiden die het monster zullen ondersteunen. De tweede stap van de procedure is het bereiden van de negatieve kleuringsoplossing.
Vervolgens wordt het monster aangebracht op het raster voor elektronenmicroscopie en negatief gekleurd. Ten slotte wordt het EM-raster in een elektronenmicroscoop geladen en worden afbeeldingen gemaakt onder geschikte optische omstandigheden. Conventionele helderveld, DEM-beelden zijn hoogcontrastig en scherp gedetailleerd, waarbij enkelvoudige macromoleculen verspreid over een egale achtergrond te zien zijn.
Elektronenmicroscopie met negatieve kleuring is een eenvoudige methode om uw favoriete eiwit te visualiseren. Het kan worden gebruikt als een routinematige test om uw gezuiverde eiwit te onderzoeken, hetzij voor structurele analyse of andere biochemische en biofysische tests. Hier laten we zien hoe u een negatief gekleurd monster voor elektronenmicroscopie kunt bereiden.
Visuele demonstratie van deze methode is nuttig omdat sommige van de stappen moeilijk te leren zijn uit tekstbeschrijvingen en figuren. Begin met een glazen pipet om een enkele druppel collodion in een grote beker met water op het wateroppervlak te plaatsen. Terwijl het collodion zich verspreidt, kan het stof van het wateroppervlak opvangen.
Verwijder en vervang een stoffige film van collodion plastic door een andere druppel. Plaats vervolgens tussen de 50 en 100 EM-rasters één voor één op de drijvende plastic film, met de glanzende kant naar beneden. Selecteer 400 mesh rasters voor routinematige negatieve kleuring en selecteer 200 mesh rasters.
Voor het verzamelen van kantelingspaarbeelden. Selecteer een stuk langzaam absorberend, ongerimpeld papier dat iets groter is dan het gebied van de rasters. Plaats het papier bovenop de rasters en wacht tot het papier volledig nat is geworden.
Het papier mag niet te snel water opnemen. We gebruiken papier van een goedkope notitieboek. De rasters zijn nu ingeklemd tussen de plastic film en het papier.
Gebruik een paar pincetten om het papier in een petrischaal te plaatsen om langzaam aan de lucht te drogen. Vermijd snellere droogmethoden, omdat deze tot rimpels kunnen leiden. De koolstofcoatingmachine die in ons laboratorium wordt gebruikt, is een Creston 2 0 8 C hoge vacuüm turbo koolstof coater.
Uitgerust met een Creston filmdiktemonitor. De monitor maakt gebruik van een kwartsbalans die gevoelig is voor koolstofafzettingen. Het hier beschreven protocol vereist dit apparaat echter niet. Begin met het scherpen en laden van de koolstofstaven in een koolstofcoatingmachine.
Coateer vervolgens een glasplaat met vacuümvet en laat de helft van het ontijsterde gebied onbedekt. Na koolstofcoating worden de ingevette gebieden van de schuif gebruikt om de dikte van de koolstoflaag te schatten. Plaats het papier met rasters op het podium onder de klokkenpot van de koolstofcoatingmachine. Plaats de ingevette glasplaat.
Schuif volgende naast de rasters. Pomp de vacuümkamer op tot ten minste 10 microtours, anders zal ontlading veel grote deeltjes in het raster veroorzaken. Verhoog nu de stroom zeer langzaam.
De scherpe punt van de koolstofstang wordt extreem helder. Observeer het niet met het blote oog, aangezien het coaten begint, zal de glasplaat van kleur veranderen in een donker grijs naarmate de koolstoflaag zich opbouwt, schakel de stroom uit bij de gewenste koolstofdichtheid en houd rekening met de transparantie van de klokkenpot. Wanneer u deze beoordeling maakt, zodra de donkerheid van de schuif is gekalibreerd op de koolstofdruk, is deze methode net zo nauwkeurig als de duurdere filmdiktemonitor.
Wanneer het proces is voltooid, laat de vacuümkamer uitlopen en verwijder de gecoate rasters voor later gebruik. De dunne plastic laag heeft geen invloed op de kwaliteit van het negatief gekleurde beeld, maar kan worden verwijderd door de rasters enkele uren in chloroform te weken. Voordat u verdergaat. Maak verse urin L-formaat oplossing of gebruik een oplossing die minder dan twee weken in het donker is bewaard.
Goede verse oplossing heeft een gele kleur, een pH van ongeveer vier en loopt zeer schoon zonder neerslag. Begin met het gebruik van een commercieel verkrijgbaar systeem om te gloeien. Ontlaad de koolstofgecoate rasters.
Plaats vervolgens twee druppels van 20 microliter gedestilleerd water en 2 25 microliter verse urinalformaat oplossing op een stuk perfil. Gebruik omgekeerde krachtanti capillaire krachtpincetten om een gloeiontlaad raster vast te houden, koolstofgecoate kant omhoog. Cruciaal is dat deze pincetten geen vloeistof uit de rasters sifoneren.
Breng nu twee microliter eiwitmonster aan op het raster en wacht terwijl de eiwitten in het raster worden opgenomen. Dit duurt meestal 30 seconden, maar zeer verdunde monsters vereisen meer tijd, wat het effect kan hebben op bufferconcentraties. Wanneer u klaar bent, veeg het eiwitmonster af met filterpapier.
Was vervolgens het raster twee keer door het oppervlak kort in contact te brengen met een druppel water en het binnen enkele seconden droog te deppen. Nadat het water kort in contact was met het raster, brengt u het snel op een druppel kleur en depp het droog. Gebruik dezelfde techniek en laat het raster 20 seconden in contact met een tweede druppel kleur.
Laat het raster uiteindelijk aan de lucht drogen op de afzuigkap, of bij voorkeur in een vacuüm voor de EM-sessie, controleer de uitlijning van de EM-microscoop door een geperfectioneerde uitlijningsbestand te laden indien beschikbaar, zou het moeten herstellen tot bijna perfecte staat. Laad nu het EM-raster op een enkele kantelas houder. Plaats vervolgens de houder in het podium.
Wacht vervolgens tot de pompcyclus is voltooid en plaats de houder in de kolom. Begin nu met
Overzicht
Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor het visualiseren van gezuiverde eiwitmonsters met behulp van negatieve kleuring elektronenmicroscopie (EM). De methode is toegankelijk voor beginnende gebruikers en dient als een routinematige assay voor structurele analyse van eiwitten.
Belangrijke Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Structurele Biologie
- Elektronenmicroscopie
- Eiwitanalyse
Achtergrond
- Negatieve kleuring EM is een veel gebruikte techniek voor het visualiseren van eiwitten.
- Het maakt zowel kwalitatieve als kwantitatieve structurele analyse mogelijk.
- Protocollen voor monstervoorbereiding en visualisatie zijn essentieel voor succesvolle toepassing.
- Deze methode kan het begrip van eiwitstructuren verbeteren.
Doel van het Onderzoek
- Om een uitgebreide gids te bieden voor het voorbereiden van EM roosters en het kleuren van monsters.
- Om de visualisatie van eiwitten met negatieve kleuring EM te demonstreren.
- Om het routinematige gebruik van deze methode in eiwitanalyse te faciliteren.
Gebruikte Methoden
- Voorbereiding van elektronenmicroscoop roosters.
- Toepassing van negatieve kleuring oplossing op eiwitmonsters.
- Visualisatie van monsters in een elektronenmicroscoop.
- Opname van beelden onder optimale omstandigheden.
Belangrijkste Resultaten
- Hoge contrast afbeeldingen van eiwitten werden verkregen.
- Gedetailleerde protocollen werden succesvol gedemonstreerd.
- Visuele hulpmiddelen versterkten het begrip van complexe stappen.
- Resultaten ondersteunen het gebruik van negatieve kleuring EM voor routine eiwitanalyse.
Conclusies
- Negatieve kleuring EM is een effectieve methode voor eiwitvisualisatie.
- De verstrekte protocollen kunnen gemakkelijk worden gevolgd door beginnende gebruikers.
- Deze techniek kan andere biochemische assays aanvullen.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Negative stain electron microscopy (EM) provides rapid, high-contrast visualization of purified proteins and macromolecular complexes, enabling early-stage assessment of sample quality and assembly state. This technique supports critical go/no-go decisions in discovery pipelines by confirming sample homogeneity and complex formation before resource-intensive downstream studies. Its accessibility and reproducibility make it a foundational tool for structural biology teams in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of protein complexes to confirm assembly and integrity.
- Supports rapid assessment of sample homogeneity, reducing ambiguity in target validation.
- Facilitates early detection of aggregation or degradation, de-risking downstream workflows.
- Provides visual evidence to support mechanistic hypotheses in target selection.
Screening & Assay Development
- Validates the quality of protein preparations prior to high-throughput screening or assay development.
- Ensures reproducibility and standardization of sample inputs for quantitative assays.
- Enables scalable preparation of validated EM grids for repeated use in screening campaigns.
- Supports reliable evaluation of compound effects on protein structure or assembly.
Translational & Preclinical Research
- Confirms structural integrity of therapeutic candidates prior to preclinical studies.
- Aligns visual data with biochemical and biophysical assays for translational continuity.
- Reduces risk of advancing structurally compromised candidates into preclinical models.
- Provides foundational data for subsequent 3D reconstruction and mechanistic studies.
Pipeline & Workflow Integration
Negative stain EM is positioned at the interface of protein purification and structural or functional characterization, bridging early discovery and preclinical research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing protein complexes and assemblies.
- Screening: Confirms sample quality and reproducibility for downstream assays.
- Analytics: Provides high-contrast images for quantitative assessment of sample homogeneity and aggregation.
- Translational Research: Ensures structural fidelity of candidates entering preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, routine assay adaptable across diverse protein targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in sample quality and target validation.
- Operational Value: Delivers rapid, reproducible, and scalable visualization workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in EM grid preparation and instrument operation.
- Needs access to electron microscopy infrastructure and staining reagents.
- Demands cross-team standardization for reproducible sample preparation and imaging.
- Adaptable to a wide range of protein sizes and complex types.
- Limited to surface visualization; not suitable for high-resolution internal structure analysis.
