Name: Efficiënte Afleiding van de Mens Cardiac precursoren en cardiomyocyten uit pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Leer hoe je cardioblasten afleidt uit menselijke embryonale stamcellen met nicotinamide-inductie. Deze methode genereert functionele cardiomyocyten voor cardiovasculair onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

XHP werd ondersteund door National Institute of Health (NIH) subsidies van National Institute on Aging (NIHK01AG024496) en The Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NIHR21HD056530).

1. Solution en Media Voorbereiding <ol><li> Gelatine coating oplossing: 0,1% (w / v) gelatine in DDH 2 O, geautoclaveerd en bewaar bij 4 ° C. </li><li> Matrigel coating oplossingen. Stock oplossing: slow dooi Matrigel (10 ml) bij 4 ° C gedurende de nacht, 10 ml ijskoude DMEM of DMEM/F12 toe te voegen, goed mengen en aliquot 1 ml / tube onder gesteriliseerd weefselkweek kap, bewaren bij -20 ° C. Werkende oplossing: slow ontdooien 1 ml Matrigel aliquot bij 4 ° C gedurende 1-2 uur, transfer naar 14 ml gekoelde DMEM of DMEM/F12 en goed onder gesteriliseerd weefselkweek kap onmiddellijk mix voor het coaten. </li><li> Human laminine coating oplossing: verdun 1 ml menselijke laminine-oplossing (0,5 mg / ml in Tris gebufferd NaCl, bewaren bij -80 ° C, langzame dooi bij 4 ° C gedurende 1-2 uur) met ijskoude DMEM of DMEM/F12 aan 12,5 ml werkoplossing (40 ug / ml) onder gesteriliseerde weefselkweek kap direct voor coating. </li><li> Groeifactor voorraad oplossingen (500-1000X): los groeifactor bij 10 ug/ Ml in gesteriliseerde buffer (0,5% BSA, 1,0 mM DTT, 10% glycerol, 1XPBS) en op te slaan als 50 tot 100 ul / tube aliquots bij -80 ° C. </li><li> MES-media: DMEM/F12 of KO-DMEM (80%), KO serum vervanging (20%), L-alanyl-L-GLN of L-GLN (2 mM), MEM niet-essentiële aminozuren (MNAA, 1X), en β-mercapto-ethanol (100 uM), gefilterd en opgeslagen bij 4 ° C, aangevuld met 20 ng / ml bFGF voor gebruik. Of vervanging van "KO serum vervanging" met gedefinieerde componenten: DMEM/F12 of KO-DMEM (100%), L-alanyl-L-GLN of L-GLN (2 mM), MNAA (1x), MEM essentiële aminozuren (MEAA , 1X) en β-mercapto-ethanol (100 uM), gefiltreerd en bewaar bij 4 ° C, aangevuld met bFGF (20 ng / ml), humane insuline (20 ug / ml), ascorbinezuur (50 ug / ml), de menselijke activine A (50 ng / ml), humaan albumine / Albumax (10 mg / ml), en de menselijke transferrine (8 ug / ml) voor gebruik. </li><li> MES-cardiale differentiatie media: DMEM/F12 (90%), gedefinieerd FBS (10%) en L-alanyl-L-GLN of L-GLN (2 mm). </li><li> Media met nicotinamide (NAM): toe te voegen NUur tot MES-media of MES-cardiale differentiatie media aan de uiteindelijke concentratie van 10 mM, gefilterd, bewaren bij 4 ° C en gebruik binnen 2 weken van voorbereiding. </li></ol> 2. Plaat Coating <ol><li> Coat platen met gelatine: voeg 2,5 ml / putje van gelatine oplossing voor de 6 goed platen en overnacht in een 37 ° C bevochtigde incubator uitbroeden. </li><li> Coat platen met laminin: chill gelatine-gecoate platen en verwijderen gelatine, voeg 2,5 ml / putje Matrigel of menselijke laminine coating werkende oplossing voor pre-gekoelde 6-well platen en incubeer ontsloten bij 4 ° C gedurende de nacht. </li></ol> 3. Passage en Seeding Ongedifferentieerde hESC 's onder bepaalde omstandigheden <ol><li> Laat hESC kolonies groeien tot 5-7 dagen oud, en neem hESC cultuur plaat te ontleden microscoop (pre-warm ontleden etappe naar 37 ° C) onder ontleden gesteriliseerd kap. </li><li> Selecteer hESC kolonies te worden gesplitst. Morfologisch, moeten deze kolonies hebben&gt; 75% ongedifferentieerd hESC 's (smalle compacte cellen), meestal enigszins ondoorzichtige (geen witte-opgestapelde cellen, niet duidelijk-gedifferentieerde cellen) met gedefinieerde rand onder de microscoop te ontleden. Zorgvuldig een overzicht van de geselecteerde kolonies en verwijder gedifferentieerde fibroblasten laag rond de kolonie en alle gedifferentieerde onderdelen (indien aanwezig) van de kolonie met de rand van P2 steriele pipet tip of getrokken glas capillair. </li><li> Verwijder de oude media die drijvende vrijstaande gedifferentieerde cellen door aspireren. Wassen met hESC media (zonder bFGF) een keer. Voeg 3 ml / putje verse hESC media met 20 ng / ml bFGF. </li><li> Snijd de ongedifferentieerde hESC kolonies in kleine stukjes, en maak met een steriele pipet tip of getrokken glas capillair. </li><li> Het zwembad van het medium met vrijstaande kolonie stukken samen in een 50 ml conische buis. Ze wast de plaat met 1 ml / putje hESC media die 20 ng / ml bFGF en het zwembad bij elkaar. </li><li> Zuig het Matrigel of de menselijke laminine-oplossing uit de gecoate verse platen. Aliquot 4 ml / h goedESC media die kolonie stukken tot een 6-wells plaat. Voorzichtig dragen de plaat incubator zonder schudden en laat kolonie stukken zaad 's nachts, zonder te storen in een vochtige 37 ° C incubator met een atmosfeer van 5% CO 2. </li></ol> 4. Cardiale Inductie van hESC 's onder gedefinieerde Culture systeem met Nicotinamide <ol><li> Op dag 3 na het uitzaaien, verwijder dan de meeste van de oude media uit elk putje van de plaat en laat genoeg media om hESC kolonies te worden ondergedompeld (nooit toestaan ​​dat hESC 's uit te drogen). Te vervangen met 4 ml / putje verse hESC media met 20 ng / ml bFGF en 10 mM nicotinamide (NAM). </li><li> Vervang de oude media met verse hESC media met 20 ng / ml bFGF en 10 mM NAM om de andere dag, en laat cardiale-geïnduceerde hESC kolonies groeien dagen 8-10. Bij het bloot te stellen aan NAM, zullen alle cellen binnen de kolonie ondergaan morfologie verandert in grote gedifferentieerde cellen die zal zich blijven vermenigvuldigen. De kolonies zal toenemen in omvang, en door de dag 8-10, eend cellen zal beginnen op te stapelen in sommige gebieden van de kolonies. </li></ol> 5. Voortzetting van Cardiac Differentiatie in suspensie Cultuur <ol><li> Neem hESC cultuur plaat te ontleden microscoop (pre-warm ontleden etappe naar 37 ° C) onder ontleden gesteriliseerd kap. Voorzichtig een overzicht van de koloniën en verwijder fibroblast laag rond de kolonie (gedifferentieerde cellen migreerden uit de kolonie) met de rand van de P2 steriele pipet tip of getrokken glas capillair. </li><li> Verwijder de oude media die drijvende vrijstaande fibroblast cellen door aspireren. Wassen met hESC media (zonder bFGF) een keer. Voeg 3 ml / putje verse hESC media (zonder bFGF). </li><li> Snijd de cardiale-geïnduceerde hESC kolonies in kleine stukjes, en maak met een steriele pipet tip of getrokken glas capillair. </li><li> Het zwembad van het medium met vrijstaande kolonie stukken samen in een 50 ml conische buis. Ze wast de plaat met 1 ml / putje hESC media (zonder bFGF) en het zwembad bij elkaar. </li><li> Aliquot 4 ml / goed serumvrij hESC media die kolonie stukken tot een 6-well Ultra-bevestigingsplaat en incuberen in een 37 ° C bevochtigde incubator te laten zweven cellulaire clusters (cardioblasts) te vormen voor de 4-5 dagen. </li></ol> 6. Beating Cardiomyocyte Fenotype rijping in Adhesive Cultuur <ol><li> Het zwembad van het media die drijvende cardioblasts samen in een 50 ml conische buis. Centrifugeer bij 1400 rpm gedurende 5 minuten. Aspireren van de oude media zo veel als je kunt en toevoegen gelijke hoeveelheid verse hESC cardiale differentiatie media met 10 mM NAM. </li><li> Pipet op en neer aan drijvende cardioblasts en aliquot mix 4 ml / goed op 6-well platen. Overdracht van de platen om een ​​37 ° C bevochtigde incubator om cardioblasts te hechten 's nachts. </li><li> Vervang hESC cardiale differentiatie media met 10 mM NAM om de andere dag. </li><li> Op dag 8, te vervangen door hESC cardiale differentiatie media zonder NAM, en ga verder met MES-cardiale differentiatie media e vervangenheel andere dag. Beating cardiomyocyten zal beginnen in ongeveer 1-2 weken van continu teelt verschijnen na het staken van de NAM en in aantal met de tijd toenemen, en kon behouden een sterke en ritmische samentrekkingen voor meer dan 3 maanden. </li></ol> 7. Representatieve resultaten: Nicotinamide (NAM) is weergegeven voldoende is om hESC 's gehandhaafd in de gedefinieerde cultuur-systeem om de overgang van pluripotentie uitsluitend aan een cardiomesodermal fenotype (Fig. 2B) veroorzaken. Bij blootstelling van ongedifferentieerde hESC 's tot NAM, zullen alle cellen binnen de kolonie ondergaan morfologie verandert in grote gedifferentieerde cellen die de expressie van Oct-4 down-reguleren en beginnen om de cardiale specifieke transcriptie factor (CSX) Nkx2.5 en α-express actinine, in overeenstemming met een cardiomesoderm fenotype (Fig. 2B). Deze gedifferentieerde cellen zal blijven vermenigvuldigen en de koloniën in omvang toenemen. Verhoogde intensiteit van de Nkx2.5 zalworden meestal waargenomen in gebieden van de kolonies waar de cellen beginnen te stapelen (Fig. 2B). Na vrijstaand, zal de NAM-behandelde hESC 's vorm drijvende cellulaire clusters (cardioblasts) in een suspensie cultuur om de cardiale differentiatie-proces voort te zetten. Na het toestaan ​​van de cardioblasts te bevestigen en te blijven met de NAM te behandelen voor 1 week, zal slaan cardiomyocyten beginnen in ongeveer 1-2 weken van continu teelt verschijnen na intrekking van de NAM met een drastische verhoging van de efficiency ten opzichte van spontane multi-lijn differentiatie van hESC 's zonder behandeling over dezelfde periode (Fig. 2C). Cellen in het kloppend cardiomyocyt clusters zal uiten markers kenmerk van cardiomyocyten, waaronder Nkx2.5 en α-actinine (Fig. 2C). De samentrekkingen van het kloppende cardiomyocyten werden bevestigd door elektrische profielen sterk, ritmische, goed gecoördineerde en goed meegesleurd, met regelmatige impulsen die doen denken aan de p-QRS-T-complexen gezien vanuit het lichaamsoppervlak elektroden in de klinische elektrocardiogrammen (fig. 2C, zie ook de video). De hartspiercellen zouden kunnen behouden hun sterke contractiliteit van meer dan 3 maanden. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3274/3274fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Algemene schema's van de conventionele benadering ten opzichte van kleine molecule-inductie aanpak voor differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen naar gespecialiseerde functionele cellen. (A) Een schema van de conventionele benadering met behulp van multi-lijn helling van menselijke pluripotente stamcellen door middel van spontane kiemlaag differentiatie. (B) Een schema van goed gecontroleerde efficiënte inductie van menselijke pluripotente stamcellen uitsluitend aan een bepaald klinisch relevante lijn door een eenvoudige bepaling van kleine moleculen. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3274/3274fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Nicotinamide veroorzaakt hart-lijn specificatie direct van pluripotentie onder nauwkeurig omschreven omstandigheden de progressie naar slaan cardiomyocyten. (A) Schematische voorstelling van het protocol de tijd lijn van gerichte cardiale differentiatie van hESC 's. (B) Bij blootstelling van ongedifferentieerde hESC 's aan Nicotinamide (NAM) onder de gedefinieerde cultuur, grote gedifferentieerde okt-4 (rood) negatieve cellen binnen de kolonie begon te ontstaan, in vergelijking met de mock-behandeld (DMSO) hESC' s als de controle. NAM-geïnduceerde Oct-4-negatieve cellen begonnen te uiten Nkx2.5 (groen) en α-actinine (rood), consistent met vroege cardiale differentiatie. Geleidelijk verhoogd intensiteit van de Nkx2.5 werd meestal waargenomen in gebieden van de kolonie waar de cellen begonnen op te stapelen. Alle cellen worden aangegeven door DAPI kleuring van hun kernen (blauw). (C) NAM-geïnduceerde cardiale-vastgelegde hESC 's slaan cardiomyocyten leverde met een drastische toename van de efficiëntie, zoals beoordeeld door de cellulaire clusterters die ritmische samentrekkingen (zie elektrofysiologische profiel en de video's), en immunopositive voor Nkx2.5 (groen) en α-actinine (rood) weergegeven. Fase beelden van representatieve grote slaan cardiomyocyten clusters en hogere macht beelden van representatieve aanbestedende hartspieren worden weergegeven (zie ook bijbehorende video's). Pijlen geven de grote kloppende cardiomyocyt cluster gebruikt voor elektrofysiologische opname. Elektrofysiologische profiel van het kloppende hartspiercellen shows regelmatig, meegevoerd, ritmische impulsen doet denken aan de p-QRS-T-complexen gezien in klinische elektrocardiogrammen. Schaal bars: 0,1 mm. Video: De aanbestedende cardiomyocyten onderscheiden van NAM-geïnduceerde hESC 's. Video's 1 en 2 tonen representatieve grote kloppende cardiomyocyten clusters in ongeveer 1 en 3 maanden na beslag. Video 3 en 4 tonen vertegenwoordiger aanbestedende hartspieren bij een hogere macht. Video 5 toont een typical klein slaan cardiomyocyte cluster spontaan onderscheiden van hESC 's, zonder NAM behandeling als controle. <a href="/files/ftp_upload/3274/3274video1.avi">Klik hier om een video te kijken.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video2.avi">Klik hier om Video 2 kijken.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video3.avi">Klik hier om Video 3 te kijken.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video4.avi">Klik hier om video te bekijken 4.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video5.avi">Klik hier om video te bekijken 5.</a>

<ol><li>Jawad, H., Ali, N. N., Lyon, A. R., Chen, Q. Z., Harding, S. E., Boccaccini, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+tissue+engineering%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue.+Eng.+Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">Myocardial tissue engineering: a review.</a> J. Tissue. Eng. Regen. Med. 1, 327-342 (2007).</li>
<li>Passier, P., van Laake, L. W., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell-based+therapy+and+lessons+from+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem-cell-based therapy and lessons from the heart.</a> Nature. 453, 322-329 (2008).</li>
<li>Zhu, W. Z., Hauch, K. D., Xu, C., Laflamme, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+and+cardiac+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Rev%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells and cardiac repair.</a> Transplant Rev. 23, 53-68 (2009).</li>
<li>Parsons, X. H., Teng, Y. D., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Important+precautions+when+deriving+patient-specific+neural+elements+from+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Important precautions when deriving patient-specific neural elements from pluripotent cells.</a> Cytotherapy. 11, 815-824 (2009).</li>
<li>J, J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. , 282-1145 (1998).</li>
<li>Aubry, L., Bugi, A., Lefort, N., Rousseau, F., Peschanski, M., Perrier, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Striatal+progenitors+derived+from+human+ES+cells+mature+into+DARPP32+neurons+in+vitro+and+in+quinolinic+acid-lesioned+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 16707-16712 (2008).</li>
<li>Roy, N. S., Cleren, C., Singh, S. K., Yang, L., Beal, M. F., Goldman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+engraftment+of+human+ES+cell-derived+dopaminergic+neurons+enriched+by+coculture+with+telomerase-immortalized+midbrain+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes.</a> Nature Medicine. 12, 1259-1268 (2006).</li>
<li>Wernig, M., Zhao, J. P., Pruszak, J., Hedlund, E., Fu, D., Soldner, F., Broccoli, V., Constantine-Paton, M., Isacson, O., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+derived+from+reprogrammed+fibroblasts+functionally+integrate+into+the+fetal+brain+and+improve+symptoms+of+rats+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Neurons derived from reprogrammed fibroblasts functionally integrate into the fetal brain and improve symptoms of rats with Parkinson's disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5856-5861 (2008).</li>
<li>Richards, M., Fong, C., Chan, W., Wong, P., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+feeders+support+prolonged+undifferentiated+growth+of+human+inner+cell+masses+and+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells.</a> Nature. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).</li>
<li>Xu, C., Inokuma, M. S., Denham, J., Golds, K., Kundu, P., Gold, J. D., Carpenter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li>
<li>Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+FGF+and+suppression+of+BMP+signaling+sustain+undifferentiated+proliferation+of+human+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells.</a> Nature Methods. 2, 185-190 (2005).</li>
<li>Parsons, X. H., Teng, Y. D., Moore, D. A., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patents+on+technologies+of+human+tissue+and+organ+regeneration+from+pluripotent+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Patents+on+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patents on technologies of human tissue and organ regeneration from pluripotent human embryonic stem cells.</a> Recent Patents on Regenerative Medicine. 1, 142-163 (2011).</li>
<li>Kehat, I., Khimovich, L., Caspi, O., Gepstein, A., Shofti, R., Arbel, G., Huber, I., Satin, J., Itskovitz-Eldor, J., Gepstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electromechanical+integration+of+cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Electromechanical integration of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1282-1289 (2004).</li>
<li>Laflamme, M. A., Chen, K. Y., Naumova, A. V., Muskheli, V., Fugate, J. A., Dupras, S. K., Reinecke, H., Xu, C., Hassanipour, M., Police, S., O'Sullivan, C., Collins, L., Chen, Y., Minami, E., Gill, E. A., Ueno, S., Yuan, C., Gold, J., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells+in+pro-survival+factors+enhance+function+of+infracted+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infracted rat hearts.</a> Nat. Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).</li>
<li>Caspi, O., Huber, I., Kehat, I., Habib, M., Arbel, G., Gepstein, A., Yankelson, L., Aronson, D., Beyar, R., Gepstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+improves+myocardial+performance+in+infarcted+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Transplantation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes improves myocardial performance in infarcted rat hearts.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 50, 1884-1893 (2007).</li>
<li>Akazawa, H., Komuro, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+transcription+factor+Csx%2FNkx2-5%3A+Its+role+in+cardiac+development+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Cardiac transcription factor Csx/Nkx2-5: Its role in cardiac development and diseases.</a> Pharmacol. Ther. 107, 252-268 (2005).</li>
<li>Leda, M., Fu, J. D., Delgado-Olguin, P., Vedantham, V., Hayashi, Y., Bruneau, B. G., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142, 375-386 (2010).</li>
<li>Efe, J. A., Hilcove, S., Kim, J., Zhou, H., Ouyang, K., Wang, G., Chen, J., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+mouse+fibroblasts+into+cardiomyocytes+using+a+direct+reprogramming+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Conversion of mouse fibroblasts into cardiomyocytes using a direct reprogramming strategy.</a> Nat. Cell. Biol. 13, 215-222 (2011).</li>
<li>Kim, K., Doi, A., Wen, B., Ng, K., Zhao, R., Cahan, P., Kim, J., Aryee, M. J., Ji, H., Ehrlich, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467, 285-290 (2010).</li>
<li>Gore, A., Li, Z., Fung, H. L., Young, J. E., Agarwal, S., Antosiewicz-Bourget, J., Canto, I., Giorgetti, A., Israel, M. A., Kiskinis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+coding+mutations+in+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Somatic coding mutations in human induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 471, 63-67 (2011).</li>
<li>Feng, Q., Lu, S. J., Klimanskaya, I., Gomes, I., Kim, D., Chung, Y., Honig, G. R., Kim, K. S., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemangioblastic+derivatives+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+exhibit+limited+expansion+and+early+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Hemangioblastic derivatives from human induced pluripotent stem cells exhibit limited expansion and early senescence.</a> Stem Cells. 28, 704-712 (2010).</li>
<li>Klimanskaya, I., Chung, Y., Becker, S., Lu, S. -J., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+from+single+blastomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Derivation of human embryonic stem cells from single blastomeres.</a> Nat. Protocols. 2, 1963-1972 (2007).</li>
<li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li>
</ol>

De auteurs verklaren concurrerende belangen. XHP is de oprichter van Xcelthera. XHP en EYS zijn intellectuele eigendommen met betrekking tot hESC &#39;s.

Een van de belangrijkste uitdagingen voor zowel de ontwikkeling en klinische studie vertaling is hoe het brede differentiatie mogelijkheden van pluripotente menselijke stamcellen kanaal om een ​​gewenst fenotype efficiënt en voorspelbaar. Hoewel dergelijke cellen kunnen spontaan differentiëren in vitro in de cellen van alle kiembladen door te gaan door middel van een multi-lijn aggregaat podium, in hESC-afgeleide multi-stam aggregaten (embryoid instanties), slechts een zeer kleine fractie van cellen (&lt;2%) spontaan differentiëren tot cardiomyocyten 13-15 (Fig. 1A). Na immunoselection, de verrijkte populaties van cardiomyocyten in staat waren om te functioneren als biologische pacemakers aan de functie van een beschadigde hartspier te redden mechanisch en elektronisch na injectie in het hart van diermodellen 13. In knaagdier infarct modellen, geënt hESC-afgeleide cardiale nakomelingen waren in staat om te overleven en tot volwassen tot 12 weken, en gedeeltelijk remuscularize de gewonde hart en het verbeteren van de contractiele functie 14,15. Echter, de inefficiëntie in het genereren van menselijk hart-vastgelegde cellen door middel van multi-lijn differentiatie van pluripotente cellen en het hoge risico van tumorgeniciteit na de transplantatie gehinderd verdere klinische vertaling. Ontwikkelen van strategieën om de grote differentiatie potentieel van pluripotente hESC &#39;s kanaal zich uitsluitend en voorspelbaar tot een hartaanval fenotype is van vitaal belang voor de kracht van hESC biologie in het hart veld. Met het oog op een uniforme omzetting van menselijke pluripotente stamcellen om een ​​bepaalde lijn te bereiken, hebben we gebruik van een bepaalde cultuur systeem dat in staat het verzekeren van de verspreiding van ongedifferentieerde hESC &#39;s uitsluitend te identificeren voorwaarden voor een goed gecontroleerde efficiënte inductie van pluripotente hESC&#39; s om een ​​bepaald klinisch relevante lijn door eenvoudige verstrekking van kleine moleculen (figuur 1B). Wij vonden dat nicotinamide geïnduceerde cardiale-lineage inzet rechtstreeks van pluripotent hESC &#39;s onder bepaalde cultuur die verder gevorderd te slaan cardiomyocyten met hoog rendement (fig. 2). Nkx2.5 is een evolutionair geconserveerd homeobox transcriptie factor onmisbaar voor de normale ontwikkeling van het hart en mutaties van het gen geassocieerd zijn met de mens een aangeboren hartziekte (CHZ), de meest voorkomende menselijke geboorteafwijking 16. Expressie van Nkx2.5 is de eerste marker voor het hart voorloper cellen in alle gewervelde dieren tot nu toe onderzocht en is essentieel voor een goede cardiale septation en de vorming / rijping van elektrisch geleidingssysteem 16. In gewervelde dieren, het begin en het patroon van de vroege Nkx2.5 expressie ongeveer samenvallen met de timing en het gebied van cardiale specificatie in de vroege embryogenese en Nkx2.5 gen nog steeds worden uitgedrukt door middel van ontwikkeling in het hart 16. In ons hESC model, NAM bleek de cardiale inductie rechtstreeks van pluripotente hESC &#39;s activeren door het bevorderen van de expressie van cardiaal-specifieke transcrikopen worden Nkx2.5 factor in een proces dat de specificatie van cardiomesoderm zou kunnen emuleren van de pluripotente epiblast in humane embryonale cardiogenese. Toekomstige studies zullen onthullen genetische en epigenetische controle moleculen in de menselijke ontwikkeling van het hart als alternatieven, die mogelijk de weg vrij te maken voor kleine molecule-gemedieerde directe controle en modulatie van hESC pluripotente het lot wanneer afleiden van klinisch relevante lineages voor regeneratieve therapieën. Zonder NAM behandeling, &lt;2% hESC &#39;s zullen spontane differentiatie ondergaan in slaan hartspiercellen 12-15. Met de NAM behandeling, zijn we in staat geweest om&gt; 95% embryonale hart-precursoren en&gt; 50% kloppende hartspiercellen van hESC &#39;s gehandhaafd onder een te definiëren cultuur in een proces dat menselijke embryonale ontwikkeling van het hart 12 zou kunnen emuleren genereren. Onlangs hebben geweten cardiale-lot bepalen van genen is gebruikt om muizen fibroblasten transdifferentiate in post-natale slaan cardiomyocyten met een lage efficiëntie van &lt;0,5% 17, 18 &lt;/ Sup&gt;. Echter, opnieuw geprogrammeerd somatische cellen historisch werd geassocieerd met een abnormale genexpressie en versnelde veroudering met een verminderde therapeutische nut 19-21. Tot slot wordt het protocol waarin we gevestigd hier beperkt tot pluripotente hESC &#39;s afgeleid van de binnenste celmassa (ICM) of epiblast van de menselijke blastocyst 4,5, mogelijk niet van toepassing op andere pluripotente cellen, met inbegrip van dieren afkomstige SER, SER afgeleid uit eerdere morula (acht-cel)-stadium embryo&#39;s 22, en kunstmatig geherprogrammeerde cellen 23.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het reagens </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> Gelatine </td><td> Sigma </td><td> G1890 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD bioscience </td><td> 356231 </td><td> Groeifactor verminderd </td></tr><tr><td> Human laminine </td><td> Sigma </td><td> L6274 </td><td></td></tr><tr><td> Nicotinamide </td><td> Sigma </td><td> N0636 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565042 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31053036 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM-KO </td><td> Invitrogen </td><td> 10829018 </td><td></td></tr><tr><td> Knock-out serum vervanging </td><td> Invitrogen </td><td> 10828028 </td><td></td></tr><tr><td> MEM niet-essentiële aminozuren oplossing (MNAA, 100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140050 </td><td></td></tr><tr><td> MEM aminozuren oplossing (MEAA, 100X) </td&gt; <td> Invitrogen </td><td> 11130050 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercapto-ethanol </td><td> Invitrogen </td><td> 21985023 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax </td><td> Invitrogen </td><td> 11020021 </td><td></td></tr><tr><td> Ascorbinezuur </td><td> Sigma </td><td> A4403 </td><td></td></tr><tr><td> Menselijke transferrine </td><td> Sigma </td><td> T8158 </td><td></td></tr><tr><td> Human bFGF </td><td> PeproTech </td><td> AF-100-18B </td><td></td></tr><tr><td> Menselijke insuline </td><td> Invitrogen </td><td> 12585014 </td><td></td></tr><tr><td> Menselijke activine A </td><td> PeproTech </td><td> 120-14E </td><td></td></tr><tr><td> Gedefinieerd FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30073-03 </td><td></td></tr><tr><td> 6-well Ultra-bevestigingsplaat </td><td> Corning </td><td> 3471 </td><td></td></tr><tr><td> 6-well plaat </td><td> Corning </td><td> 3516 </td><td></td></tr></tbody></table>

efficiënte afleiding van de mens cardiac precursoren en cardiomyocyten uit pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen inductie

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Tot op heden heeft het ontbreken van een geschikte humane cardiale cel bron is de grote tegenslag in het regenereren van de menselijke hartspier, hetzij door cel-gebaseerde transplantatie of door het hart tissue engineering 1-3. Cardiomyocyten geworden terminaal-gesplitste kort na de geboorte en verliezen hun vermogen om te woekeren. Er is geen bewijs dat de stam / voorlopercellen cellen, afkomstig van andere bronnen, zoals het beenmerg of het navelstrengbloed, kunnen aanleiding geven tot het contractiele hartspiercellen na transplantatie in het hart 1-3. De noodzaak om regenereren of herstellen van de beschadigde hartspier niet is voldaan door volwassen stamceltherapie, zowel endogeen of via cel levering 1-3. De genetisch stabiele menselijke embryonale stamcellen (hESC &#39;s) hebben onbeperkte uitbreiding capaciteit en onbeperkte plasticiteit, proffering een pluripotent reservoir voor in vitro afleiding van grote voorraden van menselijke somatische cellen die worden beperkt tot de afstamming in noodvan herstel en regeneratie 4,5. Als gevolg van de prevalentie van hart-en vaatziekten wereldwijd en acuut tekort aan donororganen, is er intense belangstelling voor de ontwikkeling hESC-gebaseerde therapieën als een alternatieve benadering. Echter, hoe de grote differentiatie potentieel van pluripotente hESC &#39;s kanaal efficiënt en voorspelbaar om een ​​gewenste fenotype is een grote uitdaging voor zowel de ontwikkeling en klinische studie vertaling. Conventionele benaderingen vertrouwen op multi-lijn helling van pluripotente cellen door spontane kiemlaag differentiatie, wat resulteert in inefficiënte en oncontroleerbare lineage-inzet die vaak wordt gevolgd door fenotypische heterogeniteit en instabiliteit, dus een hoog risico op tumorgeniciteit 6-8 (zie een schema in Fig. 1A). Daarbij mag undefined buitenlandse / dier biologische aanvullingen en / of feeders die typisch zijn gebruikt voor de isolatie, uitbreiding en differentiatie van hESC &#39;s direct gebruik maken van een dergelijke cel-specialized grafts bij patiënten problematisch 9-11. Om deze obstakels, hebben we besloten de elementen van een bepaalde cultuur-systeem noodzakelijk en voldoende voor het behoud van de epiblast pluripotence van hESC &#39;s, die als een platform voor de novo afleiding van klinisch-geschikte hESC&#39; s en effectief te regisseren die hESC &#39;s uniform naar klinisch relevante lineages door kleine moleculen 12 (zie een schematisch in Fig. 1B). Na het screenen van een groot aantal kleine moleculen en groeifactoren, vonden we dat een dergelijke omschreven voorwaarden gerenderd nicotinamide (NAM) voldoende is om de specificatie van cardiomesoderm rechtstreeks van pluripotente hESC &#39;s die verder gevorderd om te cardioblasts dat de menselijke slaan cardiomyocyten gegenereerd met hoog rendement te induceren (figuur 2 ). Definieerden we de voorwaarden voor de inductie van cardioblasts rechtstreeks van pluripotente hESC &#39;s zonder tussenkomst van een multi-lijn embryoid body fase, waarin goed gecontroleerde efficiënte afleiding van eengroot aanbod van menselijke hartcellen over het gehele spectrum van de ontwikkelingsstadia van cel-gebaseerde therapieën.

We hebben een protocol voor de inductie van cardioblasts rechtstreeks van pluripotente menselijke embryonale stamcellen gehouden onder bepaalde voorwaarden met kleine moleculen, die afleiding van een groot aanbod van menselijke voorouders hart-en functionele cardiomyocyten voor hart-en reparatie mogelijk maakt.

Efficiënte Afleiding van de Mens Cardiac precursoren en cardiomyocyten uit pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

Tot op heden is het gebrek aan een geschikte bron van menselijke hartcellen de grootste belemmering geweest bij het regenereren van het menselijke myocardium, hetzij door middel van celgebaseerde ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om direct en uitsluitend cardiale nakomelingen te verkrijgen uit pluripotente menselijke embryonale stamcellen middels inductie met kleine moleculen. Dit wordt bereikt door nicotinamide toe te voegen aan ongedifferentieerde menselijke ES-cellen die onder gedefinieerde omstandigheden worden onderhouden. Vervolgens worden de cardiaal differentiërende cellen losgemaakt om cardioblasten te vormen, zwevende cellulaire clusters in een suspensiecultuur.Zodra ze zijn gevormd, worden de cardioblasts overgebracht naar cardiale differentiatie-mediums, waar ze zich verder ontwikkelen tot kloppende cardiomyocyten. Uiteindelijk worden de resultaten beoordeeld via immunofluorescentie met deconvolutie- of confocale microscopie en via elektrofysiologische registraties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een efficiënte inductie van pluripotente menselijke embryonale stamcellen uitsluitend richting een cardiale lijn mogelijk maakt door de eenvoudige toevoeging van kleine moleculen.Waarbij in bestaande methoden voor multi-lineage differentiatie slechts een klein deel van de cellen een cardiaal fenotype aanneemt. Er zijn enkele stappen waar men voorzichtig moet zijn bij het bereiden van stokoplossingen. Zorg ervoor dat matrigel en humaan laminine langzaam ontdooien van -80 °C naar 4 °C gedurende de nacht; bewaar media bij 4 °C en warm de media altijd op tot 37 °C voor gebruik.Daarnaast worden bij het bereiden van het medium voor menselijke E es-cellen sommige supplementen pas vlak voor gebruik toegevoegd. Hiertoe behoren BFGF, ascorbinezuur, menselijke actieve insuline in A en transferrine. Maak vervolgens de werkoplossingen van matrigel of menselijk laminine onmiddellijk voordat de platen worden gecoat.Incubeer de platen bij 37 °C in 5% CO₂ nadat de met gelatine voorgecoate weefselkweekplaten zijn voorbereid. De gelatine kan worden vervangen door een matrigel- of laminine-werkoplossing. Coat deze platen door ze een nacht te incuberen bij 4 °C.Laat de menselijke ES-celkolonies eerst vijf tot zeven dagen groeien en bereid u vervolgens voor om een aantal daarvan te splitsen. Selecteer kolonies met meer dan 75% ongedifferentieerde menselijke ES-cellen. Deze zijn gewoonlijk licht opaak met scherp gedefinieerde randen en kolonies met opgestapelde cellen. Een indicatie voor het begin van differentiatie is vaak dat kolonies, die voornamelijk gedifferentieerde cellen bevatten, helder lijken.Selecteer geen witte of transparante kolonies. Houd de platen tegen het licht en gebruik een markeerpen om de licht opake kolonies op de bodem van de platen langs de contouren te omcirkelen. Gebruik de rand van een steriele P2-pipetpunt om de omringende fibroblastlaag van de menselijke ES-celkolonie los te maken.Verwijder vervolgens de omringende fibroblastcellen en verwijder ook alle gedifferentieerde delen van de kolonie. Zuig nu het oude medium weg dat de losgekomen gedifferentieerde cellen bevat. Was daarna in elke put de ongedifferentieerde cellen één keer met menselijk ES-celmedium zonder BFGF, en voeg vervolgens drie milliliter vers menselijk ES-celmedium toe waaraan BFGF vlak voor gebruik is toegevoegd.Gebruik nu een steriele P2-pipetpunt om de kolonies in kleine stukjes te snijden en ze van de plaat los te maken. Trek de losgemaakte stukjes kolonie samen met hun medium over naar een conisch buisje van 50 milliliter. Trek daarnaast per well een extra spoeling van 1 milliliter medium over.De cellen zijn nu klaar voor verdere differentiatie met behulp van kleine moleculen. Begin met het opwarmen van vers gecoate platen tot 37 °C. Aspireer de coatingoplossing uit de platen en voeg in elke well een aliquot van 4 mL medium met colony-stukjes toe, waarna de platen voorzichtig naar een incubator worden overgebracht zonder ze te schudden.Verstoor de platen niet, zodat de cellen zich kunnen hechten. Verwijder vervolgens het grootste deel van het oude medium, waarbij net genoeg medium overblijft zodat de cellen ondergedompeld blijven. De cellen mogen nooit uitdrogen.Meng vers menselijk ESL-medium dat basic FGF en nicotinamide bevat en voeg de voorgeschreven hoeveelheid milliliters van dit medium toe aan elke put. Het medium kan tot twee weken worden bewaard bij vier graden Celsius, waarbij het om de dag kan worden gebruikt om de celcultuur te verversen om de kolonies te laten groeien. Na acht tot 10 dagen zullen de cellen morfologische veranderingen hebben ondergaan tot grote gedifferentieerde cellen die zijn vermenigvuldigd en opgestapeld.Ga vervolgens verder met een suspensiecultuur. Om een suspensiecultuur te starten, worden de ESL-kolonies losgekoppeld van cellen die spontaan zijn gedifferentieerd en gemigreerd om een fibroblastlaag te vormen. Gebruik hiervoor de eerder beschreven techniek met een steriele pipetpunt en zuig vervolgens het oude medium af dat zwevende, losgekoppelde fibroblastcellen bevat. Was de cellen één keer met HESC-medium en resuspendeer ze in drie milliliters HESC-medium, nu met gebruik van een steriele P2-pipetpunt.Snijd de kolonies in kleine stukjes en verwijder ze van de plaat. Trek het medium met de losgemaakte kolonies over in één conische buis van 50 milliliter. Spoel de putjes met één milliliter medium en voeg het spoelwater toe aan de verzameling. Verdeel vervolgens vier milliliter van de gepoelde cellen over elke put van een six-well ultra-low attachment plaat gedurende vier tot vijf dagen. Bewaar de plaat in een incubator om de vorming van drijvende cellulaire clusters of cardioblasten mogelijk te maken, zodat de cardioblasten kunnen evolueren naar het kloppende cardiomyocytenfenotype. Verzamel deze samen met hun medium in een conische buis van 50 milliliter.Centrifugeer de cellen vervolgens gedurende vijf minuten bij 1.400 RPM. Aspireer het medium, weeg zoveel mogelijk van het oude medium af en voeg een gelijke hoeveelheid vers cardiac differentiation medium toe dat 10 millimol nicotinamide bevat.Meng de drijvende cardioblasts door middel van pipetteren en verdeel vervolgens vier milliliters van de cardioblasts-suspensie over elke well van zes-well weefselkweekplaten. Plaats de platen in een bevochtigde incubator bij 37 degrees Celsius om de cardioblasts 's nachts te laten hechten aan de weefselkweekplaten. Elke tweede dag in cultuur.Vervang op dag acht het medium voor cardiale differentiatie dat 10 mini molin nicotinamide bevat. Schakel over naar cardiale differentieermedia zonder nicotinamide en blijf het medium om de dag vervangen.Binnen twee weken na het wegnemen van nicotinamide zullen kloppende cardiomyocyten verschijnen en in aantal toenemen. Nicotinamide blijkt voldoende om menselijke ES-cellen, onderhouden in het gedefinieerde cultuursysteem, te induceren om van pluripotentie exclusief over te gaan naar een cardio-mesodermaal fenotype. Bij blootstelling van ongedifferentieerde menselijke ES-cellen aan nicotinamide ondergingen alle cellen binnen de kolonie morfologische veranderingen tot grote gedifferentieerde cellen die de expressie van OCT four downreguleerden. De cellen begonnen daarnaast de hartspecifieke transcriptiefactor NK X 2.5 en tevens alpha actinine te expresseren.Beide kenmerken zijn consistent met het fenotype van het cardiomesoderm. Deze gedifferentieerde cellen blijven zich vermenigvuldigen en in omvang toenemen in gebieden van de koloniën waar cellen zich hadden opgehoopt. De expressie van NKX 2.5 werd intenser. Na detachering vormden de met nicotinamide behandelde humane ES-cellen cardioblasten in een suspensiecultuur.Nadat de cardioblasten de kans hadden gekregen om te hechten, werden de cardioblasten gedurende één week behandeld met nicotinamide; één tot twee weken na het staken van de behandeling met nicotinamide begonnen kloppende cardiomyocyten te verschijnen met een drastische toename in efficiëntie. Zij verschenen als cellulaire clusters die pulseerden met ritmische contracties; spontane multi-lineage differentiatie van cellen die geen IDE-behandeling hadden ondergaan, vertoonde deze kenmerken niet. Cellen binnen de clusters van kloppende cardiomyocyten drukten markers uit die kenmerkend zijn voor cardiomyocyten, waaronder NK X 2.5 en alfa-actinine.De contracties van de kloppende cardiomyocyten werden via elektrische profielen bevestigd als sterk, ritmisch, gecoördineerd en goed gesynchroniseerd; ze vertoonden regelmatige impulsen die doen denken aan de P-Q-R-S-T-complexen die met oppervlakte-elektroden in klinische elektrocardiogrammen worden waargenomen. Bovendien konden de cardiomyocyten hun sterke contractiliteit meer dan drie maanden behouden. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze worden gebruikt om in ongeveer vijf weken uniform hartvoorlopers en kloppende cardiomyocyten te genereren uit pluripotente menselijke embryonale stamcellen, mits correct uitgevoerd.

efficient-derivation-human-cardiac-precursors-cardiomyocytes-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We hebben een protocol voor de inductie van neuroblasts rechtstreeks van pluripotente menselijke embryonale stamcellen gehouden onder bepaalde voorwaarden met kleine moleculen, die afleiding van een groot aanbod van menselijke neurale voorouders en neuronale celtypes in het ontwikkelen van CNS voor neurale reparatie mogelijk maakt.

Efficiënte Afleiding van de Mens Neuronale voorouders en neuronen van pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

Pluripotente stamcellen, hetzij embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen vormen een waardevolle bron van menselijke gedifferentieerde cellen, zoals cardiomyocyten. Hier zullen we ons richten op de cardiale inductie van iPS cellen, laten zien hoe ze te gebruiken om functionele menselijke hartspiercellen te verkrijgen via een embryoid lichamen-gebaseerd protocol.

Generatie van Human Cardiomyocytes: Een Differentiatie Protocol van Feeder-vrije Human geïnduceerde pluripotente stamcellen

Het artikel beschrijft de gedetailleerde methodologie efficiënt onderscheiden humane pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten door het selectief moduleren van de Wnt route, gevolgd door flow cytometrie analyse van referentiemarkeringen aan homogeniteit en identiteit van de bevolking beoordelen.

High Efficiency differentiatie van humane pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten en karakterisering door flowcytometrie

In dit protocol wordt de afleiding van cardiale stamcellen van zowel muis- als menselijke embryonale stamcellen geïllustreerd. Een belangrijke strategie in dit protocol is het verrijken van cardiale stamcellen met middel van flowcytometrie met behulp van fluorescente reporters die in de embryonale stamcellijnen zijn ontworpen.

Afleiding van Cardiac stamcellen uit embryonale stamcellen

Hier beschrijven we een robuust protocol voor de afstamming van menselijke cardiomyocyten dat klein molecuul-gemoduleerde cardiogene differentiatie combineert met glucosedeprivatie-gemedieerde zuivering van cardiomyocyten, waardoor het mogelijk wordt om gezuiverde cardiomyocyten te produceren voor het modelleren van hart- en vaatziekten en voor geneesmiddelenonderzoek.

Afleiding van zeer gezuiverde Cardiomyocyten van Human geïnduceerde pluripotente stamcellen Met behulp van kleine moleculen gemoduleerd Differentiatie en Latere Glucose Verhongering

Het genereren van cardiomyocyten uit pluripotente stamcellen in vitro biedt toegang tot grote hoeveelheden hartweefsel in vitro voor fundamentele wetenschappen en klinische toepassingen. Dit protocol gebruikt de atrialiserende factor Grem2 om zowel het aantal verkregen cardiomyocyten te verhogen als om cardiomyocyten met een atriumfenotype te genereren.

Differentiatie van atriale cardiomyocyten uit pluripotente stamcellen Met behulp van de BMP Antagonist Grem2

Hier presenteren we een robuust, snel en schaalbaar protocol voor cardiomyocytedifferentiatie voor humane pluripotente stamcellen (hPSC's). Cardiomyocyten die met deze grootschalige methode worden verkregen, kunnen voldoende celgetallen leveren voor hun effectieve gebruik in modellering van menselijke hart- en vaatziekten, high-throughput geneesmiddelenonderzoek en mogelijk klinische toepassingen.

Grootschalige productie van cardiomyocyten van menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een zeer reproduceerbare Small-Molecule Based Differentiatie Protocol

Elektrofysiologische karakterisering van cardiomyocyten afgeleid van humane Pluripotente Stamcellen (hPSC-CM's) is van cruciaal belang voor cardiovasculaire modellering en voor het bepalen van geneesmiddelreacties. Dit protocol geeft de nodige informatie om hPSC-CM's op multi-elektrode arrays te scheiden en te platen, hun veldpotentiaal te meten en een methode voor het analyseren van QT- en RR-intervallen.

Elektrofysiologische analyse van humane Pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hPSC-CM&#39;s) met behulp van multi-elektrode arrays (MEA&#39;s)

Hier beschrijven we een schaalbare methode, met behulp van een eenvoudige combinatie van Activin A en lentivirus-gemedieerde Id1-overexpressie, voor het genereren van eerste hart veld-achtige cardiale progenitoren en ventriculaire-achtige cardiomyocytes van menselijke pluripotente stamcellen.

Generatie van eerste hart veld-achtige cardiale progenitoren en ventriculaire-achtige Cardiomyocytes van menselijke pluripotente stamcellen

Hier presenteren we een protocol om menselijke cardiomyocyten robuust te genereren en uit te breiden uit perifere mononucleaire bloedcellen van patiënten.

Generatie en uitbreiding van menselijke cardiomyocyten uit mononucleaire bloedcellen van de patiënt

Hier wordt een reeks protocollen gepresenteerd voor het genereren en cryopreservatie van cardiale sferoïden (CSs) uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten gekweekt in een multidimensionaal formaat met hoge doorvoer. Dit driedimensionale model functioneert als een robuust platform voor ziektemodellering, high-throughput screenings en behoudt zijn functionaliteit na cryopreservatie.

Generatie, high-throughput screening en biobanking van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiale sferoïden

Leer hoe je cardioblasten afleidt uit menselijke embryonale stamcellen met nicotinamide-inductie. Deze methode genereert functionele cardiomyocyten voor cardiovasculair onderzoek.

Efficiënte Afleiding van de Mens Cardiac precursoren en cardiomyocyten uit pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie (Video) | JoVE Journal

Efficiënte Afleiding van de Mens Cardiac precursoren en cardiomyocyten uit pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

Meer video's verkennen