Name: In vitro uncoating van HIV-1 Kernen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Leer de in vitro uncoating van HIV-1-kernen door isolatie met sucrosegradiënt-ultracentrifugatie en kinetische assays. Deze methode helpt onderzoekers de mechanismen van virale stabiliteit en infectie te begrijpen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

HIV-1 uncoating studies in het laboratorium Aiken werden ondersteund door NIH beurzen AI40364, AI50423 en AI076121. Diverse belangrijke stoffen, waaronder reagentia gebruikt in de p24-ELISA, werden verstrekt door de NIH AIDS-onderzoek en Reference Program, Afdeling van aids, NIAID, NIH.

1. De productie van HIV-1 deeltjes Alvorens verder te gaan, moet u toestemming vragen en volg de richtlijnen van de bioveiligheid kantoor van uw instelling om te werken in een bioveiligheid faciliteit goedgekeurd voor infectieuze HIV. U moet ervoor zorgen dat de juiste zorg en veiligheidsmaatregelen worden gevolgd tijdens het werken in de bioveiligheid laboratorium. De productie van HIV-1 deeltjes wordt meestal uitgevoerd door tijdelijke transfectie van 293T-cellen met HIV-1 DNA met behulp van een proviraal calciumfosfaat transfectie methode 7, 8. Hoge titer virusvoorraden gegroeid door de cultuur van de besmette T-cellen zijn ook geschikt. <ol><li> Cultuur 293T cellen in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% foetaal bovine serum (FBS) en aangevuld met antibiotica [Penicilline (100 IU / ml) en streptomycine (100 ug / ml)] bij 37 ° C, 5% CO 2 . </li><li> Los cellen van bijna samenvloeiende gerechten met 0,25% trypsine-EDTA en zaad 2x10 6 </li><li> Op de volgende dagen, moet de cel monolagen worden ongeveer 25% confluent en klaar voor transfectie. Voor de zes gerechten uit de cellen worden getransfecteerd, brengen 120 ug van proviraal DNA tot een volume van 2,7 ml met steriel water. Aan dit mengsel toe te voegen 0,3 ml van 2,5 M CaCl 2 en 3 ml 2XBBS, en meng goed door en neer te pipetteren meerdere malen. Laat het mengsel op kamertemperatuur staan ​​gedurende 10-20 minuten. </li><li> Voeg 1 ml van het resulterende mengsel druppelsgewijs naar het midden van elk gerecht, terwijl voorzichtig te zwenken om te mengen. Plaats de borden 's nachts (~ 16 uur) in een incubator ingesteld op 35 ° C en 3% CO 2. </li><li> Zuig het kweekmedium en voorzichtig voeg 5 ml PBS. </li><li> Aspireren PBS en voeg 5 ml vers medium. Cultuur van de cellen in de broedstoof bij 37 &amp;deg, C en 5% CO 2 voor extra 24-48 uur. </li><li> Verzamel de kweeksupernatant met virale deeltjes, overzetten naar een 50 ml conische centrifugebuis. Combineer de supernatanten van alle gerechten en centrifugeer bij 1500 xg gedurende 5 minuten te pellet cellen en puin. Filter het supernatant met behulp van 0,45 micrometer poriegrootte spuit filters. Voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen om aërosolvorming te minimaliseren tijdens het werken met het levende virus. Dit omvat het gebruik van conische buizen met O-ringen of rotor emmer dekt tijdens het centrifugeren stap. Indien dit niet mogelijk is, moet de schroef doppen van de buizen worden gewikkeld met parafilm. </li></ol> 2. Concentratie van HIV-1 virionen door ultracentrifugatie <ol><li> Plaats de cultuur supernatant (30 ml) in een 38,5 ml polyallomer centrifugebuis (voor Beckman SW32Ti rotor of gelijkwaardig). Voorzichtig onderlaag van het virus bevat supernatant met 5 ml oplossing van 20% sucrose in PBS met behulp van een 5 ml pipet. </li><li> Centrifugeer gedurende 3 uur bij32.000 rpm bij 4 ° C (175.000 xg bij r max) tot pellet virusdeeltjes. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof door aspiratie, zorg ervoor dat u de pellet te verstoren op de bodem van de buis. Voeg 0,5 ml van 1XSTE buffer (10 mM Tris-HCl [pH 7,4], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) aan de buis en plaats bij 4 ° C gedurende 1 uur aan de pellet los te maken. Met behulp van een brede-boring 1 ml pipet tip voorzichtig pipet op en neer een paar keer om de pellet los te maken van de bodem van de buis. Vervolgens overdracht van de losgemaakte pellet over in een 1,5 ml microcentrifugebuis, zorg schuimvorming te voorkomen. Incubeer bij 4 ° C voor een ander 1-3 uur om de kleine groepjes van het virus te verspreiden. Tijdens deze periode, de voorbereiding van de sucrose gradiënt zoals beschreven in stap 3.1. </li><li> Voorzichtig pipet het virus vering op en neer meerdere malen en centrifugeer bij 8.000 tpm (6000 xg) bij 4 ° C in een gekoelde microcentrifuge gedurende 1 minuut om de resterende klonten te verwijderen. Houd het monster koude tijdens dit proces. </li></ol> 3. Sucrose gradiëntcentrifugatie om kernen te isoleren HIV-1-kernen zijn geïsoleerd met behulp van een "spin-thru" methode 9, dat is een wijziging van de eerder beschreven methode voor de zuivering van HIV-2 cores 10. <ol><li> Bereid een 12 ml lineair 30% tot 70% sucrose gradiënt in 1XSTE buffer in een 14,5 ml polyallomer centrifugebuis voor SW32.1Ti rotor. Voor te bereiden verloop, gebruik dan een 20 ml gradiënt eerste; plaats 6 ml van 70% sucrose oplossing op de korte zijde (dicht bij de uitlaatpoort) en 6 ml van 30% sucrose-oplossing aan de andere kant. Zorg ervoor dat de luchtbellen niet zitten gevangen in het kanaal verbindt de twee kamers. Gebruik de Auto Densi-Flow gradiënt eerste aan de gradient pomp van onder naar de bovenkant van de buis met 1 ml van 85% sucrose-oplossing aan de onderkant. Plaats voorzichtig de helling bij 4 ° C tot afgekoeld (2-4 uur). </li><li> Met behulp van een brede-boring 1 ml pipet tip voorzichtig overlay het verloop met 0,25 ml van 15% sucrose oplossing in STE met 1% Triton X-100. </li> Voorzichtig overlay met 0,25 ml van 7,5% sucrose oplossing in STE met behulp van een breed boring 1 ml pipet tip. Wees voorzichtig dat u de lagen mengen. <li> Voorzichtig overlay met 0,5 ml virus suspensie van stap 2.4. Deze stap moet zorgvuldig worden onderzocht op eventuele verstoring in het verloop en het mengen van de underlaid sucrose lagen te voorkomen. </li><li> Plaats de buizen in de pre-cooled SW32.1Ti emmer en centrifugeer bij 32.000 tpm (187.000 xg bij r max) 's nachts (16-20 uur) bij 4 ° C. Om te voorkomen dat pauzeren van de centrifuge, niet beginnen centrifugeren totdat het vacuüm in de centrifuge bereikt 250 micrometer </li><li> Verzamel 1 ml fracties van boven naar beneden van het verloop met behulp van de Auto-Densi-Flow gradiënt fractionator. Plaats de buizen op het ijs onmiddellijk bij de inzameling. Meng de inhoud van de buizen door het omkeren paar keer, en trekken 50 ul van elke fractie voor kwantificering van ELISA of reverse transcriptase activiteit test. </li></ol> 4. Lokalisatie van HIV-1 kernenen opslag van kernen <ol><li> Voor het uitvoeren van uncoating testen, is het belangrijk om te bepalen welke fracties intact HIV-1 cores bevatten. Dit kan worden vastgesteld door p24-ELISA of reverse transcriptase activiteit test met behulp van de 50 ul aliquots vanaf stap 3.6. </li><li> Het herstel van CA in verband met de kernen is vaak gerelateerd aan de stabiliteit van de kernen. Meet de kern verbonden CA door p24-ELISA 9 met behulp van een monster van elke fractie. Als alternatief, meet de activiteit van reverse transcriptase van elke fractie. Met behulp van beide methoden het hoogtepunt moet worden rond fractie 10. </li><li> Zwembad de fracties die kernen. Als de kernen mogen niet worden gebruikt voor uncoating test onmiddellijk, aliquot de gepoolde kernen in de 0,2 tot 0,3 ml aliquots, flash-vries in vloeibare N2 en bewaar bij -80 ° C. Kernen bevroren op deze manier zijn geschikt voor de uncoating test. De opbrengst van de core-geassocieerde CA is typisch 1-2 ug van p24 per milliliter of ongeveer 15% van de totale virion-geassocieerdep24. </li></ol> 5. Kinetische bepaling van HIV-1 uncoating <ol><li> De hoeveelheid HIV-1 cores nodig per uncoating reactie is ongeveer 50 ng. Voor het uitvoeren van de in vitro uncoating assay, Verdun de hoeveelheid van de kernen met een gelijk volume van koude 1XSTE buffer om de viscositeit van de suspensie te verminderen en pipetteren fouten te minimaliseren. </li><li> Verder te verdunnen 100 ul van de kernen in 0,15 ml koud 1XSTE buffer met 10 ug / ml van de BSA in een 1,5 ml microcentrifugebuis. We vullen de STE buffer met BSA (10 ug / ml) tot adsorptie van CA te minimaliseren om de muren van de buis. Meng door het buisje meerdere malen. Niet vortex de monsters. Incubeer de buizen in een waterbad bij 37 ° C voor getimede intervallen (15, 30, 60 en 120 min). De buizen moeten worden ondergedompeld in het waterbad ten minste tot het niveau van de interne steekproef om nog opwarming zorgen. </li><li> Tijdens de incubatie, voorzichtig periodiek meng de inhoud van de buis (meestal 5 -10 min) door de knop van de buis. Voor een nul minuten controle, verdunnen 100 ul van de kernen in 0,15 ml koud 1XSTE buffer en incubeer op ijs gedurende de gehele lengte van het experiment (120 min). De nul minuten controle geeft de basale uncoating waarde en wordt gebruikt om de stijging van de uncoating van de kernen geïncubeerd bij 37 ° C voor de verschillende getimede intervallen te bepalen. </li><li> Aan het einde van de incubatieperiode, stop het uncoating proces door het plaatsen van de buizen in het ijs gedurende 10 minuten. </li><li> Centrifugeer de buizen op 45.000 rpm (TLA-55 rotor; 125.000 xg bij r max) gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Dit zal pellet de intacte kernen en de vrije CA vrijgekomen als gevolg van uncoating van de kernen zal blijven in de supernatant. De rotor moet worden voorgekoeld bij 4 ° C vóór het laden van de monsters. </li><li> Breng de bovenstaande nieuwe voorgekoeld microfugebuizen buizen bij voorkeur met behulp van gel-loading tips bij kamertemperatuur bewaard. Houdt u er rekening mee dat de pellet niet zichtbaar met het blote oog, dus neem uiterste zorg werwijl pipetteren uit het supernatant. Resuspendeer de pellets in 250 ul van ELISA monster oplosmiddel (0,5% Triton X-100 en 5% Donor kalfsserum in PBS). Teneinde een efficiënt ontbinding van de pellet, vortex zorgen na het toevoegen van de ELISA-monster verdunningsmiddel. Kwantificeren van de CA inhoud van de pellet en supernatant met behulp van p24-ELISA, zoals beschreven in de volgende paragraaf. </li><li> De omvang van uncoating wordt verkregen door het berekenen van de fractie van de CA in de supernatant. </li></ol> 6. Test voor CA door p24-ELISA <ol><li> Veel commerciële ELISA kits zijn beschikbaar en kunnen worden gebruikt om de CA te kwantificeren. Gebruik een commerciële of "in-house" ELISA en omvatten p24 normen om de lineariteit van de test te bepalen. Verdunningen van de monsters moet worden getest om de nauwkeurigheid te garanderen. </li><li> We hebben een zelfgemaakte ELISA die routinematig we gebruiken om test voor CA. De procedure is aangepast van een eerder verslag 11 en is uitgevoerd met behulp van capture en detector antilichamen die beschikbaar zijn vanaf NIH AIDS Onderzoek en referentiereagens Program. </li></ol> 7. Representatieve resultaten: Een voorbeeld van een resultaat van ELISA voor het bepalen van fracties die kern is weergegeven in figuur 1. Na het verzamelen van fracties (1 ml per stuk), werd 50 pi van het monster uit elke fractie gebruikt om seriële verdunningen te maken en geanalyseerd door ELISA. De totale p24 verkregen door het toevoegen van de waarden voor twaalf fracties werd 14,5 microgram. Zoals weergegeven in de figuur fracties 8-10 bevatten kernen. De p24 waarde voor de core-bevattende fracties was 2,17 microgram. Het percentage van de kern-geassocieerde p24 (14,97%) werd bepaald door de verhouding van p24 waarde voor de kern van fracties (2,17 pg) aan de totale waarde van p24 (14,5 pg). Fractie 1 of 2 bevat altijd hoogste bedrag van de p24, dit betekent vrij CA, die niet is gekoppeld aan de kernen. Dit wordt gevolgd door een geleidelijke vermindering van de p24-waarden met elke volgende fractie, dan is een sterke stijging en ten slotte een sterke daling van de p24waarden. Als de juiste zorg wordt genomen tijdens het laden van de helling dan de piek van de kern-geassocieerde CA is in de omgeving van fractie 10. Een typisch resultaat verkregen door het testen van de kinetiek van uncoating van HIV-1 kernen is weergegeven in Figuur 2. De grafiek toont een tijdsafhankelijke toename in uncoating van de wild-type HIV-1 kernen. Het percentage uncoating waarde werd verkregen door het berekenen van de fractie van de CA in de supernatant. Met de praktijk is de test zeer reproduceerbaar en is nuttig voor het bepalen van de stabiliteit van virale kernen in vitro. Houdt u er rekening mee dat de reproduceerbaarheid van de test is sterk afhankelijk van de correcte afhandeling van de monsters tijdens de procedure. Omdat de kernen zijn hitte labiel, moeten de monsters worden gehandhaafd op 4 ° C gedurende de test, behalve tijdens de incubatietijd. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3384/3384fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1 Equilibrium dichtheidsgradiënt centrifugeren vanHIV-1 kernen. Een geconcentreerde virus suspensie werd toegepast op de top van een 30 tot 70% lineair sucrose gradiënt bedekt met 1% Triton-X-100. Na een nacht centrifugatie bij 187.000 xg en 4 ° C, 1 ml fracties werden verzameld van boven (Fraction 1) naar beneden (Fraction 12) en p24 werd gekwantificeerd door ELISA. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3384/3384fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2 Tijd verloop van de HIV-1 uncoating in vitro. Gezuiverd HIV-1 kernen werden verdund en geïncubeerd bij 37 ° C voor de aangegeven tijdsintervallen. De nul-min monster werd geïncubeerd op ijs over de gehele lengte van het experiment. Na de incubatie werden de monsters ultracentrifuged op 125.000 xg gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Supernatant en pellets werden gescheiden en geanalyseerd door p24 ELISA. De mate van uncoating werd bepaald zoals beschreven in het protocol tekst. Elke reactie uncoating werd in duplo uitgevoerd; foutbalken spanwijdte het bereik van de twee waarden.

<ol><li>Ganser, B. K., Li, S., Klishko, V. Y., Finch, J. T., Sundquist, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+analysis+of+conical+models+for+the+HIV-1+core%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Assembly and analysis of conical models for the HIV-1 core.</a> Science. 283, 80-83 (1999).</li>
<li>Li, S., Hill, C. P., Sundquist, W. I., Finch, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+reconstructions+of+helical+assemblies+of+the+HIV-1+CA+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Image reconstructions of helical assemblies of the HIV-1 CA protein.</a> Nature. 407, 409-413 (2000).</li>
<li>Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+and+cellular+factors+that+regulate+HIV-1+uncoating%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+HIV.+AIDS%22%5BJournal%5D)">Viral and cellular factors that regulate HIV-1 uncoating.</a> Curr. Opin. HIV. AIDS. 1, 194-199 (2006).</li>
<li>Forshey, B. M., Schwedler, U. von, Sundquist, W. I., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+a+human+immunodeficiency+virus+type+1+core+of+optimal+stability+is+crucial+for+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Formation of a human immunodeficiency virus type 1 core of optimal stability is crucial for viral replication.</a> J. Virol. 76, 5667-5677 (2002).</li>
<li>Forshey, B. M., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disassembly+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+cores+in+vitro+reveals+association+of+Nef+with+the+subviral+ribonucleoprotein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Disassembly of human immunodeficiency virus type 1 cores in vitro reveals association of Nef with the subviral ribonucleoprotein complex.</a> J. Virol. 77, 4409-4414 (2003).</li>
<li>Wacharapornin, P., Lauhakirti, D., Auewarakul, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+capsid+mutations+on+HIV-1+uncoating%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The effect of capsid mutations on HIV-1 uncoating.</a> Virology. 358, 48-54 (2007).</li>
<li>Chen, C., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transformation+of+mammalian+cells+by+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA.</a> Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).</li>
<li>Aiken, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAiken%2C+C+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Prasad, V. R., Ganjam, K. V. 485, 41-53 (2009).</li>
<li>Kotov, A., Zhou, J., Flicker, P., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+Nef+with+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+core%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Association of Nef with the human immunodeficiency virus type 1 core.</a> J. Virol. 73, 8824-8830 (1999).</li>
<li>Kewalramani, V. N., Emerman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vpx+association+with+mature+core+structures+of+HIV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Vpx association with mature core structures of HIV-2.</a> Virology. 218, 159-168 (1996).</li>
<li>Wehrly, K., Chesebro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p24+antigen+capture+assay+for+quantification+of+human+immunodeficiency+virus+using+readily+available+inexpensive+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents.</a> Methods. 12, 288-293 (1997).</li>
<li>Welker, R., Hohenberg, H., Tessmer, U., Huckhagel, C., Kräusslich, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+structural+analysis+of+isolated+mature+cores+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Biochemical and structural analysis of isolated mature cores of human immunodeficiency virus type 1.</a> J. Virol. 74, 1168-1177 (2000).</li>
<li>Briggs, J. A., Wilk, T., Welker, R., Kräusslich, H. G., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+organization+of+authentic%2C+mature+HIV-1+virions+and+cores%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structural organization of authentic, mature HIV-1 virions and cores.</a> EMBO J. 22, 1707-1715 (2003).</li>
<li>Auewarakul, P., Wacharapornin, P., Srichatrapimuk, S., Chutipongtanate, S., Puthavathana, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoating+of+HIV-1+requires+cellular+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Uncoating of HIV-1 requires cellular activation.</a> Virology. 337, 93-101 (2005).</li>
<li>Accola, M. A., Ohagen, A., Göttlinger, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+cores%3A+retention+of+Vpr+in+the+absence+of+p6%28gag%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Isolation of human immunodeficiency virus type 1 cores: retention of Vpr in the absence of p6(gag.</a> J. Virol. 74, 6198-6202 (2000).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De hier beschreven methode om HIV-1 kernen te zuiveren om te studeren uncoating in vitro is handig voor het bestuderen van deze fase van de HIV-1 levenscyclus, in het bijzonder als gevolg van onbeschikbaarheid van een gevalideerde methode om HIV-1 uncoating analyseren doelcellen. Hoewel deze methode gebruikt evenwicht ultracentrifugatie te zuiveren kernen, anderen hebben gebruikt direct pilleren na korte lyse met 1% Triton-X-100 12, 13 of pelletering door een sucrose kussen bedekt met 0,1% Triton-X-100 1...

<table border="1"><tbody><tr><td width="190"> Naam van het reagens </td><td width="197"> Vennootschap </td><td width="114"> Catalogusnummer </td><td width="161"> Commentaar (optioneel) </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-CV </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X-100 </td><td> Mallinckrodt Baker Inc </td><td> 9002-93-1 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Acros </td><td> 9005-64-5 </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% trypsine-EDTA </td><td> Cellgro </td><td> 25 tot 053-CI </td><td></td></tr><tr><td> 2XBBS </td><td></td><td></td><td> Samenstelling: 50mm BES [p H 6.95], 280 mM NaCl en 1,5 mM Na 2 HPO 4. Pas de pH op 6,95bij kamertemperatuur. Filter steriliseren en opslaan in porties bij -20 ° C. </td></tr><tr><td> Coating antilichaam: Monoklonale antilichamen tegen p24 (183-H12-5C) </td><td> NIH AIDS-onderzoek en referentiereagens Program </td><td> 3537 </td><td></td></tr><tr><td> Primair antilichaam: HIV-Ig (hyperimmuun menselijke patiënt serum) </td><td> NIH AIDS Research en referentiereagens Program </td><td> 3957 </td><td></td></tr><tr><td> Secundair antilichaam: Geit anti-humaan IgG, peroxidase geconjugeerd </td><td> Doorboren </td><td> 31130 </td><td></td></tr><tr><td> HRP-substraat </td><td> KPL Inc </td><td> 50-76-11 </td><td></td></tr><tr><td> Immulon 2HB 96 well platen </td><td> Thermo Scientific </td><td> 3455 </td><td></td></tr><tr><td> SW32Ti en SW32.1 Ti rotors en compatibel ultracentrifuge </td> &lt;td&gt; Beckman Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TLA-55 rotor en tafelblad ultracentrifuge </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hoge snelheid microfugebuizen tubes </td><td> Beckman Coulter </td><td> 326823, 358123, 357448 </td><td></td></tr><tr><td> Auto-Densi Flow dichtheidsgradiënt fractionator </td><td> Labconco Corp </td><td> 4517000 </td><td></td></tr><tr><td> Gradient Voormalig </td><td> CBS Scientific Co Inc </td><td> GM-20 </td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro uncoating van hiv-1 kernen

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Het genoom van de retrovirussen is ingekapseld in een capside, omringd door een lipide envelop. Voor lentivirussen, zoals HIV-1, is de conische capside schil bestaat uit CA eiwit ingericht als een rooster van zeshoek. De capside wordt afgesloten door 7 pentamers aan het brede uiteinde en 5 aan het smalle uiteinde van de kegel 1, 2. Ingekapseld in dit capside shell is de virale ribonucleoproteïne complex, en samen vormen ze de kern. Na fusie van de virale membraan met het doel celmembraan, is het HIV-1 vrij in het cytoplasma. De capside demonteert dan het vrijgeven van gratis CA in de oplosbare vorm 3 in een proces aangeduid als uncoating. De intracellulaire locatie en het tijdstip van de HIV-1 uncoating worden slecht begrepen. Enkel aminozuur substituties in Californië, dat de stabiliteit van de capside te veranderen ook afbreuk doen aan het vermogen van HIV-1 tot 4 cellen te infecteren. Dit geeft aan dat de stabiliteit van de capside is essentieel voor HIV-1 infectie. </p&gt; HIV-1 uncoating is moeilijk te bestuderen door een gebrek aan beschikbaarheid van gevoelige en betrouwbare tests voor dit proces. Hier beschrijven we een kwantitatieve methode voor het bestuderen van uncoating in vitro gebruik van kernen geïsoleerd van besmettelijke HIV-1 deeltjes. De aanpak omvat isolement van kernen door sedimentatie van geconcentreerde virionen door een laag van het wasmiddel en in een lineaire sucrose gradiënt, in de kou. Te kwantificeren uncoating, zijn de geïsoleerde kernen geïncubeerd bij 37 ° C voor verschillende getimede intervallen en vervolgens gepelleteerd door ultracentrifugatie. De omvang van uncoating wordt geanalyseerd door het kwantificeren van de fractie van CA in het supernatant. Deze benadering is gebruikt om effecten van virale mutaties te analyseren op HIV-1 capside stabiliteit 4, 5, 6. Het zou ook nuttig zijn voor het bestuderen van de rol van cellulaire factoren die bij HIV-1 uncoating.

Uncoating is een essentiële stap in de vroege fase van de HIV-1 levenscyclus en wordt gedefinieerd als de demontage van het capside shell en de vrijlating van de virale ribonucleoproteïne complex (vRNP). Hier tonen we technieken voor het isoleren van intacte kernen van HIV-1 virionen en voor de kwantificering van hun uncoating<em&gt; In vitro</em&gt;.

In vitro uncoating van HIV-1 Kernen

Het genoom van de retrovirussen is ingekapseld in een kapsid dat is omgeven door een lipidenenveloppe. Voor lentivirussen, zoals HIV-1, is de kegelvormige kapsidschil ...

Het algemene doel van deze procedure is om in vitro ENC-coating van HIV-1 uit te voeren. Dit wordt bereikt door eerst HIV-1-partikels te produceren. De varianten worden vervolgens geconcentreerd via ultracentrifugatie. De volgende stap is het isoleren van de partikels door middel van sucrosegradiënt-ultracentrifugatie.Ten slotte wordt een kinetische analyse van de HIV-1 uncoating uitgevoerd. De resultaten tonen uiteindelijk tijdsonafhankelijke uncoating van HIV-1 aan via kwantificering van het ca-gehalte in het pellet en het supernatant door middel van ELISA. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over HIV-1, zoals de rol van cellulaire factoren bij uncoating en het effect van mutaties op de stabiliteit van het viruscapside vóór de uncoating.U moet toestemming verkrijgen en de richtlijnen volgen van het biosafety-kantoor van uw instelling om te mogen werken in een biosafety-faciliteit voor infectieus HIV-1. Bij het werken in een biosafety-laboratorium moet er worden voorzien in een correcte hantering en zorgvuldigheid. In deze demonstratie worden HIV-1-deeltjes geproduceerd door transiënte transfectie van 293T-cellen met HIV-1 proviraal DNA.Gebruik een dag voor

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Dit artikel beschrijft een methode om de vorming van een HIV-1 envelop geïnduceerde virologische synaps op glas ondersteund vlakke dubbellagen door totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie visualiseren. De werkwijze kan ook worden gecombineerd met immunofluorescentiekleuring tot activering en herverdeling van signaalmoleculen die tijdens HIV-1-geïnduceerde envelop virologische synapsvorming detecteren.

Imaging van HIV-1 Envelope-geïnduceerde Virologische Synapse en signalering op synthetische lipidendubbellagen

Detectie van virale RNA door fluorescentie<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie (FISH)

Een<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infectie model om te onderzoeken<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interacties in menselijke primaire monocyt-afgeleide immuuncellen

Het begrijpen van de conformatie van virale oppervlakte-antigenen is noodzakelijk om antilichaamneutralisatie te evalueren en het ontwerp van effectieve vaccin-immunogenen te begeleiden. Hier beschrijven we een cel-gebaseerde ELISA-test die de studie van de herkenning van trimeer HIV-1 Env, tot expressie gebracht aan het oppervlak van getransfecteerde cellen, door specifieke anti-Env antilichamen mogelijk maakt.

Conformationele Evaluatie van HIV-1 Trimere envelop glycoproteïnen met een cel-gebaseerde ELISA test

Dit protocol beschrijft NAME, een test die de snelle identificatie mogelijk maakt van moleculen die in vitro de chaperona-activiteiten van het HIV-1 nucleocapside-eiwit kunnen remmen.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Elektroforese (NAAM) Assay Hiermee kan de snelle identificatie van HIV-1 nucleocapsid Remmers

We illustreren hier een in vitro membraanbindingstest waarin interacties tussen HIV-1 Gag en lipidemembraan visueel worden geanalyseerd met behulp van YFP-gelabelde Gag gesynthetiseerd in een tarwekiem-gebaseerd in vitro translatiesysteem en GUV's bereid door middel van een elektrovormingstechniek.

Visualisatie van HIV-1 Gag Binding aan Giant Unilamellaire bolletjes (GUV) Membranen

Dit rapport beschrijft een in vitro test voor het meten van de human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegratiecomplex (PIC)-geassocieerde integratie-activiteit in de cytoplasmatische extracten van acuut geïnfecteerde cellen. De integratie van PIC-geassocieerd HIV-1 DNA in heteroloog doel-DNA wordt gekwantificeerd door middel van een geneste real-time polymerasekettingreactiestrategie.

Meting van In Vitro Integratie activiteit van HIV-1 Preintegration Complexen

We beschrijven een cel-gebaseerde test om te melden aan de HIV-1 fusion via de uitdrukking van groen fluorescent proteïne aantoonbaar door stroom cytometry of fluorescentie microscopie. Het kan worden gebruikt voor het testen van remmers van virale toegang (specifiek aan de fusie stap) in cel-vrij en cel-naar-cel infectie systemen.

Een High-throughput Cre-Lox geactiveerd virale membraan Fusion Assay ter identificatie van de Inhibitors van HIV-1 virale membraan Fusion

Een hoge doorvoersnelheid protocol voor functionele beoordeling van efficiënte reactivering van HIV en de ontmijning van latente proviruses is beschreven en toegepast door het testen van het effect van interventies op HIV transcriptie, egaliseren en lamineren. Representatieve resultaten van het effect van latentie omkering van agenten op LTR-gedreven transcriptie, egaliseren en lamineren zijn verstrekt.

High Throughput In Vitro beoordeling van latentie omkering van agenten op HIV transcriptie, egaliseren en lamineren

Deze methode biedt een toegankelijk en flexibel protocol voor de voorbereiding van elektronenmicroscopieroosters (EM) voor in situ cellulaire cryotomografie en correlatieve licht- en elektronenmicroscopie (CLEM).

Monstervoorbereiding voor in situ cryotomografie van zoogdiercellen

Hier beschrijven we enkele gevestigde methoden om endoplasmatisch reticulum (ER) stress en activering van ongevouwen eiwitrespons (UPR) te bepalen, met bijzondere nadruk op HIV-1-infectie. Dit artikel beschrijft ook een reeks protocollen om het effect van ER-stress/UPR op HIV-1-replicatie en virion-infectiviteit te onderzoeken.

Het meten van endoplasmatisch reticulumstress en ongevouwen eiwitrespons in HIV-1-geïnfecteerde T-cellen en het analyseren van de rol ervan in HIV-1-replicatie

Leer de in vitro uncoating van HIV-1-kernen door isolatie met sucrosegradiënt-ultracentrifugatie en kinetische assays. Deze methode helpt onderzoekers de mechanismen van virale stabiliteit en infectie te begrijpen.

In vitro uncoating van HIV-1 Kernen

Meer video's verkennen