Name: Imaging neuronale responsen bij Slice Bereidingen van Vomeronasal Het uiten van een genetisch gecodeerd Calcium Sensor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Leer hoe je levende VNO-weefselsneden bereidt voor calciumbeeldvorming van neuronale responsen op feromonen bij transgene muizen met G-CaMP2. Deze methode behoudt de intacte morfologie van cellen en levert sterkere signalen op dan traditionele technieken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Andrea Moran samen met leden van Lab Animal Service Facility (LASF) op Stowers Instituut voor hun uitstekende ondersteuning op de veeteelt en de technische diensten. Dit werk wordt ondersteund door de financiering van de Stowers Instituut en de NIH (NIDCD, toont 008003) om te huilen. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institute on Doofheid en andere communicatie-stoornissen of de National Institutes of Health. Amerikaanse patent is aangevraagd voor de Teto-G-CaMP2 muizen voor Stowers Instituut, huilen en LM.

1. Bereiding van oplossingen <ol><li> Bereid 10X R1, R2 10X en 10X R3 oplossingen volgens de tabel. R1 <table border="1"><tbody><tr><td> Chemicaliën </td><td> MW (g / mol) </td><td> mM (1X) </td><td> 10X voorraad (g / L) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,44 </td><td> 125 </td><td> 73,05 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,55 </td><td> 2.5 </td><td> 1,86 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 M voorraad </td><td> 1 </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H 2 O </td><td> 147,02 </td><td> 2 </td><td> 2,94 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 · H 2 O </td><td> 137,99 </td><td> 1,25 </td><td> 1,72 </td></tr></tbody></table> R2 <table border="1"><tbody><tr><td> Chemisch </td><td> MW (g / mol) </td><td> mM (1X) </td><td> 10X voorraad (g / L) </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 84,01 </td><td> 25 </td><td> 21 </td></tr></tbody></table> R3 <table border="1"><tbody><tr><td> Chemicaliën </td><td> MW (g / mol) </td><td> mM (1X) </td><td> 10X voorraad (g / L) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,44 </td><td> 125 </td><td> 73,05 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,55 </td><td> 2.5 </td><td> 1,86 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 M voorraad </td><td> 2 </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H 2 O </td><td> 147,02 </td><td> 2 </td><td> 2,94 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 1 M voorraad </td><td> 5 </td><td> 50 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Maak 1 liter van de muis kunstmatige cerebro-spinale vloeistof (mACSF) op de dag van het experiment door het mengen van 100 ml van 10X R1 en 100 ml 10X R2 in dubbel gedistilleerd water (DDW) en ad-d 1,8 g dextrose (laatste 10 mM). Deze voorbereiding methode voorkomt calciumcarbonaat neerslag bij hoge pH. De osmolariteit van mACSF is ongeveer 310-315 mOsm / L. Stel de osmolariteit met dextrose of water indien nodig. Beluchten van de oplossing met Carboxygen gas (95% zuurstof en 5% kooldioxide) gedurende minstens 30 minuten voor het instellen van de pH van de oplossing 7.2-7.4. </li><li> Maak 1 liter Ringer-oplossing op de dag van het experiment door het mengen van 100 ml van 10X R2 en 100 ml 10X R3 in DDW en voeg 1,8 g dextrose (10 mm). De osmolariteit en de pH van Ringer's moeten vergelijkbaar zijn met die van de mACSF. Beluchten van de oplossing met Carboxygen gas. </li><li> Bereid 4% laag smeltpunt agarose (LMA) in zowel mACSF of Ringer's oplossing. Aliquot het gesmolten agarose in Eppendorf buizen en bewaren bij 4 ° C tot gebruik. LMA, die is samengesteld uit gezuiverde polysaccharide, blijft vloeibaar bij 37 ° C en stolt snel bij een temperatuur beneden 25 ° C. Deze eigenschappen maken het ideaal voor het inbedden van VNO en levend weefsel fysiologie. Andere onzuivere materialen, zoals agar, moet niet de keuze voor levend weefsel experiment als ongekarakteriseerde componenten kunnen interfereren met neuronale reactie. </li><li> Bereid feromoon stimuli in Ringer-oplossing. Voor muis urine, 1:100 verdunning aanleiding geven tot robuuste reacties. </li></ol> 2. Voorbereiding van VNO slice <ol><li> Voor het opofferen van de dieren, zet twee buizen van de LMA op een warmte-blok en stel de temperatuur&gt; 60 ° C om de agarose smelten. Zodra de gel vloeibaar, overdracht van de buizen naar een 37 ° C verwarmen blokkeren. </li><li> Onthoofden een G-CaMP2 muis volgende CO 2 euthanasie. Snijd de onderkaak botten met een schaar aan de onderkaak te verwijderen. Verwijder de geribbelde gehemelte weefsel om de neusholte (Figuur 1A) bloot te leggen. Scheid de kaakbeenderen door het invoegen van een chirurgisch mes tussen de twee voorste snijtanden. Verwijder voorzichtig het kaakbeen aan VNO bloot te leggen. Op dit punt kan de hele VNO worden opgetild uit de nasal holte door vast te houden het staartbeen (Figuur 1B). Breng de VNO te koud zuurstofrijk mACSF oplossing direct. </li><li> Onder dissectie scope, scheid de twee VNOs met behulp van de punt van # 5 pincet voorzichtig glijden langs de wand van septum bot (figuur 1C). Afpellen van de vomer bot dat de VNO weefsel omhult. Til de hele VNO weefsel van het bot holte. Uiterst voorzichtig moeten worden genomen in deze stap niet aan de neuroepithelium schade. Kleine botfragmenten links op het weefsel oppervlak moet volledig worden verwijderd voordat inbedding. Fragmenten links op de weefsel kan worden opgevangen door het snijmes om het weefsel te trekken uit de agarose blok. </li><li> Gebruik de tang om het achterste eind van de VNO weefsel en voorzichtig onderdompelen te houden in de gesmolten agarose (figuur 1D). Snel Koel de buis op ijs om de agarose stollen. De inbedding en koeling proces duurt minder dan 2 minuten. </li><li> VF300 weefsel snijmachine (Precisionary Instruments, Greenville, NC) wordt gebruikt om onderdelen te maken. Snijd de agarose blok met daarin de VNO in vorm en lijm deze aan het weefsel houder (figuur 1E en F). Plaats het weefsel houder in de metalen cilinder en vul de rest kamer met extra LMA. Zodra de LMA stolt op het ijs, ga dan onmiddellijk snijden. Supply koude zuurstof mACSF in het snijden kamer en beginnen met het snijden bij 180-200 micrometer dikte per stuk. Pas de oprukkende snelheid en de trillingsfrequentie, zodat het weefsel is niet gecomprimeerd tijdens het snijden en het VNO niet af vallen uit de agarose. Verzamelen en overdragen van de doorsnede plakjes om mACSF incubatiekamer (figuur 2A). De schijfjes zijn haalbaar voor 6-8 uur in zuurstofrijk mACSF bij kamertemperatuur. Figuur 2B en C tonen DIC en twee-foton beelden van een G-CaMP2 VNO slice respectievelijk. </li></ol> 3. Imaging kamer zetten <ol><li> Plaats de VNO plakje in het midden van de perfusiekamer (Siskiyou, Grants Pass, OR) en de slice houd met een schijfje anker (Warner Instruments, Hamden, CT) (figuur 3A). De draden van het anker mag alleen drukken tegen de LMA deel van de slice, maar niet de VNO weefsel. Zuurstofrijk mACSF wordt geleverd aan de perfusie kamer door inlaat-poort aan ~ 100 ul / sec en de vloeistof wordt afgevoerd door middel van een zuig-naald via het uiteinde aan een continue stroom van verse mACSF (Figuur 3A en B) te geven. </li><li> Vul een 30 ml spuit met Ringer's en klem het aan de injectiepomp (New Era Pump Systems, Farmingdale, NY). Stel de snelheid van de pomp aan 300-600 pl / min tot een continue stroom van Ringer's over de slice (Figuur 3C) bieden. </li><li> Sluit de uitlaat van de Ringer om een HPLC-injectie lus (Chromtech, Apple Valley, MN) (figuur 3D). Verschillende lus grootte kan worden geselecteerd voor nauwkeurige controle van het volume wordt geleverd. We maken gebruik van een 20 il lus in our experimenten. De injectie loop control heeft twee stromen routes (figuur 3E). Bij de "load" positie, kunnen monsters worden geladen in het monster lus met een Hamilton precisie spuit. Excess monster verlaat het monster lus door vuilafvoer. Ringer-oplossing geïnjecteerd door de spuit pomp omzeilt het monster lus en gaat direct naar de uitlaat, die is verbonden met de perfusie tip (figuur 3A en E). Bij "injectie" positie, de pomp oplossing stroomt door het monster lus en druk op de prikkels in het stopcontact (figuur 3E). Voorafgaand aan de beeldvorming experiment, moeten luchtbellen worden verjaagd uit om een ​​vlotte doorstroming van de perfusie vloeistof te verzekeren. Andere commerciële of op maat gemaakte injectie systemen kunnen ook worden geïmplementeerd voor stimulus levering. </li><li> Pas de perfusie tip onder een 5x of 10x lens, zodat de tip is ongeveer 1 mm afstand van de VNO slice. </li><li> Wanneer een nieuwe perfusie-systeem is ingesteld, is het raadzaam om het meten van de steekproef vertragingstijd en Duratie met fluorescerende kleurstof. Belasting 0,1% rhodamine 6G kleurstof in het monster lus en zet de klep naar positie injecteren met 5 seconden na de start van de Image Acquisition (figuur 3F). De fluorescerende signaal wordt gedetecteerd tussen de 10-30 seconden. De vloeiende lijn van TL-signaal geeft ook aan dat er weinig turbulentie gegenereerd onder de dompelen lens en dat er adequate perfusie van zuurstofrijk mACSF bereikt de slice. </li></ol> 4. Time lapse imaging <ol><li> We gebruiken de Zeiss AxioSkope FS2 microscoop met een 10X of 20X water dompelen-lens voor time-lapse imaging. Standaard GFP bandpass filter (450-490nm) wordt gebruikt voor G-CaMP2 signalen. De epifluorescerende beelden worden overgenomen door een CCD-camera (Zeiss HRM) met 1X1 of 2x2 binning, afhankelijk van de expressie van G-CaMP2. </li><li> Stel de overname snelheid op 1 frame per seconde. Stel de intensiteit van het licht te minimaliseren bleken van de G-CaMP2 signalen en foto schade aan de cellen. Voor elke exexperiment, we normaal gesproken het verwerven van een 60-frame image stack (~ 60-70 seconden). Zet de klep aan de injectie positie op een bepaald tijdstip (bijvoorbeeld 5 seconden in figuur 3F) voor een set van experiment om consistente vertraging in alle proeven te verkrijgen. </li><li> Voer een test uit te voeren met behulp van Ringer-oplossing als de stimulus. Opnieuw afstellen van de perfusie setup als beweging artefact is geïntroduceerd tijdens monsterinjectie. </li><li> Voer een positieve controle run met de muis urine verdund tot 1:100 in Ringer-oplossing. De typische maximale AF / F-waarde van de G-CaMP2 reactie op de muis urine is ongeveer 20-40%. Indien nodig, kan men de levensvatbaarheid van de slice te bevestigen door het leveren van 10 mM KCl in Ringer om de schijfjes te stimuleren op het einde van de experimenten. </li><li> Was de Hamilton spuit in Ringer-oplossing ten minste drie keer na het laden van een stimulus. Was het monster lus met Ringer's minstens drie keer tussen de verschillende stimuli. Deze stappen te voorkomen dat kruisbesmetting tussen different monsters. </li><li> Wachten voor 4-10 min voor de VSNs om te herstellen alvorens de volgende stimulus. </li></ol> 5. Data-analyse <ol><li> Voer beeldregistratie van alle afbeeldingen overgenomen van een slice. We maken gebruik van een op maat geschreven VBA script in AxioVision (Carl Zeiss, Noord-Amerika) om dit proces te automatiseren. Alle foto frames binnen hetzelfde experiment worden geregistreerd tegen een gemeenschappelijk gekozen referentiekader met elastische registratie (Figuur 4A). Elastische registratie, ook bekend als niet-lineair registratie, is een categorie van beeldregistratie techniek de nadruk op de transformatie van een streefbeeld niet star aan een referentie-beeld. Hier gebruiken we de uitvoering van de AxioVision. Dit referentiekader is willekeurig gekozen uit het beeld stacks. </li><li> Voer afbeelding aftrekken tot de reagerende cellen te identificeren. We maken gebruik van op maat geschreven macro's in ImageJ v1.42 ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> , NIH, Bethesda, MD) om dit proces te automatiseren. Een minimale projectie beeld wordt gegenereerd voor elke stack. Reageren cellen ontstaan ​​na de minimale projectie wordt afgetrokken van de ruwe stacks (Figuur 4B). </li><li> Identificeer region of interest (ROI) van de afgetrokken stacks en het verkrijgen van de ROI coördinaten met behulp van Multi-Measure-plugin van ImageJ. Proces alle stapels voor een experiment en bewaar alle ROI coördinaten in een ROI master-lijst (Figuur 4C). </li><li> Gebruik van de ROI meester lijst cel responsen te meten van ruwe beeld stapels met op maat geschreven macro-en Multi-Measure plugin van ImageJ (Figuur 4D). Plot reactie bochten en heatmap in Matlab (Mathworks Inc, Natick, MA). </li></ol> 6. Representatieve resultaten Een voorbeeld van de VNO imaging experiment met behulp van urine monsters verzameld uit vier individuele muizen wordt weergegeven in figuur 5. De slice reageert op urine stimulatie met diverse patterns van activering. Ongeveer 80 cellen zijn geïdentificeerd zien respons hadden op ten minste een van de urine stimuli en hun reactie AF / F waarden worden uitgezet in de heatmap (figuur 5A). De reactie sporen van cellen 1, 2 en 3 worden uitgezet in figuur 5B toont het tijdsverloop activering door urine stimuli. Cel 1 toont als reactie op zowel vrouwelijke urine monsters, maar niet de mannelijke monsters, terwijl cel 2 toont het tegenovergestelde patroon van activering en reageert op zowel mannen monsters alleen. Cel 3 wordt geactiveerd door zowel individuele mannelijke en vrouwelijke monsters. Cellen 1 en 2 tonen typische reactie op sekse specifieke aanwijzingen in de urine 15. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3404/3404fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1 Schematische weergave van VNO dissectie proces. A. De anatomische locatie van VNO in de muis hoofd. Het hoofd van een G-CaMP2 muis is ontleed en wordt op zijn kop gelegd met de zachte tkwestie verwijderd van het gehemelte naar de VNO bloot te leggen. Inlaat toont een fluorescerende beeld van hetzelfde beeld. De neuroepithelia van de VNO zijn helder groen. B. Een zijaanzicht van de geïsoleerde VNO dat is ingesloten in het vomer bot (boven) en de fluorescerende beeld van dezelfde VNO (onder). C. Een coronale uitzicht op de VNO en dissectie proces. Een van VNO is gescheiden van het septum en de vomer bot kan dan worden verwijderd om de neuroepithelium te bevrijden. VNO D. is ingebed in LMA. E. De geïntegreerde blok is vastgelijmd aan het weefsel houder voor het snijden. Het weefsel houder is gevorderd bij 180-200 micrometer per stuk het indrukken van de agarose blokkeren van de metalen vat voor het snijden. Het mes is nauw gepositioneerd om de metalen vat. F. Zijaanzicht van de VF300 weefsel slicer systeem. BV, bloedvat. NE, neuroepithelium. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3404/3404fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 2"> A. VNO plakjes worden onderhouden in zuurstof mACSF bij kamertemperatuur. B. Een DIC beeld van de VNO slice. C. Een twee-foton beeld van de VNO van G-CaMP2 muis. Schaalbalk, 50 um. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3404/3404fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3 Illustratie van perfusie de systeeminstellingen. A. Een typische perfusie kamer met in-en uitlaat. VNO slice is gepositioneerd in het midden van de kamer en drukte af met een tissue anker. De middelste draden worden verwijderd uit het weefsel te verankeren, zodat de VNO weefsel niet is ingedrukt. B. De perfusie kamer rust op het podium onder de microscoop te dompelen doelstelling. De mACSF inlaat, uitlaat en zuig-perfusie tip worden aangegeven. C. De single barrel spuit pomp zorgt voor een continue stroom van Ringer door middel van de perfusie tip. D. De HPLC injectie loop systeem is goedgekeurd voor gemakkelijk stimulus sample laad-en injectie. E. Schematische weergave van de stroming aanwijzingen bij het ​​laden en injectie posities. Ringer, groen. Stimulus monster, magenta. Pijlen geven de richting van de stroming. F. Delay en afwassen time meting van de perfusie-systeem. Rhodamine 6G fluorescente kleurstof wordt geladen naar de sample loop en de afsluiter is ingeschakeld om de injectie positie op 5e seconde, dat is aangegeven met een pijl. Het fluorescerende signaal verandering wordt geconstateerd tussen 10-30 seconden en vermindert daarna. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3404/3404fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4 Image processing pipeline. A. Alle foto frames voor een slice worden geregistreerd tegen een referentiekader. B. Aftrekken van minimaal projectie van een stapel van zijn ruwe frames. Reageren cellen worden prominent na aftrek. C. ROIS worden geselecteerd en hun coördinaten worden gecompileerd in de hoofdlijst. D. Het meten van ROI te reageren cellen met behulp van master-lijst van ruwe stack. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/3404/3404fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5 is een vertegenwoordiger van G-CaMP2 VNO imaging experiment. A. De AF / F reactie heatmap uit een stuk gestimuleerd met individuele mannelijke en vrouwelijke urine. Urine verzameld van individuele mannelijke en vrouwelijke muizen. X-as, reageert cellen geïdentificeerd uit de slice. Y-as, urine samples gebruikt in het experiment. Kleur balk geeft de AF / F-waarde. B. Reactietijd loop van de drie representatieve cellen gemarkeerd in A. Pijlen geven de tijd van de stimulus toepassing. F-FVB, vrouwelijk FVB, F-CBA, vrouwelijk CBA, M-FVB, mannelijk FVB, M-BL6, mannelijk C57BL / 6. Tabel van specifieke reagentia en apparatuur: <table border="1"><tbody><tr><td> Naam van dereagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Commentaar (optioneel) </td></tr><tr><td> perfusie kamer </td><td> Siskiyou </td><td> PC-H </td><td> horizontaal </td></tr><tr><td> slice hold-down </td><td> Warner Instruments </td><td> SHD-22CL </td><td></td></tr><tr><td> perfusie port houder </td><td> ALA wetenschappelijke, Inc </td><td> MPIOH-S </td><td></td></tr><tr><td> injectiepomp </td><td> New Era Pump Systems, Inc </td><td> NE-300 </td><td></td></tr><tr><td> lage druk injectieklep </td><td> Chromtech </td><td> V-451 </td><td></td></tr><tr><td> PEEK tubing </td><td> Chromtech </td><td> 1531 </td><td> 1 / 16 "OD, 0,25 mm ID </td></tr><tr><td> PEEK sample loop </td><td> Chromtech </td><td> 1803 </td><td> 20 pi </td></tr><tr><td> Hamilton spuit </td><td> Chromtech </td><td> 80630 </td><td> 100 ul </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Birch, M. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBirch%2C+MC+%22Pheromones%22">Pheromones</a>. , North-Holland Pub. Co. & American Elsevier Pub. Co. (1974).</li>
<li>Wyatt, T. D. Pheromones and animal behaviour : communication by smell and taste. , Cambridge University Press. (2003).</li>
<li>Papes, F., Logan, D. W., Stowers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vomeronasal+organ+mediates+interspecies+defensive+behaviors+through+detection+of+protein+pheromone+homologs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The vomeronasal organ mediates interspecies defensive behaviors through detection of protein pheromone homologs.</a> Cell. 141, 692-703 (2010).</li>
<li>Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+pheromone+detection+by+mammalian+vomeronasal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons.</a> Nature. 405, 792-796 (2000).</li>
<li>Dulac, C., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+family+of+genes+encoding+putative+pheromone+receptors+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel family of genes encoding putative pheromone receptors in mammals.</a> Cell. 83, 195-206 (1995).</li>
<li>Herrada, G., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+family+of+putative+pheromone+receptors+in+mammals+with+a+topographically+organized+and+sexually+dimorphic+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel family of putative pheromone receptors in mammals with a topographically organized and sexually dimorphic distribution.</a> Cell. 90, 763-773 (1997).</li>
<li>Matsunami, H., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multigene+family+encoding+a+diverse+array+of+putative+pheromone+receptors+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A multigene family encoding a diverse array of putative pheromone receptors in mammals.</a> Cell. 90, 775-784 (1997).</li>
<li>Ryba, N. J., Tirindelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+multigene+family+of+putative+pheromone+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A new multigene family of putative pheromone receptors.</a> Neuron. 19, 371-379 (1997).</li>
<li>Pantages, E., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+family+of+candidate+pheromone+receptors+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A novel family of candidate pheromone receptors in mammals.</a> Neuron. 28, 835-845 (2000).</li>
<li>Zhang, X., Rodriguez, I., Mombaerts, P., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+and+vomeronasal+receptor+genes+in+two+mouse+genome+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Odorant and vomeronasal receptor genes in two mouse genome assemblies.</a> Genomics. 83, 802-811 (2004).</li>
<li>Liberles, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formyl+peptide+receptors+are+candidate+chemosensory+receptors+in+the+vomeronasal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Formyl peptide receptors are candidate chemosensory receptors in the vomeronasal organ.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9842-9847 (2009).</li>
<li>Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formyl+peptide+receptor-like+proteins+are+a+novel+family+of+vomeronasal+chemosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors.</a> Nature. 459, 574-577 (2009).</li>
<li>Yang, H., Shi, P., Zhang, Y. P., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+evolution+of+the+V2r+vomeronasal+receptor+gene+repertoire+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Composition and evolution of the V2r vomeronasal receptor gene repertoire in mice and rats.</a> Genomics. 86, 306-315 (2005).</li>
<li>Rodriguez, I., Punta, D. el, Rothman, K., Ishii, A., T,, Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+new+and+isolated+families+within+the+mouse+superfamily+of+V1r+vomeronasal+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Multiple new and isolated families within the mouse superfamily of V1r vomeronasal receptors.</a> Nat. Neurosci. 5, 134-140 (2002).</li>
<li>He, J., Ma, L., Kim, S., Nakai, J., Yu, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+gender+and+individual+information+in+the+mouse+vomeronasal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Encoding gender and individual information in the mouse vomeronasal organ.</a> Science. 320, 535-538 (2008).</li>
<li>Holy, T. E., Dulac, C., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+vomeronasal+neurons+to+natural+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Responses of vomeronasal neurons to natural stimuli.</a> Science. 289, 1569-1572 (2000).</li>
<li>Chamero, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protein+pheromones+that+promote+aggressive+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of protein pheromones that promote aggressive behaviour.</a> Nature. 450, 899-902 (2007).</li>
<li>Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+requirements+for+the+activation+of+vomeronasal+sensory+neurons+by+MHC+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides.</a> Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).</li>
<li>Kimoto, H., Haga, S., Sato, K., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-specific+peptides+from+exocrine+glands+stimulate+mouse+vomeronasal+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sex-specific peptides from exocrine glands stimulate mouse vomeronasal sensory neurons.</a> Nature. 437, 898-901 (2005).</li>
<li>Holekamp, T. F., Turaga, D., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+three-dimensional+fluorescence+imaging+of+activity+in+neural+populations+by+objective-coupled+planar+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Fast three-dimensional fluorescence imaging of activity in neural populations by objective-coupled planar illumination microscopy.</a> Neuron. 57, 661-672 (2008).</li>
<li>Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+I+peptides+as+chemosensory+signals+in+the+vomeronasal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ.</a> Science. 306, 1033-1037 (2004).</li>
<li>He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+signals+conveyed+by+pheromone+concentrations+to+the+mouse+vomeronasal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct signals conveyed by pheromone concentrations to the mouse vomeronasal organ.</a> J. Neurosci. 30, 7473-7483 (2010).</li>
<li>Haga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+male+mouse+pheromone+ESP1+enhances+female+sexual+receptive+behaviour+through+a+specific+vomeronasal+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor.</a> Nature. 466, 118-122 (2010).</li>
<li>Boschat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromone+detection+mediated+by+a+V1r+vomeronasal+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor.</a> Nat. Neurosci. 5, 1261-1262 (2002).</li>
<li>Hendel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+changes+of+genetic+calcium+indicators+and+OGB-1+correlated+with+neural+activity+and+calcium+in+vivo+and+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in.</a> 28, 7399-7411 (2008).</li>
<li>Pologruto, T. A., Yasuda, R., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+neural+activity+and+%5BCa2%2B%5D+with+genetically+encoded+Ca2%2B+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Monitoring neural activity and [Ca2+] with genetically encoded Ca2+ indicators.</a> J. Neurosci. 24, 9572-9579 (2004).</li>
<li>Jayaraman, V., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+a+genetically+encoded+optical+sensor+of+neural+activity+using+electrophysiology+in+intact+adult+fruit+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Evaluating a genetically encoded optical sensor of neural activity using electrophysiology in intact adult fruit flies.</a> Front Neural Circuits. 1 (3), (2007).</li>
<li>Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De meerderheid van de vomeronasaal receptoren (VRS) blijven als weesreceptoren sinds hun ontdekking door Dulac en Axel 5. Het feromoon liganden voor deze chemosensory receptoren en hun rol in het bemiddelen van dieren gedrag niet goed begrepen. Tot nu toe heeft slechts een paar van ligand / receptor, de ESP1 peptide en zijn verwante receptor, Vmn2r116 (V2Rp5), geïdentificeerd en aangetoond dat specifieke sociale informatie 19,23 over te brengen. Een andere receptor, V1rb2, is aangetoond om te reage...

imaging neuronale responsen bij slice bereidingen van vomeronasal het uiten van een genetisch gecodeerd calcium sensor

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

De vomeronasale orgaan (VNO) detecteert chemosensory signalen dat de informatie over de sociale, seksuele en reproductieve status van de individuen binnen dezelfde soort 1,2 dragen. Deze intraspecies signalen, de feromonen, maar ook signalen van een aantal roofdieren 3, activeert u de vomeronasaal sensorische neuronen (VSNs) met een hoge specificiteit en sensitiviteit 4. Ten minste drie verschillende families van G-eiwit gekoppelde receptoren, V1R, V2R en FPR 5-14 worden uitgedrukt in VNO neuronen tot de detectie van de signalen chemosensory bemiddelen. Om te begrijpen hoe feromoon informatie wordt gecodeerd door het VNO, is het essentieel om de reactie profielen van de individuele VSNs analyseren verschillende stimuli en de specifieke receptoren die deze reacties bemiddelen identificeren. De neuroepithelia van VNO zijn ingesloten in een paar vomer botten. De semi-blinde buisvormige structuur van VNO heeft een open einde (de vomeronasale kanaal) verbinding te makende neusholte. VSNs het uitbreiden van hun dendrieten naar het lumen van het VNO, waar de feromonen aanwijzingen in contact komen met de receptoren tot expressie gebracht in de dendritische knoppen. De cellichamen van de VSNs formulier pseudo-gelaagde lagen met V1R en V2R uitgedrukt in de apicale en basale lagen respectievelijk 6-8. Verschillende technieken zijn gebruikt om reacties van VSNs op zintuiglijke prikkels 4,12,15-19 monitor. Onder deze technieken, acute slice voorbereiding biedt verschillende voordelen. De eerste, in vergelijking met gedissocieerde VSNs 3,17, snijd de voorbereidingen onderhouden van de neuronen in hun eigen morfologie en de dendrieten van de cellen blijven relatief intact. Ten tweede, de cellichamen van de VSNs zijn gemakkelijk bereikbaar in het coronale deel van het VNO aan elektrofysiologie studies en imaging-experimenten laten in vergelijking met de gehele epitheel en hele-mount voorbereidingen 12,20. Ten derde, kan deze methode worden gecombineerd met moleculaire klonering technieken receptor identificatie mogelijk te maken. Sensorische stimulatie ontlokt sterke Ca 2 + influx in VSNs dat indicatief is voor receptor activatie 4,21. We dus ontwikkelen van transgene muizen die express G-CaMP2 in de olfactorische sensorische neuronen, inclusief de VSNs 15,22. De gevoeligheid en de genetische aard van de sonde veel gemakkelijker Ca 2 + imaging experimenten. Deze methode heeft weggenomen de kleurstof laad-proces dat wordt gebruikt in eerdere studies 4,21. We hebben ook gebruik van een ligand levering systeem dat de toepassing van verschillende stimuli in staat stelt om de VNO plakken. De combinatie van de twee technieken stelt ons in staat gelijktijdig te volgen meerdere neuronen in reactie op een groot aantal stimuli. Tot slot hebben we een semi-geautomatiseerde analyse pijpleiding naar beeldverwerking te helpen.

De vomeronasale orgaan (VNO) detecteert intraspecies chemische signalen dat de sociale en reproductieve informatie over te brengen. Wij hebben Ca2 + imaging experimenten met transgene muizen die G-CaMP2 in VNO weefsel. Deze aanpak stelt ons in staat om de ingewikkelde reactie patronen van de vomeronasale neuronen te analyseren om een ​​groot aantal feromonen stimuli.

Imaging neuronale responsen bij Slice Bereidingen van Vomeronasal Het uiten van een genetisch gecodeerd Calcium Sensor

Het vomeronasale orgaan (VNO) detecteert chemosensorische signalen die informatie bevatten over de sociale, seksuele en reproductieve status van individuen binnen ...

Het algemene doel van deze procedure is om te illustreren hoe levende weefselcoupes worden voorbereid voor het in beeld brengen van feromoonresponsen in neuronen van het MRO-neusorgaan. Dit wordt bereikt door eerst levende coupes van het MRO-neusorgaan of VNO-weefsel voor te bereiden van muizen die een genetische calciumindicator GCaMP two tot expressie brengen. De volgende stap is het opzetten van het perfusiesysteem op de microscooptafel voor het in stand houden van de coupe, het toedienen van de stimulus en de beeldvorming.De respons. Vervolgens wordt een time-lapse imaging-experiment uitgevoerd met diverse feromoons-stimuli, gevolgd door een data-analyse van de imaging-resultaten. Uiteindelijk worden de responspatronen van VNO-neuronen op verschillende feromoons-stimuli verkregen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals calcium-D-loading of beeldvorming in gedissocieerde cellen, is dat we de intacte morfologie van de cellen kunnen behouden, de gezondheid van de coupes beter kunnen waarborgen en een sterker signaal kunnen verkrijgen. Deze methode kan ons helpen bij het beantwoorden van enkele kernvragen in studies naar het neussyste

imaging-neuronal-responses-slice-preparations-vomeronasal-organ

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We beschrijven een gevestigde techniek om te meten en geur-opgeroepen calcium antwoorden te analyseren in de antennaal kwab van het...

Calcium Imaging van Geur-reacties van de consument in de Drosophila Antennaal Lobe

Bij muizen, is de mogelijkheid om feromonen te detecteren hoofdzakelijk gemedieerd door de vomeronasale orgaan (VNO). Hier is een acute weefsel stuk voorbereiding van VNO voor het uitvoeren van calcium beeldvorming beschreven. Deze fysiologische aanpak maakt het mogelijk waarnemingen van subpopulaties en / of individuele neuronen in een levend weefsel en is handig voor het receptor-ligand identificatie.

Imaging Feromoon Sensing in een muis Vomeronasal Acute Tissue Slice Voorbereiding

In dit protocol, updaten we de recente vooruitgang in de beeldvorming...

Imaging Calcium Reacties in GFP-gelabelde neuronen van de hypothalamus Mouse Brain Slices

The protocol video describes establishing a whole-cell patch clamp for electrophysiological recording from the sensory neurons of the vomeronasal organ (VNO) in mice. A coronal VNO slice with fluorescently labeled sensory neurons is placed in a recording setup. A labeled neuron is patched with a recording pipette in a whole-cell configuration for electrophysiological recording in response to chemical stimuli.

Establishing a Whole-Cell Patch Clamp for Electrophysiological Recording from Vomeronasal Sensory Neurons

Hier beschrijven we een fysiologische aanpak die identificatie en diepgaande analyse van een gedefinieerde populatie van sensorische neuronen in acute coronale weefselsneden van het vomeronasale orgaan van de muis mogelijk maakt, met behulp van opnames met gehele cel patch-clamp.

Een grondige fysiologische analyse van Defined Cell Populaties in Acute Tissue Slices van de Muis Vomeronasal

Dit protocol beschrijft het gebruik van genetisch gecodeerde Ca2 + verslaggevers om recordwijzigingen in neurale activiteit in gedragen Caenorhabditis elegans wormen.

Ratiometric Calcium beeldvorming van individuele neuronen in gedragen Caenorhabditis Elegans

Hier presenteren we een protocol waarmee pre-en/of postsynaptisch calcium kan worden gevisualiseerd in de context van Drosophila leren en geheugen. In vivo calcium beeldvorming met behulp van Synaptisch gelokaliseerde calcium sensoren wordt gecombineerd met een klassieke olfactorische conditionerings paradigma zodanig dat de Synaptische plasticiteit onderliggende dit type associatief leren kan worden bepaald.

In vivo optische calcium beeldvorming van leren-geïnduceerde synaptische plasticiteit in Drosophila melanogaster

Hier presenteren we hoe we het geniculate ganglion van een levende, verdoofde laboratoriummuis kunnen blootleggen en hoe calciumbeeldvorming kan worden gebruikt om de reacties van ensembles van deze neuronen op smaakprikkels te meten, waardoor meerdere proeven met verschillende stimulerende middelen mogelijk zijn. Dit maakt diepgaande vergelijkingen mogelijk van welke neuronen op welke smaakstoffen reageren.

In vivo calciumbeeldvorming van muis geniculate ganglion neuron reacties op smaakprikkels

We presenteren een protocol om de hersenstam van volwassen muizen van de ventrale kant bloot te leggen. Door een gradiënt-brekingsindexlens met een miniatuurmicroscoop te gebruiken, kan calciumbeeldvorming worden gebruikt om de activiteit van inferieure olijfneurale somata in vivo te onderzoeken.

In vivo Calcium beeldvorming in muis inferieure olijf

De huidige methoden beschrijven een niet-ratiometrische benadering voor hoge resolutie, sub-compartimentale calciumbeeldvorming in vivo in Caenorhabditis elegans met behulp van direct beschikbare genetisch gecodeerde calciumindicatoren.

Subcellulaire beeldvorming van neuronale calciumbehandeling in vivo

Dit protocol beschrijft in vivo GCaMP-calciumbeeldvorming van intacte trigeminusganglion (TG)-neuronen. Deze beschrijving omvat TG-blootstellingschirurgie, in vivo confocale microscopiebeeldvorming van TG-neuronen, toepassing van somatische stimuli tijdens microscopische beeldvorming van TG-neuronen en analyse van in vivo GCaMP-calciumbeeldvormingsgegevens.

In vivo Calciumbeeldvorming van neuronale ensembles in netwerken van primaire sensorische neuronen in intacte trigeminusganglia

Leer hoe je levende VNO-weefselsneden bereidt voor calciumbeeldvorming van neuronale responsen op feromonen bij transgene muizen met G-CaMP2. Deze methode behoudt de intacte morfologie van cellen en levert sterkere signalen op dan traditionele technieken.

Imaging neuronale responsen bij Slice Bereidingen van Vomeronasal Het uiten van een genetisch gecodeerd Calcium Sensor

Meer video's verkennen