Stretching korte sequenties van DNA met Constant Force Axiale optisch pincet

Het algemene doel van deze procedure is het manipuleren van korte DNA-moleculen met een lengte van 100 nanometer met constante, nauwkeurig gekalibreerde optische krachten. Dit wordt bereikt door het DNA aan het ene uiteinde te bevestigen aan een dekglasplaatje en aan het andere uiteinde aan een polystyreen microsfeer. Vervolgens worden de optische pincetten uitgelijnd en gekalibreerd.

Vervolgens wordt het DNA van het oppervlak weggestrekt door een combinatie van gradiëntkrachten en strooikrachten die op de microsfeer inwerken. Tot slot wordt het DNA uitgerekt door het kraaltje in het lineaire gebied van het potentiaal te vangen. Het protocol is gebruikt om mechanische eigenschappen van DNA en de kinetiek van DNA-proteïnebinding te bestuderen, en is verder nuttig gebleken bij het verduidelijken van het belang van randvoorwaarden voor de elasticiteit van korte DNA-constructen.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat de uitlijning en kalibratie van de optische pincetten met constante kracht moeilijk en complex zijn. De optische pincetten maken gebruik van een straal van een 1064 nanometer laser die wordt gesplitst in twee orthogonaal gepolariseerde stralen. Eén straal wordt gebruikt om het biomolecuul te manipuleren en de andere wordt gebruikt voor kalibratiedoeleinden.

De intensiteit van de manipulatiestraal wordt geregeld door een AO optische deflector of een OD. De stralen worden vervolgens opnieuw gecombineerd met een andere polariserende straalsplitser. De stralen worden door een plan APO 60 x 1.4 olie-immersie microscoopobjectief scherp gefocust op de monstercel. Deze pincetopstelling is gecombineerd met een zelfgebouwde brightfield-microscoop die verlichting levert vanuit een halogeenlamp, die door een condensor op de monsterkamer wordt gefocust.

Het brightfield-beeld wordt door een dichroïsche spiegel gescheiden van het laserlicht en vervolgens geprojecteerd op twee CCD-camera's. Eén CCD dient als ons primaire middel voor gegevensverwerving en wordt via software getriggerd om nauwkeurige bemonsteringssnelheden te verkrijgen. De andere CCD wordt gebruikt om een enkele, vastgezetten referentiemicrosfeer af te beelden, waarvan de positie dient als terugkoppelingsregelsysteem om drift in de microscoop te compenseren.

Het monster wordt grofweg ten opzichte van het objectief gepositioneerd met een XY-tafel, waarna het nauwkeurig kan worden gepositioneerd door middel van een ingebouwde driedimensionale piezo-tafel. Het voorwaarts verstrooide en doorgelaten laserlicht wordt opgevangen door de brightfieldcondensor en gefocust op een fotodetector om de grootte van de bead te kalibreren; vul een monsterkamer met een gedispergeerde oplossing van polystyreenmicrosferen met een diameter van 800 nanometer, verdund in fosfaatgebufferde zoutoplossing. Laat dit 10 tot 15 minuten staan en spoel vervolgens lichtjes door met buffer.

Om overtollige microsferen te verwijderen, lokaliseert u een microsfeer die willekeurig aan het dekglas kleeft en past u de hoogte van de monsterkamer aan totdat de microsfeer zich ongeveer één micrometer onder het brandpunt bevindt. Om een onscherp beeld te genereren voor het meten van de schijnbare grootte van het beeld met LabVIEW, bepaalt u eerst het centrum van de microsfeer met de functie voor geometrische patroonherkenning. Genereer vervolgens een radiaal intensiteitsprofiel van de microsfeer door een gemiddelde over 360 graden te berekenen.

Pas een kwadratische functie toe op het radiale profiel rond het centrum van elke dwarsdoorsnede, wat overeenkomt met een witte ring in elk van de brightfield-opnamen. Om een helderheidspiek te vinden, kan de afstand tussen deze piek en het centrum worden gebruikt als maat voor de schijnbare grootte van de bead. Verhoog geleidelijk de axiale positie van de microsfeer met de gekalibreerde piso-tafel en maak bij elke axiale positie een opname met de CCD-camera. Herhaal de beeldanalyse voor elke opeenvolgende opname om de schijnbare grootte van de microsfeer te correleren met de axiale locatie.

De axiale resolutie die met deze methode wordt behaald is ongeveer 1.4 nanometers. Om het optische potentiaal van de manipulatiestraal in kaart te brengen, begint men met het collineair uitlijnen van de manipulatiestraal en de kalibratiestraal terwijl de manipulatiestraal is uitgeschakeld. Sluit een vrije microsfeer op in de veel stijvere val van de kalibratiestraal. Zet vervolgens de manipulatiestraal aan.

Omdat deze veel zwakker is dan de kalibratiestraal, zal de axiale positie van de microsfeer licht worden verstoord. De resulterende verandering in de axiale positie kan worden gemeten aan de hand van de gedefocusseerde brightfield-beelden, zoals reeds beschreven. Verplaats de axiale focus en herhaal dit; zet de verplaatsing delta X uit tegen de axiale positie van de focus van de kalibratiestraal.

De axiale positie die overeenkomt met de grootste verplaatsing van de microsfeer bepaalt het centrum van het lineaire gebied van de optische val. Voor het stretchen van een DNA-monster wordt de kamer met oppervlaktetetherde DNA-moleculen gemonteerd; terwijl het bright-field beeld wordt geobserveerd, wordt de focus van de manipulatiestraal door middel van de telescoop iets boven de ongestrekte microsferen geplaatst. Vervolgens wordt de positie van de tafel aangepast totdat een van de microsferen is gevangen. Positioneer de microsfeer ruwweg in het centrum van het XY-vlak van de optische val, genereer een reeks blokgolven in LabVIEW en stuur deze naar de A OD om de laserstraal herhaaldelijk aan en uit te schakelen.

Observe de microsfeer terwijl de val herhaaldelijk wordt aan- en uitgeschakeld. Let erop of de laser een voorkeursrichting induceert in de beweging van de microsfeer terwijl de positie van de microsfeer iteratief in zowel de X- als y-richting wordt aangepast. Door de piezo-tafel te besturen, moet de willekeurige beweging van de microsfeer isotroop worden in het X-vlak, hoewel deze merkbaar beperkt is wanneer de laser is ingeschakeld.

Lijn vervolgens de kraal uit in de Z-richting. Schakel de laserstraal opnieuw kortstondig aan en uit, terwijl u deze keer gelijktijdig de axiale verplaatsing van de microsferen in real-time meet.

Centreer het podium binnen het lineaire gebied, wat het punt is waar de Z-verplaatsing het grootst is bij het uitrekken van de DNA-ramp, en regel de laserintensiteit door een voltagesignaal naar de A OD te sturen van 0 volt tot 0,5 volt in stappen van 0,025 volt per stap. Neem 400 frames op met 100 frames per seconde en bereken het gemiddelde om de axiale verplaatsing te bepalen. Zet tot slot de kracht-extensiecurves uit en fit deze aan een gemodificeerd worm-like chain-model.

Hier worden kracht-extensiecurves getoond voor 2D NA-sequenties van 1, 298 basenparen en 247 basenparen in lengte voor korte DNA-fragmenten. Het conventionele worm-like chain (WLC)-model verklaart de kracht-extensierelatie niet volledig, omdat men op deze lengteschalen rekening moet houden met effecten van eindige grootte en de extensie bij nulkracht die voortvloeit uit randbeperkingen. De kracht-extensiemetingen moeten daarom worden gefit met behulp van een gemodificeerd WLC-model, dat een effectieve persistentielengte en een extensie bij nulkracht heeft als fitparameters, zoals verder beschreven in de aanvullende materialen.

Voor grote contourlengtes van D-S-D-N-A is de effectieve persistentielengte simpelweg de nominale persistentielengte van ongeveer 50 nanometers, en de extensie bij nulkracht kan in de aangepaste WLC-fits worden verwaarloosd. De effectieve persistentielengtes bedragen 35 nanometers voor het DNA van 298 basenparen en 25 nanometers voor DNA van 247 basenparen na de ontwikkeling ervan. Deze methode maakte de weg vrij voor een reeks nanomechanische metingen aan DNA en DNA-eiwitcomplexen, waaronder een studie naar de kinetiek van de vorming en afbraak van DNA-lussen gemedieerd door regulatoire eiwitten.