Heterogeniteit in kaart brengen van de expressie van eiwitten in tumoren met behulp van kwantitatieve Immunofluorescentie

Het algemene doel van het volgende experiment is om de expressie van biomarkers nauwkeurig te kwantificeren in volledige weefselcoupes van menselijke kanker, om zo een numerieke waarde toe te kennen aan de mate van heterogeniteit in eiwitexpressie. Dit wordt bereikt door eerst immunofluorescentieel gelabelde coupes van kankerweefsel te scannen met een fluorescentie-scanner voor volledige preparaten. Vervolgens worden gebieden van interesse binnen de tumor geselecteerd voor evaluatie.

Vervolgens wordt de expressie van het eiwit van belang binnen de invasieve tumorgebieden gekwantificeerd met behulp van het aqua analysis geautomatiseerde beeldanalysesysteem. Uiteindelijk kan deze methode worden gebruikt om de expressie van biomarkers in kankerweefsel in kaart te brengen, wat vaak zeer heterogeen is over de weefselcoupe. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van deze technieken ten opzichte van traditionele methoden, zoals immunohistochemie met kleur- en metrische visualisatiereagentia, is dat immunofluorescentie kwantitatiever en gevoeliger is.

Door deze analytische methoden te koppelen aan een volledige sectie met immunofluorescentiescans, is een fijnmazige mapping van subtiele variaties in biomarker-expressie over weefsels heen mogelijk. Voor het eerst worden deze procedures gedemonstreerd door Mark Gustafson, directeur van de operations bij het Histo RX-laboratorium. Nadat een biopsie van kankerweefsel met een microtoom is gesneden en het monster via immunofluorescentiekleuring is behandeld voor de expressie van de betreffende biomarkers, plaatst u maximaal vijf objectglazen met de gekleurde secties in de cassette van de objectglasscanner.

Gebruik vervolgens de interface in de console van de scan scope. Selecteer voor elk preparaat een gebied dat al het weefsel op het preparaat omvat, ongeacht het kleuringspatroon of andere waarneembare aspecten van het monster. Selecteer daarna via de console van de scan scope eerst een weefselgebied om te evalueren, bij voorkeur binnen het tumorgebied van het weefsel voor de beste representatie.

Bepaal nu met de functie voor automatische belichting van de console van de scan-microscoop de belichtingstijd voor elk kanaal samen met de scherpstelling van het beeld. Gebruik de blauwe ruit op het beeld van de console van de scan-microscoop om een extra gebied te selecteren dat zich buiten het weefsel bevindt, maar nog steeds binnen het gebied van het objectglas onder het dekglas, om het achtergrondgebied te definiëren waar de beelden voor de flat-field-correctie worden vastgelegd. Voeg voor elk filter scherpstellingspunten toe aan het weefselgebied, weergegeven door gele vierkantjes, om de beeldopname te optimaliseren. Indien de beelden een hoge achtergrond of andere beeldartefacten vertonen, moet het beeldgebied worden verplaatst en moeten er nieuwe beelden worden vastgelegd.

Het weefsel wordt vervolgens gescand en de verkregen digitale slide-afbeeldingen worden automatisch geüpload naar de Aperio spectrum-database. Dubbelklik op de miniatuurafbeelding in het spectrum-programma om de slide voor analyse te selecteren uit de lijst met digitale slides in de spectrum-database. Gebruik vervolgens de bijbehorende geannoteerde H&E-afbeelding om het interessegebied op de fluorescentie-afbeelding te annoteren.

Meerdere regio's van belang, afgebakend met individuele cirkels, kunnen worden geselecteerd op één enkel monster. De geannoteerde afbeeldingen worden automatisch opgeslagen in de spectrumdatabase. Selecteer nu Analyse in de menubalk bovenaan het scherm; wanneer het analysevenster verschijnt, selecteert u histo RX aqua analyse uit het uitklapmenu.

Druk op de analyseknop wanneer u klaar bent om te beginnen. In de taakbalk van Windows verschijnt een geminimaliseerd consolevenster waarin de voortgang van de overdracht van de afbeeldingen van de Spectrum-database naar de lokale computer wordt weergegeven. Zodra de gegevens zijn overgedragen, wordt aqua analysis gestart om een aqua-score te genereren met behulp van een ongesuperviseerd aqua-scoringalgoritme, gebaseerd op de dataclustering van een eerste steekproefdrempel: het pan-cytokeratine-afbeeldingssignaal boven het achtergrondafbeeldingssignaal. Hierdoor kunnen de pixels worden gebruikt om een tumormasker te definiëren dat vervolgens kan worden gebruikt voor daaropvolgende berekeningen.

Gebruik de pixels met een hoge expressie van pan-cytokeratine om ook de cytoplasmatische of niet-nucleaire regio's van de tumorcellen te definiëren. Zoals hier te zien is, worden de pixels met een hoog signaal in het DPI-kanaal die zich binnen het tumormasker bevinden, geïdentificeerd als nucleair van aard. Indien bij controle velden worden geïdentificeerd die niet geschikt zijn voor scoring vanwege monsters- of beeldvormingsartefacten, worden deze velden uitgesloten van de scoring en zullen zij ook een definitief resultaat van 'mislukt' opleveren.

De resultaten van de aqua-score worden weergegeven als een tabel met scores gekoppeld aan elke tegel van 512 bij 512 pixels in het interessegebied binnen een monster van een volledige weefselcoupe, welke opgeslagen kunnen worden en gebruikt kunnen worden voor daaropvolgende statistische analyse. Deze met hematoxyline en eosine gekleurde fotomicrografieën tonen aan hoe verschillende gebieden van dezelfde eierstokkanker een variabele morfologie kunnen vertonen. Het sterk vergrote beeld rechtsboven in Figuur B accentueert cellen met cytoplasmatische opheldering en een solide groeipatroon in het bovenste deel van de tumor.

Het onderste deel van het weefsel, vergroot in het gedeelte rechtsonder van Figuur C, vertoont echter een homogener eosinofiel cytoplasma en een papillair groeipatroon. Hier worden in de bovenste en onderste panelen respectievelijk heterogeniteits-heatmaps van de ER-expressie in een weefselcoupe van eierstokkanker vóór en na een chemotherapiebehandeling getoond. Let op de overgang van een variabele ER-expressie over de coupe, met gebieden van zowel hoge als lage expressie in de bovenste figuur, naar een gelijkmatige verdeling van hoge ER-expressie, in rood weergegeven in de onderste figuur.

De numerieke weergave van deze verandering wordt links aangeduid door de afname in de Simpson-index. In deze figuur worden hittekaarten van de heterogeniteit van HER2 in een weefselcoupe van eierstokkanker opnieuw getoond vóór en na therapie, respectievelijk in de bovenste en onderste panelen. Let opnieuw op de overgang van een variabele HER2-expressie over de coupe, met regio's van zowel hoge als lage expressie in de bovenste figuur, naar een gelijkmatige verdeling van hoge HER2-expressie in de onderste figuur.

Opnieuw is te zien dat de Simpsons-index afneemt. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de kwaliteit van de gegevens die door de computationele analyse worden gegenereerd, afhankelijk is van de kwaliteit van de kleuring, en deze moet aan een hoge technische standaard voldoen.