Selecteren en isoleren van Koloniën van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen geherprogrammeerd tegen Adult Fibroblasten
20 februari 2012
We presenteren een protocol voor een efficiënte herprogrammering van menselijke somatische cellen in het menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) met behulp van retrovirale vectoren die coderen voor Oct3 / 4, Sox2, Klf4 en c-myc (OSKM) en de identificatie van de opnieuw aangeleerd hiPSC door live kleuring met Tra- 1-81 antilichaam.
In dit video-artikel worden menselijke volwassen fibroblasten herprogramma's om pluripotente stamcellen te genereren met behulp van retrovirale vectoren. Eerst worden menselijke fibroblasten getransduceerd met retrovirale vectoren die coderen voor transcriptiefactoren. T drie vier, SOX twee, KLF vier en cmic.
De geïnfecteerde fibroblasten worden gekweekt op muis embryonale feedercellen gedurende 14 tot 28 dagen. De resulterende culturen worden gekleurd met TRA 180 1 antilichaam om kolonies van hergeprogrammeerde cellen te identificeren. Positieve kolonies worden vervolgens overgebracht naar MEF-platen voor expansie.
Immuno cyto chemische kleuring bevestigt de expressie van pluripotentiemarkers en de vestiging van pluripotente stamcellijnen. Aanvullende studies moeten vervolgens worden uitgevoerd om de lijnen verder te karakteriseren. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in de somatische celprogrammering en menselijke geïnduceerde pluripotente stamcelculturen worstelen omdat het moeilijk is om de juiste IPSC-kolonies te identificeren.
De procedure wordt gedemonstreerd door Dr.Sula Pollak post-Doctor O Fellow uit mijn laboratorium. Begin deze procedure door Phoenix AM FO-cellen te plateren met een dichtheid van ongeveer zeven tot 8 miljoen cellen per 10 centimeter plaat in 10 milliliter hoog glucose DMEM, plaats in de incubator en kweek een nacht. De volgende dag bereid transfectiemixen voor die bestaan uit 12 microgram van een vector die codeert voor T drie vier SOX, twee klf, vier cmic of GFP-gen en 35 microliter few gene zes in een totaal volume van 500 microliter serumvrij hoog glucose DMEM met L glutamine.
Incubeer de mengsels gedurende 20 minuten. Transfecteer vervolgens de phoenix-cellen door de DNA-complexen voorzichtig te pipetteren in de platen met phoenix-cellen, die 70 tot 80% confluent moeten zijn. Incubeer de cellen gedurende zes tot acht uur bij 37 graden Celsius.
Zuig het medium op en vervang het met acht milliliter hoog glucose DMEM met antibiotica. Keer vervolgens de platen terug naar de incubator gedurende 12 uur na de incubatie. Gebruik een pipet om het virusbevattende medium op te zuigen en te verzamelen.
Vervolgens vervang het medium en herhaal dit proces elke 12 uur tot het medium vier keer is verzameld. Bewaar het medium bij vier graden Celsius. Zodra al het medium is verzameld, combineer alle porties en giet het door een 0,45 micrometer buis bovenaan filter in een 50 milliliter conische buis om losgelaten cellen en puin te verwijderen.
Het gefilterde medium, dat virale deeltjes bevat, kan twee weken in de koelkast worden bewaard zonder verlies van infectieuze activiteit. Invriezen wordt niet aanbevolen. De dag voor de transductieprocedure ontdooit u de bevroren voorraad van volwassen menselijke fibroblasten en voegt u eenmaal 10 tot de vijfde cellen toe per putje van zes putjes gecoat met gelatine.
De volgende dag combineert u in een 50 milliliter conische buis 3,5 milliliter van elk van T vier SOX twee, klf vier en cmic virale medium en voegt u polybrein toe tot een eindconcentratie van zes microgram per liter als controle. Bereid een milliliter GFP-viraal medium, drie milliliter kweekmedium en polybrein voor tot een eindconcentratie van zes microgram per milliliter. Zuig het medium op van de plaat met menselijke fibroblasten.
Voeg vervolgens vier milliliter gemengd viraan medium of controlemedium toe, centrifugeer de platen gedurende één uur bij 1600 G bij 20 graden Celsius na de centrifugatie. Incubeer de platen gedurende ongeveer 12 uur. Vervolgens vervangt u het virale medium door fibroblast-kweekmedium en incubeert u nog eens 12 uur.
Herhaal dit proces van infectie tot kweek in fibroblastmedium, nog twee keer na de laatste infectie. Kweek de fibroblasten gedurende 48 uur in DMEM. Controleer vervolgens de efficiëntie van de infectie van de parallelle transducties met het GFP-retrovirale medium.
Vervolgens om de herprogrammering van somatische naar pluripotente cellen te initiëren. De geïnfecteerde fibroblasten worden gekweekt in menselijk embryonaal stamcelmedium of HES-medium. Zaai muis embryonale fibroblasten of MEFs met een dichtheid van ongeveer twee keer 10 tot de vijfde cellen per putje van de met gelatine behandelde. Zes putjesplaat in fibroblastengroeimedium de volgende dag.
Splits de geïnfecteerde menselijke fibroblasten met behulp van 0,05% tripsine EDTA en zaai ze met een dichtheid van ongeveer 1,2 keer 10 tot de vierde per putje in het fibroblastengroeimedium. De volgende dag. Vervang het medium door HES-medium dat 0,5 millimolair natriumbutyraat bevat voor de eerste zeven dagen van de herprogrammering.
Ververs het medium dagelijks. Vervang het medium door HES-medium zonder natriumbutyraat en zet de herprogrammering nog eens zeven tot 21 dagen voort. Ververs het medium dagelijks.
Controleer de getransduceerde cellen op morfologische veranderingen. Kolonies van cellen beginnen ongeveer 10 dagen na het overbrengen van de getransduceerde fibroblasten naar feedercellen te verschijnen. De kolonies die de hergeprogrammeerde cellen bevatten, worden nu menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen of menselijke IPS-cellen genoemd.
De menselijke IPS-celkolonies zullen klaar zijn om te worden geïsoleerd in 14 tot 28 dagen na het aanleggen op de MEF-feedercellen. In dit stadium kunnen menselijke IPS-celkolonies worden overgebracht naar MEF-bevattende of met matrigel bedekte platen. Overdracht naar de MEF-bevattende platen wordt gedemonstreerd een dag voordat de menselijke IPS-celkolonies worden geplukt. Zaai 24-putjesplaten met gamma-bestraalde MEF-feedercellen in fibroblastengroeimedium.
Incubeer bij 37 graden Celsius met 5%CO2 op de dag dat de menselijke IPS-celkolonies zullen worden geplukt. Zuig het fibroblastengroeimedium van de ME Fs op en spoel ze af met PBS om eventuele sporen van FBS te verwijderen. Voeg vervolgens 0,5 milliliter humaan embryonaal stamcel- of HES-medium toe dat 10 micromolar rock-remmer Y 2 7 6 3 2 bevat aan elke putje. Gebruik vervolgens een onder een laminaire stroomkap gemonteerde microscoop om de herprogrammeringsplaten te onderzoeken op de vorming van menselijke IPS-celkoloni
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het herprogrammeren van menselijke adulte fibroblasten naar menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) met behulp van retrovirale vectoren. Het proces omvat de transductie van fibroblasten met vectoren die coderen voor belangrijke transcriptiefactoren en het identificeren van herprogrammeerde cellen via levendskleuring.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Stamcelbiologie
- Celherprogrammering
- Functie van transcriptiefactoren
Achtergrond
- Geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) kunnen worden gegenereerd uit somatische cellen.
- Retrovirale vectoren worden veelvuldig gebruikt voor genoverdracht bij herprogrammering.
- Belangrijke betrokken transcriptiefactoren zijn Oct3/4, Sox2, Klf4 en c-myc.
- Levensvatige kleuringstechnieken helpen bij het identificeren van succesvol hergeprogrammeerde cellen.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een efficiënt protocol voor het genereren van hiPSC uit menselijke fibroblasten.
- Het gebruikmaken van retrovirale vectoren voor de introductie van transcriptiefactoren.
- Het identificeren van gereprogrammeerde cellen met behulp van specifieke antilichamen.
Gebruikte methoden
- Transductie van menselijke fibroblasten met retrovirale vectoren.
- Kweek van geïnfecteerde fibroblasten op embryonale feeder-cellen van muizen.
- Kleuring van kweken met TRA-1-81 antilichaam om positieve kolonies te identificeren.
- Overdracht van positieve kolonies naar platen voor verdere expansie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle herprogrammering van fibroblasten tot hiPSC is gerealiseerd.
- Identificatie van herprogrammeerde koloniën werd bevestigd via kleuring.
- Uitgebreide koloniën vertoonden kenmerken van pluripotente stamcellen.
- Het protocol demonstreerde efficiëntie bij het genereren van hiPSC.
Conclusies
- Het ontwikkelde protocol is effectief voor het herprogrammeren van menselijke somatische cellen.
- Retrovirale vectoren zijn een levensvatbare methode voor het introduceren van de noodzakelijke transcriptiefactoren.
- Live staining is een betrouwbare techniek voor het identificeren van herprogrammeerde cellen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Het herprogrammeren van somatische cellen naar menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) maakt ziektemodellering en targetvalidatie mogelijk in de vroege ontdekkingsfase. Dit protocol ondersteunt mechanische risicoreductie door het genereren van patiëntspecifieke pluripotente lijnen voor de analyse van signaalpaden. Efficiënte isolatie en expansie van kolonies verbeteren de voorspellende betrouwbaarheid bij de preklinische beoordeling van targets.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken met behulp van uit patiënten afgeleide fibroblasten die zijn gereprogrammeerd naar pluripotentie.
- Operationele waarde: Biedt een hernieuwbare bron van genetisch gedefinieerde menselijke cellen voor studies naar target engagement.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door karakterisering van pluripotentiemarkers en differentiatiepotentieel.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde hiPSC-lijnen die geschikt zijn voor assayontwikkeling en compoundscreening.
- Operationele waarde: Maakt schaalbare productie van clonale cellijnen mogelijk voor reproduceerbare fenotypische read-outs.
- Assay-gereedheid: Faciliteert de voorbereiding van gevalideerde biologische systemen voor downstream screening-workflows.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Ondersteunt de progressie van ontdekking naar preklinische validatie met behulp van ziekterelevante hiPSC-modellen.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Maakt evaluatie van targetmodulatie in menselijke cellulaire contexten mogelijk voorafgaand aan in vivo-studies.
- Mechanistische risicoreductie: Maakt beoordeling van on-target effecten en pathwaymodulatie in genetisch overeenstemmende systemen mogelijk.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van targetidentificatie tot lead-optimalisatie, door schaalbare, mens-relevante cellulaire modellen te bieden.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking via gereprogrammeerde hiPSC's afgeleid van fibroblasten van patiënten en controles.
- Screening: Levert assay-klare clonale kolonies met consistente morfologie en markerexpressie voor de evaluatie van verbindingen.
- Analytiek: Maakt kwantitatieve meting van pluripotentiemarkers en differentiatieresultaten mogelijk om experimentele condities te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt vroege ontdekking met preklinisch werk door expansie en karakterisering van gevestigde hiPSC-lijnen.
- Bedrijfsvoorziening voor hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor het genereren van ziekte-specifieke cellijnen voor meerdere targets en indicaties.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door de generatie van pluripotente cellen met gevalideerde markerexpressie (TRA-1-60, SSEA-4, Oct3/4, Sox2, Nanog).
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid via gedefinieerde stappen voor kolonie selectie, isolatie en expansie.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door mechanistische ambiguïteit in target-validatiestudies te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk met behulp van humane cellulaire modellen met gedefinieerde genetische achtergronden.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in stamcelkweek, virale transductie en immunofluorescentietechnieken.
- Afhankelijk van de productie van retrovirale vectoren, de transductie-efficiëntie van fibroblasten en het onderhoud van feeder-cellen.
- Necessiteert gestandaardiseerde protocollen voor het plukken van kolonies, passageren en markeranalyse tussen teams.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij toepassing op verschillende celtypen of ziektemodellen.
- Beperkt door de noodzaak voor zorgvuldige identificatie van echte pluripotente kolonies te midden van gedeeltelijke herprogrammering of fibroblastcontaminatie.
