Efficiënte Afleiding van de Mens Cardiac precursoren en cardiomyocyten uit pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

Het algemene doel van het volgende experiment is om direct en uitsluitend cardiale nakomelingen te verkrijgen uit pluripotente menselijke embryonale stamcellen middels inductie met kleine moleculen. Dit wordt bereikt door nicotinamide toe te voegen aan ongedifferentieerde menselijke ES-cellen die onder gedefinieerde omstandigheden worden onderhouden. Vervolgens worden de cardiaal differentiërende cellen losgemaakt om cardioblasten te vormen, zwevende cellulaire clusters in een suspensiecultuur.

Zodra ze zijn gevormd, worden de cardioblasts overgebracht naar cardiale differentiatie-mediums, waar ze zich verder ontwikkelen tot kloppende cardiomyocyten. Uiteindelijk worden de resultaten beoordeeld via immunofluorescentie met deconvolutie- of confocale microscopie en via elektrofysiologische registraties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een efficiënte inductie van pluripotente menselijke embryonale stamcellen uitsluitend richting een cardiale lijn mogelijk maakt door de eenvoudige toevoeging van kleine moleculen.

Waarbij in bestaande methoden voor multi-lineage differentiatie slechts een klein deel van de cellen een cardiaal fenotype aanneemt. Er zijn enkele stappen waar men voorzichtig moet zijn bij het bereiden van stokoplossingen. Zorg ervoor dat matrigel en humaan laminine langzaam ontdooien van -80 °C naar 4 °C gedurende de nacht; bewaar media bij 4 °C en warm de media altijd op tot 37 °C voor gebruik.

Daarnaast worden bij het bereiden van het medium voor menselijke E es-cellen sommige supplementen pas vlak voor gebruik toegevoegd. Hiertoe behoren BFGF, ascorbinezuur, menselijke actieve insuline in A en transferrine. Maak vervolgens de werkoplossingen van matrigel of menselijk laminine onmiddellijk voordat de platen worden gecoat.

Incubeer de platen bij 37 °C in 5% CO₂ nadat de met gelatine voorgecoate weefselkweekplaten zijn voorbereid. De gelatine kan worden vervangen door een matrigel- of laminine-werkoplossing. Coat deze platen door ze een nacht te incuberen bij 4 °C.

Laat de menselijke ES-celkolonies eerst vijf tot zeven dagen groeien en bereid u vervolgens voor om een aantal daarvan te splitsen. Selecteer kolonies met meer dan 75% ongedifferentieerde menselijke ES-cellen. Deze zijn gewoonlijk licht opaak met scherp gedefinieerde randen en kolonies met opgestapelde cellen. Een indicatie voor het begin van differentiatie is vaak dat kolonies, die voornamelijk gedifferentieerde cellen bevatten, helder lijken.

Selecteer geen witte of transparante kolonies. Houd de platen tegen het licht en gebruik een markeerpen om de licht opake kolonies op de bodem van de platen langs de contouren te omcirkelen. Gebruik de rand van een steriele P2-pipetpunt om de omringende fibroblastlaag van de menselijke ES-celkolonie los te maken.

Verwijder vervolgens de omringende fibroblastcellen en verwijder ook alle gedifferentieerde delen van de kolonie. Zuig nu het oude medium weg dat de losgekomen gedifferentieerde cellen bevat. Was daarna in elke put de ongedifferentieerde cellen één keer met menselijk ES-celmedium zonder BFGF, en voeg vervolgens drie milliliter vers menselijk ES-celmedium toe waaraan BFGF vlak voor gebruik is toegevoegd.

Gebruik nu een steriele P2-pipetpunt om de kolonies in kleine stukjes te snijden en ze van de plaat los te maken. Trek de losgemaakte stukjes kolonie samen met hun medium over naar een conisch buisje van 50 milliliter. Trek daarnaast per well een extra spoeling van 1 milliliter medium over.

De cellen zijn nu klaar voor verdere differentiatie met behulp van kleine moleculen. Begin met het opwarmen van vers gecoate platen tot 37 °C. Aspireer de coatingoplossing uit de platen en voeg in elke well een aliquot van 4 mL medium met colony-stukjes toe, waarna de platen voorzichtig naar een incubator worden overgebracht zonder ze te schudden.

Verstoor de platen niet, zodat de cellen zich kunnen hechten. Verwijder vervolgens het grootste deel van het oude medium, waarbij net genoeg medium overblijft zodat de cellen ondergedompeld blijven. De cellen mogen nooit uitdrogen.

Meng vers menselijk ESL-medium dat basic FGF en nicotinamide bevat en voeg de voorgeschreven hoeveelheid milliliters van dit medium toe aan elke put. Het medium kan tot twee weken worden bewaard bij vier graden Celsius, waarbij het om de dag kan worden gebruikt om de celcultuur te verversen om de kolonies te laten groeien. Na acht tot 10 dagen zullen de cellen morfologische veranderingen hebben ondergaan tot grote gedifferentieerde cellen die zijn vermenigvuldigd en opgestapeld.

Ga vervolgens verder met een suspensiecultuur. Om een suspensiecultuur te starten, worden de ESL-kolonies losgekoppeld van cellen die spontaan zijn gedifferentieerd en gemigreerd om een fibroblastlaag te vormen. Gebruik hiervoor de eerder beschreven techniek met een steriele pipetpunt en zuig vervolgens het oude medium af dat zwevende, losgekoppelde fibroblastcellen bevat. Was de cellen één keer met HESC-medium en resuspendeer ze in drie milliliters HESC-medium, nu met gebruik van een steriele P2-pipetpunt.

Snijd de kolonies in kleine stukjes en verwijder ze van de plaat. Trek het medium met de losgemaakte kolonies over in één conische buis van 50 milliliter. Spoel de putjes met één milliliter medium en voeg het spoelwater toe aan de verzameling.

Verdeel vervolgens vier milliliter van de gepoelde cellen over elke put van een six-well ultra-low attachment plaat gedurende vier tot vijf dagen. Bewaar de plaat in een incubator om de vorming van drijvende cellulaire clusters of cardioblasten mogelijk te maken, zodat de cardioblasten kunnen evolueren naar het kloppende cardiomyocytenfenotype. Verzamel deze samen met hun medium in een conische buis van 50 milliliter.

Centrifugeer de cellen vervolgens gedurende vijf minuten bij 1.400 RPM. Aspireer het medium, weeg zoveel mogelijk van het oude medium af en voeg een gelijke hoeveelheid vers cardiac differentiation medium toe dat 10 millimol nicotinamide bevat.

Meng de drijvende cardioblasts door middel van pipetteren en verdeel vervolgens vier milliliters van de cardioblasts-suspensie over elke well van zes-well weefselkweekplaten. Plaats de platen in een bevochtigde incubator bij 37 degrees Celsius om de cardioblasts 's nachts te laten hechten aan de weefselkweekplaten. Elke tweede dag in cultuur.

Vervang op dag acht het medium voor cardiale differentiatie dat 10 mini molin nicotinamide bevat. Schakel over naar cardiale differentieermedia zonder nicotinamide en blijf het medium om de dag vervangen.

Binnen twee weken na het wegnemen van nicotinamide zullen kloppende cardiomyocyten verschijnen en in aantal toenemen. Nicotinamide blijkt voldoende om menselijke ES-cellen, onderhouden in het gedefinieerde cultuursysteem, te induceren om van pluripotentie exclusief over te gaan naar een cardio-mesodermaal fenotype. Bij blootstelling van ongedifferentieerde menselijke ES-cellen aan nicotinamide ondergingen alle cellen binnen de kolonie morfologische veranderingen tot grote gedifferentieerde cellen die de expressie van OCT four downreguleerden. De cellen begonnen daarnaast de hartspecifieke transcriptiefactor NK X 2.5 en tevens alpha actinine te expresseren.

Beide kenmerken zijn consistent met het fenotype van het cardiomesoderm. Deze gedifferentieerde cellen blijven zich vermenigvuldigen en in omvang toenemen in gebieden van de koloniën waar cellen zich hadden opgehoopt. De expressie van NKX 2.5 werd intenser. Na detachering vormden de met nicotinamide behandelde humane ES-cellen cardioblasten in een suspensiecultuur.

Nadat de cardioblasten de kans hadden gekregen om te hechten, werden de cardioblasten gedurende één week behandeld met nicotinamide; één tot twee weken na het staken van de behandeling met nicotinamide begonnen kloppende cardiomyocyten te verschijnen met een drastische toename in efficiëntie. Zij verschenen als cellulaire clusters die pulseerden met ritmische contracties; spontane multi-lineage differentiatie van cellen die geen IDE-behandeling hadden ondergaan, vertoonde deze kenmerken niet. Cellen binnen de clusters van kloppende cardiomyocyten drukten markers uit die kenmerkend zijn voor cardiomyocyten, waaronder NK X 2.5 en alfa-actinine.

De contracties van de kloppende cardiomyocyten werden via elektrische profielen bevestigd als sterk, ritmisch, gecoördineerd en goed gesynchroniseerd; ze vertoonden regelmatige impulsen die doen denken aan de P-Q-R-S-T-complexen die met oppervlakte-elektroden in klinische elektrocardiogrammen worden waargenomen. Bovendien konden de cardiomyocyten hun sterke contractiliteit meer dan drie maanden behouden. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze worden gebruikt om in ongeveer vijf weken uniform hartvoorlopers en kloppende cardiomyocyten te genereren uit pluripotente menselijke embryonale stamcellen, mits correct uitgevoerd.