Efficiënte Afleiding van de Mens Neuronale voorouders en neuronen van pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie
28 oktober 2011
We hebben een protocol voor de inductie van neuroblasts rechtstreeks van pluripotente menselijke embryonale stamcellen gehouden onder bepaalde voorwaarden met kleine moleculen, die afleiding van een groot aanbod van menselijke neurale voorouders en neuronale celtypes in het ontwikkelen van CNS voor neurale reparatie mogelijk maakt.
Het algemene doel van het volgende experiment is om neuronaal nageslacht direct en exclusief af te leiden van pluripotente menselijke embryonale stamcellen met behulp van kleine molecuulinductie. Dit wordt bereikt door rettino zuur toe te voegen aan ongedifferentieerde cellen die onder gedefinieerde omstandigheden worden gehouden. Vervolgens wordt het differentiatieproces voortgezet door cellen los te maken in een suspensiecultuur waar ze zwevende cellulaire clusters vormen, neuroblasten genaamd.
Als neuroblasten worden toegestaan om zich te hechten aan een weefselkweekplaat in neuro differentiatie media, ontwikkelen ze kenmerken van volwassen neuronen. Uiteindelijk kunnen immunofluorescentie en deconvolutie of confocale microscopie worden gebruikt om het effect van rettino zuurbehandeling in morfologie en markerexpressie van behandelde menselijke embryonale stamcellen te tonen. In andere technieken volgt slechts een klein deel van de cellen een neuronaal fenotype, terwijl onze methode een goed gecontroleerde efficiënte inductie van pluripotente menselijke embryonale stamcellen exclusief naar een neuronale lijn mogelijk maakt door eenvoudige aanvoer van kleine moleculen.
Er zijn een paar stappen waarbij voorzichtig moet worden omgegaan bij het repareren van stockoplossingen. Zorg ervoor dat matrigel en humaan laminine langzaam worden ontdooid van min 80 graden Celsius tot vier graden Celsius overnacht. Bewaar media bij vier graden Celsius en verwarm het media altijd op tot 37 graden Celsius voor gebruik. Ook, bij het bereiden van humaan ESL-media, worden sommige supplementen pas toegevoegd net voordat het wordt gebruikt.
Deze omvatten BFGF, ascorbinezuur, humaan insuline actief in A en transferrine. Maak vervolgens de matra gel of humaan laminine werkoplossingen onmiddellijk voor het coaten van platen. Incubeer de platen bij 37 graden SIUs in 5% koolstofdioxide. Nadat de vooraf met gelatine beklede weefselkweekplaten zijn voorbereid.
De gelatine kan worden vervangen door de matrigel of laminine werkoplossing. Bekleed deze platen door ze een nacht in te couveer bij vier graden Celsius. Begin met het laten groeien van humaan ES-celkolonies gedurende vijf tot zeven dagen en bereid vervolgens voor op splitsing.
Selecteer enkele van hen. Kolonies met meer dan 75% onderdifferentieerde humaan ES-cellen, ze zijn meestal licht opaak met duidelijke randen. Kolonies met opgestapelde cellen. Een indicatie van het begin van differentiatie zijn meestal witte kolonies met meestal gedifferentieerde cellen die meestal helder zijn. Selecteer geen witte of heldere kolonies.
Houd de platen tegen het licht en gebruik een marker om de licht opaake kolonies op de bodem van de platen langs de contouren te omlijnen. Gebruik de rand van een steriele P twee pipettentip om de omringende fibroblastenlaag van de humaan ES-celkolonie los te maken. Verwijder vervolgens de omringende fibroblastencellen en verwijder ook alle gedifferentieerde delen van de kolonie.
Asptereer nu het oude media met de losgemaakte gedifferentieerde cellen weg. Was vervolgens in elke put de ongedifferentieerde cellen eenmaal met humaan E es celmedia zonder BFGF en voeg vervolgens drie milliliter vers humaan ESL media met B-F-G-F-B-F-G-F toe aan het verse media direct voor gebruik. Gebruik nu een steriele P twee pipettentip om de kolonies in kleine stukken te snijden en ze los te maken van de plaat.
Trek de losgemaakte koloniestukjes in hun media in een 50 milliliter kegelbuis. Trek er nog een bij. Milliliter media spoel per put.
De cellen zijn nu klaar voor verdere differentiatie met kleine moleculen. Begin met het verwarmen van vers gecoate platen tot 37 graden Celsius. Asptereer de coatingoplossing van de platen en voeg een vier milliliter afgifte van media met koloniestukjes toe aan elke put en draag vervolgens de platen voorzichtig over naar een incubator zonder ze te schudden.
Verstoor de platen niet zodat ze kunnen ontkiemen. Na drie dagen ontkiemen, maak nieuw media met omic zuur. Verwijder vervolgens het meeste oude media, waarbij genoeg media overblijft zodat de cellen ondergedompeld blijven.
De cellen mogen nooit drogen in elke. Put. Voeg vier milliliter vers humaan ES-celmedia met BFGF en rettino zuur toe. Vervang het media om de dag en laat rettino zuurbehandelde humaan ES-celkolonies groeien.
Na zeven of acht dagen zullen de cellen morfologische veranderingen hebben ondergaan in grote gedifferentieerde cellen. Ga vervolgens verder met het maken van een suspensiecelcultuur om een suspensiecultuur te maken. Begin met het losmaken van ESL-kolonies van cellen die spontaan zijn gedifferentieerd en zijn gemigreerd om een fibroblastenlaag te vormen. Gebruik de eerder genoemde techniek met een steriele pipettentip en asptereer het oude media met zwevende losgemaakte fibroblastencellen weg.
Was de cellen eenmaal met HESC-media en suspendeer ze opnieuw in drie milliliter HESC-media. Gebruik nu een steriele P twee pipettentip. Snijd de kolonies in kleine stukken en los ze van de plaat.
Trek het media met losgemaakte kolonies in een enkele 50 milliliter kegelbuis. Spoel de putten met één milliliter media en voeg het spoelmiddel toe aan het zwembad. Deel vervolgens vier milliliter van de gepoolde cellen in elke put van een zes putten ultra-lage hechtingsplaat gedurende vier tot vijf dagen. Houd de plaat in een incubator.
Gedurende deze tijd zullen zwevende cellulaire clusters of neuroblasten zich vormen om de neuroblasten verder te brengen naar een meer volwassen neuronaal fenotype. Trek het media met hen in een 50 milliliter kegelbuis. Centrifugeer vervolgens de cellen bij 1.400 RPM gedurende vijf minuten.
Asptereer, weeg zoveel mogelijk oud media af en voeg een gelijke hoeveelheid vers NSC-media met VEGF N NT drie en BDNF toe. Meng de cellen in een suspensie door te pipetten en deel vervolgens vier milliliter van de suspensie per put in zes. Wel weefselkweekplaten. Breng de platen over naar een bevochtigde incubator van 37 graden Celsius.
De neuroblasten zullen zich overnacht hechten aan de kweekplaten voor een 3D-cultuur bij Matrigel of humaan laminaat naar de neuroblastensuspensie. En een 3D-matrix zal polymeriseren bij 37 graden Celsius. Vervang het media om de dag.</
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor het direct afleiden van neuroblasten uit pluripotente menselijke embryonale stamcellen met behulp van inductie door kleine moleculen. De methode maakt een efficiënte generatie van neuronale progenitoren en diverse neuronale celtypen mogelijk voor potentiële toepassingen bij neuraal herstel.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschap
- Stamcelbiologie
- Celdifferentiatie
Achtergrond
- Pluripotente humane embryonale stamcellen kunnen differentiëren naar verschillende celtypen.
- Kleine moleculen kunnen differentiatie naar een neuronaire lijn effectief induceren.
- Efficiënte generatie van neuronaire cellen is cruciaal voor neuraal herstel.
- Traditionele methoden leveren vaak lage fracties neuronaire fenotypes op.
Doel van de studie
- Om een betrouwbaar protocol vast te stellen voor het induceren van neuroblasten uit menselijke embryonale stamcellen.
- Om de efficiëntie van neuronale differentiatie te verhogen met behulp van kleine moleculen.
- Om een methode te bieden voor het genereren van een grote voorraad neuronale progenitoren.
Gebruikte methoden
- Inductie van neuroblasten door toevoeging van retinoïnezuur.
- Suspensiecultuur voor de vorming van zwevende cellulaire clusters.
- Immunofluorescentie en microscopie om differentiatie te beoordelen.
- Zorgvuldige bereiding van media en kweekcondities om celgroei te ondersteunen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle inductie van neuroblasten uit menselijke embryonale stamcellen.
- Vorming van mature neuronen met kenmerkende morfologische eigenschappen.
- Hoge efficiëntie bij het genereren van neuronale progenitoren in vergelijking met traditionele methoden.
- Aantoonbaar potentieel voor toepassingen bij neuraal herstel.
Conclusies
- Het gevestigde protocol biedt een robuuste methode voor neuronale differentiatie.
- Kleine moleculen kunnen pluripotente stamcellen effectief sturen naar een neuronale lijn.
- Deze benadering kan bijdragen aan vooruitgang in de regeneratieve geneeskunde voor neurale letsels.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
De efficiënte en gecontroleerde afleiding van menselijke neuronale progenitorcellen uit pluripotente stamcellen pakt een kritieke flessenhals aan in vroege drug discovery voor het centrale zenuwstelsel en regeneratief onderzoek. Dit protocol, gestuurd door kleine moleculen, maakt schaalbare en reproduceerbare generatie van lijngebonden neuronale cellen mogelijk, waardoor heterogeniteit en mechanische ambiguïteit in de fase van targetvalidatie worden verminderd. Deze benadering ondersteunt het voorspellend vertrouwen en de continuïteit van discovery tot de ontwikkeling van preklinische modellen voor neurotherapeutische portfolio's.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt directe analyse mogelijk van de neuronale lijnkeuze vanuit pluripotente cellen.
- Vermindert biologische risico's door off-target differentiatie en fenotypische heterogeniteit te minimaliseren.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie in ziekterelateerde neuronale systemen.
- Faciliteert mechanistische risicovermindering voor therapeutische hypothesen gericht op het centraal zenuwstelsel.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt een gestandaardiseerde, schaalbare bron van menselijke neuronale progenitorcellen voor assay-platforms.
- Verbetert de reproduceerbaarheid en de kwantitatieve output in assays voor neuronale differentiatie.
- Maakt een betrouwbare preparatie van cellen mogelijk voor compound-screening en fenotypische evaluatie.
- Ondersteunt het hergebruik van het platform in meerdere neurobiologische projecten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Stelt in vitro neuronale modellen af op ontwikkelings- en ziekte-relevante fenotypes.
- Maakt continuïteit mogelijk van differentiatie in de ontdekkingsfase tot preklinische validatiestudies.
- Ondersteunt de risico-gecorrigeerde voortgang van neuroregeneratieve en neuroprotectieve kandidaten.
- Biedt een basis voor translationeel onderzoek naar biomarkers in CNS-onderzoek.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol integreert de overgang tussen vroege ontdekking en de ontwikkeling van preklinische modellen, waardoor een directe voortgang mogelijk is van het onderhoud van pluripotente stamcellen naar lineage-gecommitteerde neuronale systemen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door gecontroleerde neuronale differentiatie mogelijk te maken.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve neuronale resultaten voor de ontwikkeling van downstream-assays.
- Analytics: Faciliteert de meting van neuronale markerexpressie en morfologische veranderingen voor comparatieve analyse.
- Translationeel onderzoek: Biedt ziekterelateerde neuronale populaties voor preklinische continuïteit.
- Enterprise-hergebruik: Vestigt een herbruikbare, gedefinieerde workflow voor het genereren van neuronale cellen binnen CNS-onderzoeksprogramma's.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij neuronale differentiatie.
- Operationele waarde: Standaardiseert en schaalt de productie van neuronale cellen voor R&D-workflows.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen en de kapitaalefficiëntie in neurotherapeutische pijplijnen.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van CNS-ontdekkingsactiva mogelijk.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in pluripotent stamcelkweek en neuronale differentiatieprotocollen.
- Vereist toegang tot gedefinieerde media, small-molecule reagentia en geavanceerde beeldvormingsinfrastructuur.
- Noodzaak van strikte standaardisatie tussen teams voor reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid van gegevens.
- Aanpassing kan nodig zijn voor verschillende pluripotente cellijnen of ziektemodellen.
- Strikte biosafety- en kwaliteitscontrolyemaatregelen zijn essentieel voor het werken met menselijke cellen.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
1:27
Media Preparation and Plate Coating
2:33
Passaging and Seeding Undifferentiated Human ES Cells
4:31
Neural Induction in Adhesive Culture with Retinoic Acid
5:42
Differentiation in Suspension Culture and Maturation to Neuronal Phenotype after Attachment
8:08
Direct Neuronal Differentiation of Feeder- and Serum- Free Pluripotent Human ES Cells WIth Retinoic Acid Induction
10:11
Conclusion
