Heterogeniteit in kaart brengen van de expressie van eiwitten in tumoren met behulp van kwantitatieve Immunofluorescentie
October 25th, 2011
Hier beschrijven we een methode om moleculaire heterogeniteit kwantificeren in histologische secties van tumor materiaal met behulp van kwantitatieve immunofluorescentie, beeldanalyse, en een statistische maatstaf voor heterogeniteit. De methode is bedoeld voor gebruik in klinische biomarker ontwikkeling en analyse.
Het algemene doel van het volgende experiment is om de expressie van biomarkers nauwkeurig te kwantificeren over hele weefselsecties van menselijk kanker om een numerieke waarde toe te kennen aan de mate van heterogeniteit in eiwitexpressie. Dit wordt bereikt door eerst immunofluorescent gelabelde secties van kankerweefsel te scannen met behulp van een volledige dia-fluorescentiescanner. Vervolgens worden regio's van belang binnen de tumor geselecteerd voor evaluatie.
Vervolgens wordt de expressie van het eiwit van belang binnen de invasieve tumorgebieden gekwantificeerd met behulp van het aqua-analyse geautomatiseerde beeldanalysesysteem. Uiteindelijk kan deze methode worden gebruikt om de expressie van biomarkers in kankerweefsel in kaart te brengen, die vaak zeer heterogeen is over de weefselsectie. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van deze technieken boven traditionele methoden zoals immunohistochemie met behulp van kleur- en metrische visualisatiereagentia is dat immunofluorescentie kwantitatiever en gevoeliger is.
Door deze analytische methoden te koppelen aan een volledige sectie, maakt immunofluorescence-scanning een fijnmazige kaart mogelijk van subtiele variaties in biomarkerexpressie over weefsels. Voor de eerste keer demonstreert Mark Gustafson, een directe directeur van operaties bij het Histo RX-laboratorium, deze procedures. Na microtoom, het in secties snijden van een kankerweefselbiopsie en immunofluorescente kleuring van het specimen voor expressie van de biomarkers van belang, laadt u maximaal vijf dia's van de gekleurde secties in de dia-cassette van de diascanner.
Gebruik vervolgens de interface in de scan scope console. Selecteer voor elke dia een gebied om al het weefsel op de dia te omvatten, ongeacht het kleuringspatroon of andere waarneembare aspecten van het monster. Selecteer vervolgens, met behulp van de scan scope console, eerst een weefselgebied om te evalueren, ideaal binnen het tumorgebied van het weefsel, om de beste representatie te bieden.
Gebruik nu de functie voor automatische belichting in de scan scope console om de belichtingstijd voor elk kanaal te bepalen, samen met de beeldfocus. Gebruik het blauwe diamantje op de scan scope console-afbeelding om een extra gebied te selecteren weg van het weefsel, maar nog steeds binnen het gebied van de dia onder de dekglas, om het achtergrondgebied te definiëren waar de flat field correctie-afbeeldingen zullen worden verkregen. Voeg voor elke filter focuspunten toe aan het weefselgebied, weergegeven door gele vierkantjes, om de beeldacquisitie te optimaliseren. Als de beelden een hoge achtergrond of andere beeldartefacten lijken te hebben, moet het beeldgebied worden verplaatst en moeten nieuwe beelden worden verkregen.
Het weefsel wordt vervolgens gescand en de verkregen digitale dia-afbeeldingen worden automatisch geüpload naar de Aperio-spectrumdatabase. Dubbelklik op de miniatuur-afbeelding voor het spectrumprogramma om de dia voor analyse te selecteren vanuit de lijst met digitale dia's in de spectrumdatabase. Gebruik vervolgens de bijbehorende h en D geannoteerde afbeelding om het gebied van belang op de fluorescentie-afbeelding te annoteren.
Meerdere gebieden van belang, afgebakend met individuele cirkels, kunnen worden geselecteerd op een enkele monster. De geannoteerde afbeeldingen worden automatisch opgeslagen in de spectrumdatabase. Selecteer nu Analyseren vanuit de menubalk bovenaan het scherm wanneer het analysevenster verschijnt, selecteer histo RX aqua-analyse vanuit het vervolgkeuzemenu.
Wanneer u klaar bent om te beginnen, drukt u op de knop Analyseren, een geminimaliseerd consolevenster verschijnt in de Windows-taakbalk dat de voortgang van de overdracht van de afbeeldingen vanuit de Spectrum-database naar de lokale computer weergeeft. Zodra de gegevens zijn overgedragen, start aqua-analyse om een aqua-score te genereren met behulp van een onbegeleide aqua-score-algoritme op basis van de dataclustering van een eerste drempelwaarde van het monster, het pan-cytokeratinebeeldsignaal boven het achtergrondbeeldsignaal. Dit zal het gebruik van de pixels mogelijk maken om een tumormasker te definiëren dat vervolgens kan worden gebruikt voor verdere berekeningen.
Gebruik de hoge expressie pan-cytokeratine-pixels om ook de cytoplasmatische of niet-nucleaire regio's van de tumorcellen te definiëren. Zoals hier te zien is, worden de pixels met een hoog signaal in het DPI-kanaal die zich binnen het tumormasker bevinden geïdentificeerd als nucleair van aard. Als bij het beoordelen velden worden geïdentificeerd die niet geschikt zijn voor scoring vanwege monsters of beeldafwijkingen, worden deze velden geschrapt van de scoring en zullen ze ook een eindresultaat van mislukken produceren.
De resultaten van de aqua-scoring worden weergegeven als een tabel met scores geassocieerd met elke 512 bij 512 pixeltegel in het gebied van belang binnen een monster van geheel weefselsectie, die kunnen worden opgeslagen en gebruikt voor verdere statistische analyse. Deze hematine en eoine gekleurde fotomicrografieën tonen hoe verschillende gebieden van dezelfde eierstokkanker een variabele morfologie kunnen vertonen. De hoge machtsweergave rechtsboven in Figuur B benadrukt cellen met cytoplasmatische klaring en een solide groeipatroon in het bovenste deel van de tumor.
Het onderste deel van het weefsel, vergroot in de rechteronderste sectie van Figuur C, heeft echter een meer homogene eosinofiele cytoplasma en een papillaire groeipatronen. Hier worden heterogeniteits-heatmaps van ER-expressie in een weefselsectie van eierstokkanker getoond vóór en na een chemotherapiebehandeling in respectievelijk de bovenste en onderste panelen. Merk de verandering op van variabele ER-expressie over de sectie met regio's van zowel hoge als lage expressie in de bovenste figuur naar een gelijkmatige verdeling van hoge ER-expressie geïllustreerd in rood in de onderste figuur.
De numerieke weergave van deze verandering wordt links weergegeven door de afname van de Simpsons-index. In deze figuur worden opnieuw heterogeniteits-heatmaps van HER twee in een weefselsectie van eierstokkanker getoond vóór en na therapie zoals te zien is in respectievelijk de bovenste en onderste panelen. Merk opnieuw de verandering van variabele HER twee-expressie over de sectie met regio's van zowel hoge als lage expressie in de bovenste figuur naar een gelijkmatige verdeling van hoge HER twee-expressie in de onderste figuur.
Nogmaals, de Simpsons-index neemt af. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de kwaliteit van de gegevens die door de computationele analyse worden gegen
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het kwantificeren van moleculaire heterogeniteit in histologische tumorsecties met behulp van kwantitatieve immunofluorescentie en beeldanalyse. De benadering heeft tot doel de ontwikkeling van klinische biomarkers te verbeteren door een statistische maat voor heterogeniteit in eiwitexpressie te bieden.
Belangrijkste onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Oncologie
- Immunologie
Achtergrond
- Het kwantificeren van biomarkerexpressie is cruciaal in kankeronderzoek.
- Traditionele methoden zoals immunohistologie hebben beperkingen in gevoeligheid en kwantificering.
- Immunofluorescence biedt een meer kwantitatieve benadering om eiwitexpressie te beoordelen.
- Het begrijpen van heterogeniteit in tumoren kan behandelingsstrategieën informeren.
Doel van het onderzoek
- Om biomarkerexpressie nauwkeurig te kwantificeren in hele weefselsecties.
- Om numerieke waarden toe te kennen aan de mate van heterogeniteit in eiwitexpressie.
- Om de toewijzing van biomarkerexpressie in heterogene kankerweefsels te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Scannen van immunofluorescence gelabelde weefselsecties met behulp van een whole slide scanner.
- Selecteren van interessegebieden binnen de tumor voor evaluatie.
- Kwantificeren van eiwitexpressie met behulp van het aqua analyse geautomatiseerde beeldanalysesysteem.
- Genereren van heterogeniteit hit maps om veranderingen in biomarkerexpressie te visualiseren.
Belangrijkste resultaten
- Demonstreerde het vermogen om variaties in biomarkerexpressie in kankerweefsels in kaart te brengen.
- Toonde veranderingen in expressiepatronen voor en na chemotherapiebehandeling.
- Biedt een kwantitatieve beoordeling van heterogeniteit met behulp van de Simpsons index.
- Benadrukt de voordelen van immunofluorescence ten opzichte van traditionele methoden.
Conclusies
- De methode verbetert het begrip van biomarker heterogeniteit in tumoren.
- Het biedt een meer gevoelige en kwantitatieve aanpak voor klinische toepassingen.
- Deze techniek kan helpen bij de ontwikkeling van gerichte therapieën op basis van biomarkerexpressie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantifying spatial heterogeneity of protein expression in tumors addresses a critical gap in biomarker-driven drug development, where traditional bulk or semi-quantitative methods mask subpopulation-level variability that can influence therapeutic response and resistance. By providing a numerical, spatially resolved measure of biomarker distribution, this method enables more precise patient stratification and supports mechanistic de-risking in target validation and assay development pipelines. Its application to ER and HER2 in ovarian cancer demonstrates direct relevance to endocrine and targeted therapy response prediction, informing go/no-go decisions in preclinical and early clinical programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping biomarker expression heterogeneity as an independent variable in target validation studies.
- Operational Value: Supports functional target validation by revealing whether observed biomarker levels reflect uniform target engagement or are confounded by intratumoral variability.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by identifying targets with homogeneous expression patterns more likely to yield consistent drug responses across tumor regions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated, spatially resolved protein expression maps that serve as quantitative benchmarks for developing and standardizing immunofluorescence-based assays.
- Reproducibility: Uses automated tiling and AQUA scoring to minimize observer bias and ensure consistent quantification across tissue sections and experimental batches.
- Screening Scalability: Produces tile-level data compatible with high-content analysis workflows, enabling scalable evaluation of compound effects on biomarker distribution.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links discovery-phase heterogeneity measurements to preclinical validation by providing a disease-relevant system for assessing biomarker stability before and after therapeutic intervention.
- Mechanistic De-risking: Quantifies changes in ER and HER2 expression heterogeneity pre- and post-chemotherapy, offering a predictive biomarker for therapy-induced phenotypic shifts.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by identifying whether therapeutic effects are uniform or selective, reducing late-stage failure due to unanticipated resistant subclones.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification and preclinical evaluation, particularly for biomarker-driven therapies where spatial expression patterns influence drug efficacy and resistance mechanisms.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling quantification of protein expression heterogeneity as a variable in mechanistic studies of tumor biology and signaling pathways.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs (AQUA scores per tile) that facilitate reproducible compound screening in heterogeneous tumor models.
- Analytics: Generates heterogeneity heat maps and Simpson’s index-derived scores, providing statistical metrics to compare conditions and track expression changes over time or treatment.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by demonstrating how biomarker expression shifts post-treatment, informing pharmacodynamic monitoring strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis platform applicable across cancer types and biomarkers, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in biomarker relevance by reducing mechanistic ambiguity arising from unmeasured intratumoral heterogeneity.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible quantification through automated image analysis and validated staining protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling earlier identification of biomarkers with uniform expression, reducing investment in targets likely to fail due to heterogeneous target availability.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by highlighting biomarkers where heterogeneity correlates with poor prognosis or variable treatment response.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence staining, whole-slide scanning, and AQUA-based image analysis.
- Dependent on high-quality, multiplex immunofluorescence staining and a whole-slide fluorescence scanner with spectral unmixing capabilities.
- Necessitates standardized protocols for region-of-interest selection and background correction to ensure cross-lab comparability.
- Adaptation to alternative model systems (e.g., xenografts, organoids) requires validation of epithelial masking and signal segmentation parameters.
- Practical limitations include dependency on antibody specificity and signal-to-noise ratio, which can affect quantification accuracy in low-abundance targets.
