Name: Roterende celkweek systemen for Human Cultuur van de Cel: Human trofoblast cellen als een model (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Leer hoe je een roterend celkweeksysteem gebruikt voor 3D-celculturen van humane trofoblastcellen. Deze methode bootst in vivo-celkinetiek na en verbetert de expressie van differentiatiemarkers voor biomedisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de US National Institutes of Health NIH subsidie ​​/ NICHD # HD051998 (tot CAM).

1. Collageen Bead Voorbereiding <ol><li> Voorafgaand aan het laden van EVTS voor 3-D celkweek, moet men de voorbereiding van de Cytodex-3 microdrager kralen: <ol><li> Weeg de juiste hoeveelheid van Cytodex-3 kralen die nodig zijn voor het experiment. Dit protocol is aangepast voor de 10 ml RCC's schip, waarbij 0,05 g van kralen nodig zijn. Voor een 50 ml RCC's schip, overeenkomstig schaal. In een 50ml autoclaveerbaar conische buis, 250 mg Cytodex-3 kralen mengen met 12ml Dulbecco fosfaatgebufferde oplossing (DPBS). Dit bedrag is voldoende voor 5 RCC schepen. </li></ol></li><li> Zorg voor voldoende volume aanwezig is in de conische buis, zoals de autoclaaf proces zal resulteren in verdamping. Losjes dop van de tube en de autoclaaf gedurende 10 minuten bij 110 ° C. </li><li> Verwijder de conische buis bij de voltooiing van de autoclaaf cyclus en laat de Cytodex-3 bead-oplossing om af te koelen. </li><li> Nadat de conische buis is afgekoeld tot kamertemperatuur, gebruik steriele techniek om het totale volume 12.5mL met 1X DPBS. </li><li> Cap en opslaan van de voorbereide Cytodex-3 kralen bij kamertemperatuur. Laat de kralen bereid te zwellen en voorafgaand afkoelen tot kamertemperatuur te gebruiken. De bovenstaande bereiding van Cytodex-3 kralen zorgt voor vijf 10mL RCC schepen. We hebben waargenomen dat langdurige opslag van Cytodex-3 kralen bij kamertemperatuur zal resulteren in verminderde prestaties, als het collageen zal destabiliseren na ongeveer een maand. Cytodex-3 kralen variëren in grootte 133 tot 215 micrometer. </li></ol> 2. Voorbereiding media <ol><li> Bereid 1L van de RCC's geoptimaliseerde GTSF-2-media (aangepast van 22), die bestaat uit 40% MEM alpha, plus voedingssupplementen en 60% L-15 Leibovitz's media (aangepast van 22). De eerste, 400ml voor te bereiden in het totale volume van de alfa-MEM aangevuld met: 21.2mM natriumbicarbonaat 0,06% pepton Fructose 0,7 mm 1,4 mm Galactose Glucose 5,6 mm 1% HEPES 1% L-glutamine 0,5% ITS 10% FBS </li><li> Ter voorbereiding op een voorraad oplossing van ITS en los op in 5 ml steriel aangezuurd H 2 O bereid door toevoeging van azijnzuur (ca. 0.05mL). Swirl te ontbinden, volgen met 45 ml steriel water. </li><li> Weeg genoeg L-15 Leibovitz's poeder voor 600ml medium door oplossing in weefselkweek klasse H 2 O. </li><li> Breng het totale volume van de cel cultuur medium tot 1L met L-15-medium Leibovitz's. Filter-steriliseer en bewaar bij 4 ° C in het donker. Afzonderlijk toevoegen 1% penicilline-streptomycine aan elk aliquot van medium gebruikt. </li><li> Veel media formuleringen anders dan GTSF-2-media zijn met succes getest in de RCC. Individuele laboratoria moeten zelf bepalen welk medium optimaal is voor het experiment wordt uitgevoerd. </li></ol> 3. Cellen en Bead incubatie <ol><li> Propageren van de EVTS tot ~ 80% confluentie, trypsinize en tellen met behulp van celkweek aanvaarde praktijken. </li><li> Te schorten 1x10 6 EVTS in 4 ml warmed media. </li><li> Voorzichtig mengen voorbereid Cytodex-3 kralen. Met behulp van steriele technieken, verwijder 2,5 ml van de bereide kralen met behulp van een brede tip, 10ml serologische pipet en over te dragen aan een ongebruikte 15 ml conische buis. Merk op dat er een klein verlies van kralen zijn als dat zij hechten aan de pipet. </li><li> Laat de Cytodex-3 kralen om zich te vestigen op de bodem van de buis. Na de sedimentatie, gebruik maken van een pipet om de bovenste laag van DPBS te verwijderen zonder het verstoren van de Cytodex-3 kralen. </li><li> Meng de 1x10 6 bereid EVTS in de media met de bereide Cytodex-3 kralen. </li><li> Incubeer de cel-kraal mengsel bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Periodiek voorzichtig mengen. Incubeer gedurende nog eens 30 min bij 37 ° C en 5% CO 2. Periodiek voorzichtig mengen. </li></ol> 4. Het laden van de RWV <ol><li> In een laminar flow kast, haal een 10 ml RCC's uit de verpakking en plaats het in een steriele, 6-well cultuur plaat voor stabiliteit. Zie Figuur 1 voor een label diagram van de RCCS. </li><li> Haal de grote stop van de haven. </li><li> Breng het totale volume van de incuberen cel-kraal mengsel 10mL met verwarmde media. </li><li> Laad de cel / kraal-mengsel in de RCC's door de grote poort. De RCC moet worden gekanteld in een hoek van 45 ° (grote poort up) tijdens het laden om te helpen bij het verwijderen van mogelijke luchtbellen. Voorkom het opbouwen van positieve druk door het vullen van het schip langzaam en gestaag. </li><li> Vervang de stop in de grote haven. </li><li> Verwijder de zuigers van de 3-mL spuiten en plaats de lege spuiten op de kleine havens. Voeg 1-3 ml van de media om elke spuit. Open langzaam de twee kleppen. Plaats de spuit op de zuigers spuiten zachtjes. Voeg media van een spuit totdat alle luchtbellen worden verwijderd uit het inwendige. </li><li> Pak de RCC's en tik dan zachtjes tijdens het draaien het voor u om te controleren op luchtbellen. Als er luchtbellen, moet je ze uit de kamer, zoals luchtbellen zal interfereren met de vorming of cel aggregaten en de invoering van schuifkrachten. Verwijder de luchtbellen door het draaien van de RCC's totdat de bubbels onder de kleine haven. Vervolgens voorzichtig naar beneden druk op de spuit aan de andere kant van de bubbels kracht in de haven en uit de kamer. </li><li> Sluit een kant-poort. Druk voorzichtig op de andere spuit zuiger om een ​​kleine hoeveelheid van de positieve druk te introduceren in het vat, waardoor luchtbellen voorkomt de vorming. Sluit tweede klep. </li><li> Laad de RCC op de rotor. Start de rotatie bij 19rpm in een 37 ° C CO 2 incubator. </li></ol> 5. Het veranderen van de Media <ol><li> Wijzig de media om de andere dag voor de eerste drie dagen, daarna elke dag daarna. </li><li> Zet de rotor en verwijder de RCC. Trek de zuigers tot enkele zuigkracht te creëren, het spuiten te verwijderen uit elke kleine haven en de RCC plaats op een hoek, zodat de kralen tegenovergestelde van de grote haven af ​​te wikkelen. </li><li> Nadat de kralen zijn allemaal gevestigd, opent een van de kleine kleppen enlaat de media uit stroom van de RCC's en in een afvalcontainer. Verwijder de 2 / 3 van de media op deze manier. Zorg ervoor dat u niet verstoren van de kralen en niet weggooien geen aggregaten. </li><li> Sluit de kleine klep en open de grote poort. Voeg media terug in de RCC's door de grote poort. Vervang de stop in de grote haven. </li><li> Herhaal de stappen 4,6 tot 4,9. </li><li> Als de aggregaten in omvang toenemen, moet je de rotatie snelheid te verhogen om ze in suspensie te houden ten alle tijden, bij voorkeur in een kleine bloedsomloop patroon met optimale snelheid. Over het algemeen, verhoging van de snelheid tussen 0.3-0.7 tpm na elke voeding als de aggregaten zichtbaar beginnen te groeien. </li></ol> 6. Verzamelen gepropageerd Cellen <ol><li> Verwijder de RCC's uit de rotor. Haal de spuiten uit elke kleine haven en plaats de RCC's op een hoek, zodat de korrels kunnen vestigen tegenovergestelde van de grote haven. </li><li> Nadat de kralen zijn allemaal gevestigd, opent een van de kleine kleppen en laat de media weg te laten stromenvan de RCC's en in een afvalcontainer. Verwijder de 1 / 3 van de media op deze manier. </li><li> Sluit de kleine klep en open de grote poort. Zwenk het schip naar de aggregaten uiteen te drijven weer in de oplossing. Lege vloeibare mengsel in een steriele 50 ml conische buis. Laat de verzamelde aggregaten in de conische buis af te wikkelen voordat u supernatant grondig wassen van de cultuur schip naar herstel van de aggregaten te maximaliseren. De aggregaten kan worden gebruikt voor downstream assays onmiddellijk, zoals flow cytometrie, invasie assays, immunofluorescentie en anderen. </li></ol> 7. Representatieve resultaten Een voorbeeld van EVT-achtige cellen (SGHPL-4 trofoblast cellijn) geteeld in de RCC op Cytodex-3 kralen is weergegeven in Figuur 2. De EVT-achtige cellijn toont projecties uitbreiding van uit de buurt van de belangrijkste cluster en verbonden aan de aangrenzende clusters. Veel van de kralen zijn volledig bedekt met propageren van cellen. Eenmaal uit de RCC's en plated op een extracellulaire matrix, de EVT-achtige 3-D volwassen cellen binnen te dringen agressief en / of migreren (Figuur 3). RT-PCR gegevens bevestigen de verhoogde expressie van MMP's te zien in 3-D aggregaten, in tegenstelling tot de traditionele celcultuur monolagen (figuur 4). Interessant is dat genen niet geassocieerd met invasie ook gereguleerd in het RCC (tabel 1) en kan hulp bij het ​​afbakenen van gebieden zoals het immuunsysteem interacties met binnendringende trophoblasts cellen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3367/3367fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Cartoon voorstelling van de Rotating Cultuur van de Cel System (RCC). <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3367/3367fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Phase contrast microfoto van een vertegenwoordiger aggregaat na 5 dagen groei in een RCC. Pijlen geven binnendringende cellen en * de Cytodex-3 microdrager kralen. <imgalt src='"/' files></imgalt> Figuur 3. RCC Grown aggregaten werden ingebed in fibrine gels. Invasie via de fibrine-gel werd al als (A) 24 uur na fibrine inbedding en (B) voortgezet door middel van 48 uur. Pijlen geven binnendringende cellen en * de Cytodex-3 microdrager kralen (Aangepast, met toestemming, uit Ref. 7). <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3367/3367fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Vergelijkende gelatine zymogram van de monolaag en RCC's gepropageerd SGHPL-4 EVT-achtige cellen. Pro-en actieve vormen van MMP-2 en MMP-9 werden afgescheiden door de RCC uitgegroeid trofoblast cellen (Aangepast, met toestemming, uit Ref. 7). <img alt="Tabel 1" src="/files/ftp_upload/3367/3367table1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabel 1"> Tabel 1. Samenvatting van de microarray resultaten uit SGHPL-4 cellen gekweekt in een RCC (Aangepast, met toestemming, uit Ref. 7). <ol class="lalpha"><li vouw inductie in de aggregaten werd berekend als volgt: genormaliseerde waarde monlayer gen waarde.><li> Geeft aan genen die waren onder de detectiegrens in monolagen. </li></ol>

<ol><li>Knofler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+growth+factors+and+signalling+pathways+controlling+human+trophoblast+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion.</a> Int. J. Dev. Biol. 54, 269-269 (2010).</li>
<li>Cartwright, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodelling+at+the+maternal-fetal+interface%3A+relevance+to+human+pregnancy+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Remodelling at the maternal-fetal interface: relevance to human pregnancy disorders.</a> Reproduction. 140, 803-803 (2010).</li>
<li>Harris, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFPA+Gabor+Than+Award+lecture%3A+Transformation+of+the+spiral+arteries+in+human+pregnancy%3A+key+events+in+the+remodelling+timeline%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">IFPA Gabor Than Award lecture: Transformation of the spiral arteries in human pregnancy: key events in the remodelling timeline.</a> Placenta. 32, Suppl 2. S154-S154 (2011).</li>
<li>Whitley, G. S., Cartwright, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trophoblast-mediated+spiral+artery+remodelling%3A+a+role+for+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Trophoblast-mediated spiral artery remodelling: a role for apoptosis.</a> J. Anat. 215, 21-21 (2009).</li>
<li>Apps, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+profile+of+first+trimester+villous+and+extravillous+human+trophoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression profile of first trimester villous and extravillous human trophoblast cells.</a> Placenta. 32, 33-33 (2011).</li>
<li>Bilban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trophoblast+invasion%3A+assessment+of+cellular+models+using+gene+expression+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Trophoblast invasion: assessment of cellular models using gene expression signatures.</a> Placenta. 31, 989-989 (2010).</li>
<li>LaMarca, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+growth+of+extravillous+cytotrophoblasts+promotes+differentiation+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional growth of extravillous cytotrophoblasts promotes differentiation and invasion.</a> Placenta. 26, 709-709 (2005).</li>
<li>Jovanovic, M., Stefanoska, I., Radojcic, L., Vicovac, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-8+%28CXCL8%29+stimulates+trophoblast+cell+migration+and+invasion+by+increasing+levels+of+matrix+metalloproteinase+%28MMP%292+and+MMP9+and+integrins+alpha5+and+beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Interleukin-8 (CXCL8) stimulates trophoblast cell migration and invasion by increasing levels of matrix metalloproteinase (MMP)2 and MMP9 and integrins alpha5 and beta1.</a> Reproduction. 139, 789-789 (2010).</li>
<li>Husslein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+regulation+and+functional+characterization+of+matrix+metalloproteinase-3+of+human+trophoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Expression, regulation and functional characterization of matrix metalloproteinase-3 of human trophoblast.</a> Placenta. 30, 284-284 (2009).</li>
<li>Barrila, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+3D+cell+culture+models%3A+using+the+rotating+wall+vessel+to+study+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Organotypic 3D cell culture models: using the rotating wall vessel to study host-pathogen interactions.</a> Nat. Rev. Microbiol. 8, 791-791 (2010).</li>
<li>Hammond, T. G., Hammond, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+suspension+culture%3A+the+rotating-wall+vessel%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel.</a> Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 281, 12-12 (2001).</li>
<li>Unsworth, B. R., Lelkes, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+tissues+in+microgravity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Growing tissues in microgravity.</a> Nat. Med. 4, 901-901 (1998).</li>
<li>Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue-specific+signaling+and+organ+function+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions.</a> J. Cell. Sci. 116, 2377-2377 (2003).</li>
<li>Bentrup, H. önerzu, K, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+organotypic+models+of+human+colonic+epithelium+to+study+the+early+stages+of+enteric+salmonellosis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes.+Infect%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis.</a> Microbes. Infect. 8, 1813-1813 (2006).</li>
<li>Carterson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A549+lung+epithelial+cells+grown+as+three-dimensional+aggregates%3A+alternative+tissue+culture+model+for+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> Infect. Immun. 73, 1129-1129 (2005).</li>
<li>Myers, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closing+the+phenotypic+gap+between+transformed+neuronal+cell+lines+in+culture+and+untransformed+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Closing the phenotypic gap between transformed neuronal cell lines in culture and untransformed neurons.</a> J. Neurosci. Methods. 174, 31-31 (2008).</li>
<li>Hjelm, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+three-dimensional+organotypic+human+vaginal+epithelial+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a three-dimensional organotypic human vaginal epithelial cell model.</a> Biol. Reprod. 82, 617-617 (2010).</li>
<li>Straub, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+culture+infectivity+assay+for+human+noroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">In vitro cell culture infectivity assay for human noroviruses.</a> Emerg. Infect. Dis. 13, 396-396 (2007).</li>
<li>Nickerson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tissue+assemblies%3A+novel+models+for+the+study+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis.</a> Infect. Immun. 69, 7106-7106 (2001).</li>
<li>Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+tissue+culture+model+for+the+study+of+attach+and+efface+lesion+formation+by+enteropathogenic+and+enterohaemorrhagic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli.</a> Cell. Microbiol. 7, 1771-1771 (2005).</li>
<li>Sainz, B., TenCate, V., Uprichard, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+Huh7+cell+culture+system+for+the+study+of+Hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virol.+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional Huh7 cell culture system for the study of Hepatitis C virus infection.</a> Virol. J. 6, 103-103 (2009).</li>
<li>Lelkes, P. I., Ramos, E., Nikolaychik, V. V., Wankowski, D. M., Unsworth, B. R., Goodwin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTSF-2%3A+a+new%2C+versatile+cell+culture+medium+for+diverse+normal+and+transformed+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell.+Dev.+Biol.+Anim%22%5BJournal%5D)">GTSF-2: a new, versatile cell culture medium for diverse normal and transformed mammalian cells.</a> In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 33, 344-344 (1997).</li>
<li>Lelkes, P. I., Ramos, E., Nikolaychik, V. V., Wankowski, D. M., Unsworth, B. R., Goodwin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTSF-2%3A+a+new%2C+versatile+cell+culture+medium+for+diverse+normal+and+transformed+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell.+Dev.+Biol.+Anim%22%5BJournal%5D)">GTSF-2: a new, versatile cell culture medium for diverse normal and transformed mammalian cells.</a> In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 33, 344-344 (1997).</li>
<li>GE Healthcare. Microcarrier Cell Culture - Principles and Methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Handbooks%22">Handbooks</a>. , Available from: 
		
	 <a target="_blank" href="http://www.gelifesciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/service_and_support~documents_and_downloads~handbooks">http://www.gelifesciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/service_and_support~documents_and_downloads~handbooks</a> (2005).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

De cultuur hier gepresenteerde techniek biedt onderzoekers met zeer invasieve EVT-achtige cellen. Het is nu erkend dat een verlies van differentiatie optreedt in monolagen als gevolg van remming van de cellulaire reacties op chemische en moleculaire signalen in drie dimensies (apicale, basale en laterale celoppervlak) 10,13. Deze techniek geeft de kenmerken vermeld in de baarmoeder op de binnenvallende EVT cellen. Aangezien de procedure nabootst conventionele monolaag weefselkweek tijd kinetiek, maar...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Cytodex microdrager kralen </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3275 </td><td></td></tr><tr><td> Roterende celcultuur (RCC) </td><td> Synthecon </td><td> RCC-D </td><td> Inclusief rotor basis, voeding, 4 wegwerp RCC-eenheden </td></tr><tr><td> RCC Wegwerp Units </td><td> Synthecon </td><td> Contact Synthecon </td><td></td></tr><tr><td> 3 ml Luer-Lock-tip spuit </td><td> BD </td><td> 309585 </td><td></td></tr><tr><td> 10ml brede-tip serologische pipet </td><td> BD </td><td> 357504 </td><td></td></tr><tr><td> MEM Alpha </td><td> Invitrogen </td><td> 12561-072 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitz&#39;s L-15-medium, poeder </td><td> Invitrogen </td><td> 41300-039 </td><td></td></tr><tr><td> H 2 O, endotoxine vrij </td><td> Visser </td><td> MT-25-055-CM </td><td></td></tr><tr><td> Natriumbicarbonaat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S-7795 </td><td></td></tr><tr><td> Pepton </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1420-100 </td><td></td></tr><tr><td> Fructose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F3510-100 </td><td></td></tr><tr><td> Galactose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G5388-100 </td><td></td></tr><tr><td> Glucose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7528-250 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> Insuline-transferrine-Natrium Seleniet (ITS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I1884 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 10437 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilline-streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td></td></tr></tbody></table>

roterende celkweek systemen for human cultuur van de cel: human trofoblast cellen als een model

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Het gebied van human trofoblast onderzoek helpt bij het begrijpen van de complexe omgeving die tijdens placentatie. Vanwege de aard van deze studies, de mens in vivo experimenten is onmogelijk. Een combinatie van primaire culturen, Explantatie culturen en trofoblast cellijnen een ondersteuning van ons begrip van de invasie van de baarmoederwand 2 en vermaken van de baarmoeder spiraalvormige arteriën 3,4 door extravillous trofoblast cellen (EVTS), die nodig is voor een succesvolle invoering van de zwangerschap. Ondanks de rijkdom aan kennis uit dergelijke modellen, wordt aanvaard dat in vitro celcultuur modellen met EVT-achtige cellijnen weer te geven cellulaire eigenschappen veranderd in vergelijking met hun tegenhangers in vivo 5,6. Cellen gekweekt in de roterende celkweek systeem (RCC&#39;s) display morfologische, fenotypische en functionele eigenschappen van de EVT-achtige cellijnen die beter na te bootsen onderscheid in uTero EVTS, met een verhoogde expressie van genen bemiddelen invasie (bijv. matrix (MMP&#39;s)) en trophoblast differentiatie 7,8,9. De Saint Georges Hospital placenta cellijn-4 (SGHPL-4) (vriendelijk geschonken door dr. Guy Whitley en Dr Judith Cartwright) is een EVT-achtige cellijn die werd gebruikt voor het testen in het RCC. Het ontwerp van de RCC&#39;s cultuur schip is gebaseerd op het principe dat organen en weefsels functie in een drie-dimensionale (3-D)-omgeving. Door de dynamische cultuur omstandigheden in de tank, met inbegrip van voorwaarden van fysiologisch relevante shear, cellen gekweekt in drie dimensies vorm aggregaten op basis van natuurlijke cellulaire affiniteiten en differentiëren naar organotypische weefsel-achtige samenstellingen 10,11,12. Het onderhoud van een vloeistof baan zorgt voor een low-shear, lage turbulentie omgeving die lijkt op omstandigheden in vivo. Sedimentatie van de gekweekte cellen wordt tegengegaan door het aanpassen van de rotatiesnelheid van de RCC&#39;s om een ​​constante vrije val van de cellen te verzekeren. Gasuitwisseling gebeurt door middel van een permeabel membraan hydrofoob zich aan de achterkant van de bioreactor. Net als hun ouders weefsel in vivo, RCC volwassen cellen zijn in staat om chemische en moleculaire gradiënten reageren in drie dimensies (dat wil zeggen op hun apicale, basale en laterale oppervlakken), omdat ze worden gekweekt op het oppervlak van de poreuze microdrager kralen. Wanneer ze groeien als twee-dimensionale monolagen op ondoordringbare oppervlakken, zoals plastic, worden de cellen verstoken van deze belangrijke communicatie op hun basale oppervlak. Derhalve zijn de ruimtelijke beperkingen die worden opgelegd door de omgeving diepgaand invloed hebben op hoe cellen zin en decoderen signalen van de omringende micro-omgeving, dus impliceren een belangrijke rol voor de 3-D milieu 13. We hebben de RCC&#39;s om biologisch zinvolle 3-D modellen van de verschillende menselijke epitheelweefsels 7,14,15,16 ingenieur. Inderdaad, veel eerdere rapporten demook aangetoond dat cellen gekweekt in de RCC kan fysiologisch relevante fenotypen die niet mogelijk was geweest met de andere modellen 10,17-21 nemen. Kortom, cultuur in de RCC is een eenvoudige, reproduceerbare, high-throughput platform dat een groot aantal van gedifferentieerde cellen die vatbaar zijn voor een aantal experimentele manipulaties biedt. In het volgende protocol, met behulp van EVTS als een voorbeeld hebben we een duidelijke beschrijving van de stappen die nodig zijn om driedimensionaal cultuur hechtende cellen in het RCC.

Traditionele, tweedimensionale celcultuur technieken vaak resulteren in veranderde eigenschappen met betrekking tot de differentiatie markers, cytokines en groeifactoren. Drie-dimensionale celkweek in het draaiende celkweek systeem (RCC&#39;s) herstelt expressie van vele van deze factoren zoals hier afgebeeld met een extravillous trophoblast cellijn.

Roterende celkweek systemen for Human Cultuur van de Cel: Human trofoblast cellen als een model

Het vakgebied van het onderzoek naar menselijke trofoblasten draagt bij aan het begrip van de complexe omgeving die tijdens de placentatie wordt tot stand gebracht. Vanwege de aard van deze ...

Deze procedure maakt gebruik van een driedimensionaal celcultuursysteem om in vivo celkinetiek na te bootsen. Begin met het incuberen van cellen met beads die zijn gecoat met collageen ENC. Laad vervolgens de cellen en beads in een roterend celcultuursysteem en kweek 3D-celaggregaten in een omgeving met lage afschuiving en lage turbulentie.Oogst tot slot de cellen voor gebruik in downstream-applicaties om deze te vergelijken met de genexpressie en cellulaire differentiatie van cellen die in een typische monolaag zijn gekweekt. De resulterende 3D-culturen vertonen celkinetiek en gedrag dat sterk lijkt op de in vivo situatie.We hebben het RCCS gebruikt om biologisch relevante 3D-modellen van diverse menselijke epitheelweefsels te ontwikkelen. Dr. Jessica Warner, een voormalig promovendus in het laboratorium van mijn collaborator, Dr. Sydney Morris, zal nu deze procedure demonstreren met EVT-cellen. Autoclaveer 250 mg Cytodex 3 microcarrier-beads in 12 mL DPBS in een conische buis van 50 mL. Laat de voorbereide beads zwellen en afkoelen tot kamertemperatuur.Breng vervolgens onder steriele omstandigheden het totale volume aan tot 12,5 milliliters. Oogst nu met behulp van DPBS een 80% confluente cultuur van extra villus trofoblastcellen. Meng de voorbereide cytodex three-beads voorzichtig door middel van trypsine-digestie en breng met een serologische pipette van 10 milliliters met een brede tip 2,5 milliliters over naar een conische buis van 15 milliliters.Nadat de CytoDex 3-beads naar de bodem van de buis zijn gezakt, wordt de bovenste laag DPBS weggepipetteerd zonder de CytoDex 3-beads te verstoren. Meng vervolgens de EVT-cellen met de CytoDex 3-beads.Incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur met periodiek mengen, gevolgd door 30 minuten in een celkweekincubator met af en toe mengen. Plaats een 10 milliliter RCCS in een steriele six-well kweekplaat en verwijder de grote stop. Voeg nu verwarmd GTSF two medium toe om het totale volume van het celkralenmengsel aan te vullen tot 10 milliliter en breng dit via de grote poort in de RCCS aan.Vervang de grote poortstop en sluit de kleine poorten. Plaats vervolgens lege spuiten van 3 mL op de twee kleine poorten. Voeg medium toe aan elke spuit.Open de twee kleppen langzaam en plaats de spuitzuigers terug. Voeg voorzichtig medium toe vanuit één spuit totdat alle luchtbellen uit de binnenkamer zijn verdreven. Pak de RCCS op en tik voorzichtig tegen de zijkant terwijl u deze draait om te controleren op luchtbellen.Verwijder de resterende luchtbellen door de RCCS te draaien totdat de bellen zich onder de kleine poort bevinden. Druk vervolgens voorzichtig op de spuit aan de tegenovergestelde zijde om de bellen in de poort en uit de kamer te dwingen. Ga verder door één zijpoort te sluiten en voorzichtig op de zuiger van de andere spuit te drukken om een kleine hoeveelheid positieve druk in het vat te brengen, en sluit de tweede klep terwijl deze druk wordt uitgeoefend.Plaats tot slot de RCCS op de rotor. Start de rotatie bij 19 RPM in een celkweekincubator voor optimale kweekcondities. Ververs het medium tijdens de eerste drie dagen om de dag en daarna dagelijks.Schakel eerst de rotor uit en verwijder het RCCS. Trek de zuigers omhoog om een vacuüm te creëren. Verwijder de spuiten uit elke kleine poort, plaats het RCCS schuin en laat de beads bezinken tegenover de grote poort.Open nu een van de kleine kleppen om twee derde van het medium uit de RCCS in een afvalcontainer te laten lopen zonder de kraaltjes te verstoren. Sluit de kleine klep en open vervolgens de grote poort. Voeg medium toe aan de RCCS en plaats de stopper terug, verwijder alle luchtbellen zoals eerder getoond en plaats de cultuur op de rotator in de incubator.Zodra de aggregaten beginnen te groeien, dient de rotatiesnelheid zichtbaar te worden verhoogd om ervoor te zorgen dat de cellen in suspensie blijven. Om de cellen te oogsten, dient het RCCS uit de rotor te worden gehaald.Verwijder de spuiten uit elke kleine poort en plaats het RCCS onder een hoek zodat de kraaltjes zich tegenover de grote poort verzamelen. Nadat alle kraaltjes zijn bezonken, opent u een van de kleine kleppen en laat u een derde van het medium in een afvalcontainer weglopen. Sluit de kleine klep en open de grote poort.Wals het vat voorzichtig om de aggregaten opnieuw in de oplossing te verspreiden en breng de cellen over in een steriele conische buis van 50 milliliter. Nadat de verzamelde aggregaten in de conische buis zijn bezonken, wordt het supernatant gebruikt om het kweekvat nogmaals grondig te wassen om de terugwinning van aggregaten te maximaliseren. Gebruik onmiddellijk een pipetteertip met een wijde opening om de aggregaten te aliquoteren voor downstream functionele assays.De S-G-H-P-L four trofoblastcellijn is een voorbeeld van cellen die lijken op extravillaire trofoblasten. In een typisch aggregaat dat in een RCCS op cyto X three is gekweekt, zijn veel kralen volledig bedekt met propagerende cellen. Let op de uitlopers die zich van de hoofdcluster uitstrekken en zich hechten aan naburige clusters.Zodra ze uit het RCCS worden gehaald en op een extracellulaire matrix worden geplaatst, invaderen en/of migreren de EVT-achtige 3D-gekweekte cellen agressief. Inderdaad bevestigen R-T-P-C-R-gegevens de verhoogde expressie van MMP's in 3D-aggregaten in vergelijking met traditionele celcultuur-monolagen. Opvallend is dat ook genen die niet geassocieerd zijn met invasie upgereguleerd zijn in het RCCS.Na het bekijken van deze video zou u een duidelijk inzicht moeten hebben in hoe u het RCCS gebruikt met uw cellijn, primaire cellen of zelfs stamcellen om driedimensionale celculturen te verkrijgen die de celkinetiek in vivo nauwkeuriger nabootsen.

rotating-cell-culture-systems-for-human-cell-culture-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In deze video, tonen we de isolatie van de muis blastocysten en de afleiding van trofoblast stamcellen uit blastocysten. We beschrijven ook de voorwaarden voor het onderhoud van de stamcel terrein en in de inductie van differentiatie in cultuur.

Afleiding van Mouse trofoblast stamcellen uit blastocysten

In dit protocol beschrijven we de ontleding van placenta van de muis op zwangerschap d10.5, gevolgd door isolatie van trofoblast cellen door een Percoll-gradiënt. Vervolgens demonstreren het gebruik van de geïsoleerde cellen in een Matrigel invasie assay.

Isolatie van primaire Muis trofoblast cellen en Trofoblastinvasie Assay

Dit manuscript presenteert een uniek in vitro model van immunogezuiverde humane villoze cytotrofoblastcellen gekweekt onder hypoxie/reoxygenatie. Dit model is geschikt om de beschermende effecten van veelbelovende behandelingen, zoals melatonine, op zwangerschapscomplicaties geassocieerd met verhoogde oxidatieve stress en veranderde placentafunctie te bestuderen.

Human Primary Trofoblast Cell Cultuur aan de beschermende effecten van melatonine tegen hypoxie Studie / reoxygenation-geïnduceerde Disruption

Hier presenteren we een protocol voor de directe omzetting van muis embryonale fibroblasten in volledig functionele en stabiele trofoblast-stamcellen door tien dagen overexpressie van Tfap2c, Gata3, Eomes en Ets2.

Protocol voor de directe omzetting van muizen embryonale fibroblasten in Trofoblast Stamcellen

Hier presenteren we een protocol om efficiënt humane trofoblastische cellen te genereren uit humane pluripotente stamcellen met behulp van botmorfogenetisch eiwit 4 en remmers van de Activin/Nodal-routes. Deze methode is geschikt voor de efficiënte differentiatie van humane pluripotente stamcellen en kan grote hoeveelheden cellen genereren voor genetische manipulatie.

In vitro differentiatie van humane pluripotente stamcellen in trofoblastcellen

Hier gepresenteerd is een protocol voor bemonstering van menselijke placenta villous weefsel gevolgd door isolatie van de cytotrophoblasts voor primaire celculturen. Behandeling van trophoblasts met TNFα recapituleert ontsteking in de zwaarlijvige uteriene omgeving en vergemakkelijkt de ontdekking van moleculaire targets geregeld door een ontsteking in placentas met moeders obesitas.

Een Model van primaire menselijke Trophoblast te bestuderen van het Effect van ontsteking geassocieerd met moeders obesitas over regulering van Autophagy in de Placenta

Hier presenteren we een zeer toegankelijke protocol voor de evaluatie van de beweging van de cel in menselijke trofoblast cellen met behulp van drie in-vitrotests: de kras assay, de transwell invasie assay en de cel proliferatie assay.

In Vitro testen om te evalueren van de migratie, invasie en proliferatie van vereeuwigd menselijke eerste-trimester Trophoblast cellijnen

Hier beschrijven we een methode voor het opwarmen van verglaasde menselijke blastocysten, die ze in vitro door de implantatieperiode kweekt, verteren tot enkele cellen en vroege trofoblastcellen verzamelen voor verder onderzoek.

Single Cell Collection van Trophoblast Cellen in Peri-implantatie Stage Human Embryo's

Organoïden revolutioneren gepersonaliseerde weefselmodellering voor orgaanontwikkeling, medicijnontdekking en ziekteonderzoek. De voortgang in organoïdengineering leidt tot het creëren van ingewikkelde synthetische weefsels. Het doel is om morfogenese, assembloïdtechnologie en biomatrices te integreren om weefselengineering te bevorderen. Dit protocol helpt bij het modelleren van leverorganogenese en het vaststellen van richtlijnen voor de constructie van synthetisch weefsel.

In Vitro Cultuurtechnieken voor het Modelleren van Lever Organogenese, het Bouwen van Assembloids en het Ontwerpen van Synthetisch Weefsel met behulp van Menselijk Cellijnen

Het protocol toont een nieuw in vitro experimenteel model dat de biologie van twee soorten aanhangende cellijnen kan samenvatten met een driedimensionale (3D)-geprinte steiger. De constructie van dit model en de operationele procedures, van celvoorbereiding en celcultuur tot analyse en evaluatie, worden beschreven.

Co-cultuurmodel met behulp van twee soorten hechtende cellijnen

Dit protocol maakt zuivering, karakterisering en kweek mogelijk van primaire HLA-G+ extravilleuze trofoblasten (EVT) uit de decidua basalis en het chorionmembraan van menselijke termplacenta's. Primaire EVT-culturen behouden de levensvatbaarheid gedurende 96 uur, waardoor co-kweek met monster-gematchte moederlijke immuuncellen en daaropvolgende flowcytometrische en moleculaire analyse van hun interacties mogelijk is.

Zuivering van HLA-G+ extravilleuze trofoblasten uit menselijke termische placentaweefsels voor fenotypering en functionele analyse

Leer hoe je een roterend celkweeksysteem gebruikt voor 3D-celculturen van humane trofoblastcellen. Deze methode bootst in vivo-celkinetiek na en verbetert de expressie van differentiatiemarkers voor biomedisch onderzoek.

Roterende celkweek systemen for Human Cultuur van de Cel: Human trofoblast cellen als een model

Meer video's verkennen