Parallelle plaat flow kamer en Continuous Flow Circuit te endotheliale progenitorcellen Evalueer onder laminaire stroom Afschuifspanning
January 17th, 2012
We beschrijven een methode om onder hechtende cellen aan laminaire stroming shear stress in een steriele continue stroom circuit. De cellen 'hechting, kan morfologie worden bestudeerd door de transparante kamer, monsters verkregen van het circuit voor de metaboliet-analyse en-cellen geoogst na afschuiving blootstelling voor toekomstige experimenten of cultuur.
Het algemene doel van dit videoartikel is om een techniek te beschrijven om adherende cellen te onderwerpen aan laminaire stromingsomstandigheden en de reactie te evalueren op goed meetbare vloeistofschuifspanningen. Dit wordt bereikt door eerst de stromingscircuit zonder de stromingskamer te assembleren. Het circuit omvat de reservoirpuls, demper, harde slang, zachte slang, vierweg stopcocks en aangesloten lure-adapters, evenals een luchtfilter.
De volgende stap is om het circuit te vullen met de gewenste profuse acht, zoals celmedium onder steriele omstandigheden, en vervolgens de pomp te starten om de pulsdemper te vullen en de slang van lucht te ontdoen. Dit wordt gevolgd door het inbrengen van de cel gezeten glijbaan in de bodemplaat van de stromingskamer. De laatste stap van de procedure is de volledige assemblage van het stromingscircuit met de stromingskamer in de lijn.
Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de uitlijning van fluorescent gelabelde endotheliale progenitorchellen onder blootstelling aan vloeistofschuifspanning laten zien via de transparante kamer met behulp van een fluorescerend microscoop Om het functionele gedrag van cellen te bestuderen. Het is vaak noodzakelijk om de in vivo-fysiologie te imiteren door de cellen aan vloeistofschuifspanning te onderwerpen. We hebben een parallelle plaat stromingskamer en een continu stromingscircuit ontworpen, die ons in staat stellen om de cellen onder stromingsomstandigheden te bestuderen en ze door de transparante kamer te observeren.
Deze techniek kan dienen als een waardevol onderzoeksinstrument voor de gebieden van geneeskunde en techniek. Onze stromingskamer maakt intermittente of real-time visualisatie van cellen onder stroming mogelijk met behulp van een rechtopstaande of omgekeerde microscoop. Bovendien stelt het ontwerp van Dr. Ach Nick onderzoekers in staat om cellen op transparante of radiopaque oppervlakken te beeldvormen met behulp van standaard microscooplenzen.
Bovendien kan het als een belangrijk hulpmiddel in de farmacologische onderzoek dienen om het effect van geneesmiddelen op cellen onder stromingsomstandigheden te bestuderen. Visualisatie van de opstelling is van cruciaal belang omdat een aantal van de stappen moeilijk te beheersen zijn door alleen een protocol te lezen. Ik zal stapsgewijze instructies geven over hoe u de stromingskamer en stromingscircuit kunt instellen die gewoonlijk wordt gebruikt in het laboratorium van Dr. Ock Next Om het stromingscircuit te assembleren.
Begin met het bevestigen van een segment van 36 inch harde slang aan het ene uiteinde van een pulsdemper aan het andere uiteinde. Bevestig een segment van 18 inch zachte slang. Plaats een mannelijke lure-adapter van een achtste inch aan het einde van de 18 inch zachte slangsectie.
Verbind de mannelijke lure met een vrouwelijke lure-adapter van een achtste inch. Bevestig de vrouwelijke lure aan een nieuw segment van 18 inch zachte slang. Boor drie gaten in een glasbekerdop van 250 milliliter.
Om de slang te passen, steekt u een segment van 1,5 inch zachte slang in één gat. Als luchtventilatie. Steek de vrije uiteinden van de harde en zachte slang door de andere twee gaten in de dop in de glazen fles van 250 milliliter, die als reservoir zal fungeren.
Zorg ervoor dat de harde slang de bodem van het reservoir bereikt. Het behoud van steriliteit gedurende de installatie van het circuit is cruciaal voor het succes van deze procedure. Daarom moeten alle onderdelen worden gesteriliseerd en moet u gedurende de hele procedure steriele handschoenen dragen.
Naast de geassembleerde onderdelen, moeten deze onderdelen worden gesteriliseerd. Eén volledige stromingskamer, drie bij twee inch segmenten van zachte slang, een mannelijke en een vrouwelijke, een achtste inch lure-adapter, vier halve inch platkopschroeven, 6 5 16 inch, acht 30 seconden. Inch tracks per inch, platkopschroeven, een paar pincetten, één glazen glijbaan en twee handdoeken gesteriliseerd door stoom.
Steriliseren bij 121 graden Celsius gedurende 60 minuten. Plaats de stromingskamer van het stromingscircuit, de vier op vier weg stopcocks een op een weg, stopcock en alle gesteriliseerde onderdelen op dit steriele veld. Terwijl u steriele handschoenen draagt, verbindt u de twee vierweg stopcocks.
Plaats doppen op de open monsterpoorten. Haal de mannelijke en vrouwelijke lure-adapters los die de twee zachte slangsegmenten van het stromingscircuit verbinden en de verbonden stopcocks invoegen. Bevestig de zachte slang die in het reservoir is ingebracht in een spuit van 30 milliliter en verwijder de spuitpomp.
Vul de fles met 125 milliliter EPC-medium. Verbind de zachte slang opnieuw met de stopcock. Plaats een steriele spuitfilter in de luchtopening.
Breng nu het stromingscircuit over naar een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius, 5% kooldioxide. Klem de harde slang in de master flex rollerpompkop die is geïndiceerd voor gebruik met dit type coal Palmer-slang. Zorg ervoor dat de slang niet overlapt met de montagesporen van de rolpomp.
Markeer de slang waar deze de pompkop verlaat aan beide zijden met een markeerstift. Nadat u ervoor hebt gezorgd dat alle stopcocks dicht zijn naar de monsterpoorten en open zijn langs het stromingscircuit, start u de pomp. Controleer de stromingsrichting.
De PERFUSE acht moet vanuit het glazen reservoir door de harde slang in de demper gaan. Gebruik voor de assemblage van de stromingskamer steriele handschoenen om één segment van twee inch zachte slang te verbinden met een vrouwelijke lure-adapter van een achtste inch. Verbind een ander segment van twee inch zachte slang met een mannelijke lure-adapter van een achtste inch.
Bevestig de twee inch zachte slang met vrouwelijke lure-adapter aan de instroompoort en de twee inch zachte slang met mannelijke lure-adapter aan de uitstroompoort. Bevestig vierweg stopcocks aan beide van deze lure-adapters. Verbind het resterende twee inch zachte slangstuk aan de zijpoortconnector die uit de bubbelval komt en bevestig een eenweg stopcock met behulp van steriele pincetten.
Verwijder de cel gezaaide glijbaan uit de celcultuurvat en plaats deze in de uitsparing op de bodemplaat van de stromingskamer. Zorg ervoor dat de glijbaan wordt geplaatst met de zijde van de gezeten cel naar b
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode om adhesieve cellen bloot te stellen aan laminaire stromingsschuifspanning met behulp van een steriele continue stroomkringloop. De techniek maakt het mogelijk om celadhesie en morfologie te bestuderen via een transparante kamer, waardoor metabolietenanalyse en celoogst na blootstelling mogelijk zijn.
Belangrijkste onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Vloeistofmechanica
- Biomedische techniek
Achtergrond
- Het begrijpen van celgedrag onder schuifbevlasting is cruciaal voor het nabootsen van in vivo-omstandigheden.
- Vloeistofschuifspanning beïnvloedt verschillende cellulaire functies en reacties.
- Het ontwerp van een parallelle plaatstroomskamer vergemakkelijkt de studie van deze effecten.
- Visualisatie van cellen onder stromingsomstandigheden is essentieel voor nauwkeurige analyse.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het toepassen van schuifbevlasting op adhesieve cellen.
- Om de cellulaire reactie op vloeistofschuifspanning kwantitatief te evalueren.
- Om een protocol te bieden voor onderzoekers in geneeskunde en techniek.
Gebruikte methoden
- Samenstelling van een stromingskringloop inclusief verschillende slangen en stopkleppen.
- Vullen van de kringloop met celmedium onder steriele omstandigheden.
- Inbrengen van een celgezaaide dia in de stroomskamer voor observatie.
- Gebruik van fluorescente microscopie om celaflijning onder schuifbevlasting te visualiseren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle aflijning van fluorescent gelabelde endotheliale voorlopercellen werd waargenomen.
- Het stroomskamerontwerp maakt real-time visualisatie van cellulaire reacties mogelijk.
- Resultaten tonen de belangrijkheid van schuifbevlasting bij het bestuderen van celgedrag.
- De methode kan worden toegepast in de farmacologie om de effecten van geneesmiddelen op cellen te beoordelen.
Conclusies
- Deze techniek is een waardevol hulpmiddel voor onderzoekers die cellulaire reacties op mechanische krachten bestuderen.
- Het verbetert het begrip van celgedrag in fysiologische omstandigheden.
- Het protocol kan worden aangepast voor verschillende celtypen en experimentele omstandigheden.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative evaluation of endothelial progenitor cells (EPCs) under controlled laminar flow shear stress addresses a critical gap in modeling vascular biology for early-stage drug discovery. This platform enables reproducible assessment of cell adhesion, morphology, and metabolite secretion under physiologically relevant mechanical forces, supporting predictive confidence in vascular target validation. The scalable recovery of viable cells and secreted factors positions this method as a reusable asset for portfolio-wide mechanistic de-risking and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of mechanosensitive pathways in EPCs and other adherent cell types.
- Supports functional target validation by quantifying cellular alignment and secreted metabolites under defined shear stress.
- Facilitates biological de-risking by mimicking in vivo vascular conditions in a controlled ex vivo system.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, sterilizable platform for reproducible cell-based assays under flow.
- Allows for high-yield recovery of cells and perfusate for downstream molecular analyses.
- Enables quantitative readouts of cell morphology, adhesion, and metabolite secretion for assay optimization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro mechanical stimulation with disease-relevant vascular biology for translational biomarker studies.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling collection of RNA, DNA, and secreted factors post-flow.
- Reduces translational risk by modeling physiologically relevant shear stress responses in human and animal EPCs.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven testing of vascular targets, assay development, and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of mechanotransduction and endothelial function under controlled shear stress.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for cell adhesion, morphology, and metabolite secretion.
- Analytics: Facilitates collection and analysis of perfusate for secreted metabolites such as nitrite, supporting comparative studies.
- Translational Research: Enables alignment of in vitro findings with in vivo vascular responses for biomarker validation.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, sterilizable platform adaptable to multiple cell types and experimental needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in vascular target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Streamlines assay standardization, reproducibility, and high-throughput sample recovery.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing robust, physiologically relevant data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of vascular and mechanosensitive targets across programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile technique and flow system assembly.
- Needs access to incubators, roller pumps, and fluorescence microscopy infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of flow rates, chamber dimensions, and sample handling.
- Adaptable to various adherent cell types, but optimization may be needed for cell-specific responses.
- Careful management of air bubbles and leak prevention is essential for experimental success.
