Name: Selecteren en isoleren van Koloniën van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen geherprogrammeerd tegen Adult Fibroblasten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 23 s
Description: Leer hoe u menselijke fibroblasten omprogrammeert tot pluripotente stamcellen met retrovirale vectoren. Deze methode maakt efficiënte generatie van hiPSC-kolonies mogelijk voor regeneratieve geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de ataxie van Friedreich Research Alliance en een pilot subsidie ​​van Arnold Family Foundation en het Centrum voor stamcellen en ontwikkelingsbiologie bij MD Anderson Cancer Center.

1. Virus productie en transductie <ol><li> Plaat Phoenix ampho cellen een dichtheid van 8x10 ~ 7 6 per 10 cm plaat in 10 ml DMEM medium (DMEM hoog glucose, 10% FBS warmte geïnactiveerd, 2 mM L-glutamine, zonder antibiotica). Plaats in de couveuse cultuur nacht bij 37 ° C, 5% CO2. </li><li> De volgende dag transfecteren Phoenix cellen met behulp van 12 ug van een vector die codeert voor een Oct3 / 4, Sox2, Klf4, c-myc, of GFP-gen (Addgene plasmiden 17217, 17218, 17219, 17220) en 35 ul Fugene 6. Bereid transfectie mengsel in 500 ul DMEM medium (DMEM hoog glucose, 2 mM L-glutamine, zonder FBS en antibiotica). Incubeer 20 minuten. Voorzichtig pipet DNA complexen in de 10 cm platen die 70-80% confluent Phoenix cellen. </li><li> Plaats media 6-8 uur na transfectie met DMEM medium (DMEM hoog glucose, 10% FBS warmte geïnactiveerd, 2 mM L-glutamine) met penicilline en streptomycine. </li><li> Vervolgens verzamelen virus-bevattende media 4 maal in 12 hintervallen, combineren alle delen en gefilterd met behulp van een 0,45 pm filter om vrijstaande cellen en afval (media met virale deeltjes kunnen worden bewaard in de koelkast voor 2 weken zonder verlies van besmettelijke activiteit, hoe bevriezing wordt niet aanbevolen) te verwijderen. </li><li> Voor retrovirale transductie, plaat volwassen mens fibroblasten (passage 10, Coriell Laboratories) van een bevroren voorraad 24 uur voorafgaand aan de laatste dag van retrovirale media collectie. Zaad de cellen 6-well platen gelatine onder de dichtheid 1x10 5 cellen per well in DMEM hoge glucose, 10% FBS, 2 mM L-glutamine, penicilline, streptomycine en niet-essentiële aminozuren. </li><li> De volgende dag vervangende DMEM-media met media met virale deeltjes afkomstig van Phoenix cellen. Voeg virale media (1 ml van elk Oct4, Sox2, Klf4 en c-myc media, 4 ml totaal) aangevuld met 6 ug / ml polybreen in elk putje van de 6-wells plaat van fibroblastculturen en centrifugeer bij 1600 g van 1 uur bij 20 ° C. Ongeveer 12 uur after de transductie, vervang dan de virale media met fibroblast kweekmedium. Voer virale infectie en centrifugatie 3 keer 24 uur intervallen. </li><li> Cultuur fibroblasten in DMEM media gedurende 48 uur na de laatste infectie. Controleer de efficiëntie van infectie door parallel transductions met retrovirale expressie media GFP. Figuur 1 illustreert de doelmatigheid van centrifugatie-vergemakkelijkt retrovirale infectie van humane fibroblast. </li></ol> 2. Herprogrammering <ol><li> Bereid 6 wells platen met γ-bestraalde MEF feeder lagen door enten MEF cellen een dichtheid van 2x10 ~ 5 cellen per putje van de gelatine behandelde 6 wei-plaat in fibroblast groeimedium. De volgende dag verdeeld geïnfecteerd humane fibroblasten met 0,05% trypsine / EDTA en zaai ze de dichtheid van ~ 1.2x10 4 per putje in de fibroblasten groeimedium. </li><li> De volgende dag vervangen door media met HES media (DMEM/F12, 20% Knockout Serum vervanging, niet-essentiële aminozuren, penicillin / streptomycine, 2 mM L-glutamine, 0,1 mM β-mercapto-ethanol, 20 ng / ml basale Fibroblast Growth Factor (bFGF), aangevuld met 0,5 mM natriumbutyraat voor de eerste zeven dagen de herprogrammering. Dagelijks veranderen media. </li><li> Dagelijks Monitor morfologische veranderingen in de getransduceerde cellen. Kolonies HIPS-achtige cellen gaan ongeveer 5 ontstaan ​​- 10 dagen na overdracht van de getransduceerde cellen fibroblasten op feeder. De hiPSC kolonies staan ​​klaar om ongeveer 14 worden geïsoleerd - 28 dagen na plating ze op de MEF feeder cellen. </li></ol> 3. Isolatie van hiPSC kolonies <ol><li> Een dag voor het plukken van hiPSC kolonies bereiden 24-well platen met γ-bestraalde MEF feeder cellen (~ 4x10 4 cellen per putje) in fibroblasten groeimedium. In dit stadium hiPSC kolonies kunnen ook worden overgedragen aan feeder vrije cultuur met behulp van Matrigel en mTeSR1 medium. </li><li> Voorafgaand aan de isolatie van hiPSC kolonies te bereiden MEF platen door het verwijderen van fibroblasten groei medium en spoelen MEFs met PBS om sporen van FBS te verwijderen. Vervolgens 0,5 ml hES medium (of mTeSR1 medium bij Matrigel beklede putjes) met 10 pM ROCK inhibitor Y27632 aan elk putje 7,8. </li><li> Verwijder indien nodig de fibroblasten rond de hiPSC kolonies met een 21 gauge naald onder een microscoop gemonteerd in een laminaire stroming kap (figuur 2A - C). Spoel de platen met PBS en voeg verse hES media die de Tra-1-81 StainAlive specifiek antilichaam (1:200, Stemgent). Na 30 minuten. Te vervangen medium met het antilichaam met verse hES media aangevuld met 10 pM ROCK inhibitor. Onderzoek de platen onder de fluorescentie microscoop en Mark Tra-1-81 positieve kolonies met behulp van een objectieve marker (Figuur 2D). </li><li> Snij de Tra-1-81 positieve hiPSC kolonies onder een microscoop een laminaire kap, in meerdere kleine stukjes met een 21 gauge naald zoals in figuur 2E en F. </li><li> Met behulp van een automatische pipet (P200) overdracht fragmenten van hiPSC kolonies in de individual putjes van de 24-wells plaat met MEFs of Matrigel. Vermijd het overdragen van niet-heupen cellen. Plaats de platen in een 37 ° C, 5% CO2 incubator en laat de hiPSC kolonies te voegen gedurende 24-36 uur. </li><li> Change HES of mTeSR1 (voor kolonies gegroeid op Matrigel) media per dag. De hiPSC kolonies met de juiste hES-achtige morfologie zichtbaar 48 uur na de eerste overdracht op een 24-wells plaat. </li><li> Handmatig passage hiPSC koloniën om de 6 - 8 dagen op een 12-well en vervolgens op een 6-wells plaat. </li><li> Na klonale expansie en waarin hiPSC lijnen analyseren expressie van pluripotentie markers TRA-1-60 SSEA-4, Oct3 / 4 Sox2 en NANOG met immunocytochemie zoals weergegeven in figuur 3. Evalueer genomische integriteit en differentiatie potentieel van de verkregen lijnen met behulp van karyotype en teratoom vorming analyses 6,9. </li></ol> 4. Representatieve resultaten Efficiënte transductie met retrovirus-bevattende media is van cruciaal belang voor een succesvolle herprogrammering. Het verdient aanbeveling de gehele transfectie / infectie procedure voeren met een GFP expressie virus elke herprogrammering experiment om de efficiëntie volgen zoals weergegeven in figuur 1. De titer van het GFP expressie virus bepaald als beschreven in 10 via de transductie van humane fibroblasten met niet-virale geconcentreerde media was kenmerkend in het traject van 0,5 - 5 x 10 7 virusdeeltjes per ml (vp / ml). Fibroblasten veranderen morfologie al 2 dagen na de laatste infectie. Getrypsiniseerd menselijke fibroblasten moet zorgvuldig worden geteld op zaaien ze op de MEF feeder cellen. Het wordt aanbevolen om zaad cellen op 3 verschillende dichtheden (6x10 3, 1.2x10 4, 2.5x10 4 per enkele, goed van een 6-wells-plaat), omdat elke cellijn toont verschillende groei karakteristiek en zaaien dichtheid is van cruciaal belang voor de efficiëntie van de herprogrammering. Natriumbutyraat gebruikt vooreerste 7-14 dagen herprogrammering verhoogt de efficiëntie van hiPSC vorming ongeveer 5 maal. Vaak, vooral wanneer geïnfecteerde fibroblasten werden gezaaid met hogere dichtheid, kan de fibroblast-achtige cellen overwoekeren een kweekschaal en omvatten hiPSC kolonies zoals getoond in figuur 2A. In dit geval kan de fibroblast laag nauwkeurig worden opgetild en overgebracht naar hiPSC kolonies (Figuur 2B) bloot te leggen. Vervolgens dient hiPSC kolonies worden gespoeld met HES media en gekleurd met Tra-1-81 antilichaam. Afhankelijk van de fibroblast cellen, ongeveer 20 - 40% van de kolonies te tonen met de IPSC-achtige morfologie niet vlek met Tra-1-81 antilichaam. Vastgestelde hiPSC kolonies kan worden overgedragen van een plaat binnen komende 12 - 24 uur. Langdurige incubatie zal resulteren in een snelle differentiatie van hiPSCs. Kolonies kunnen handmatig worden gepasseerd op een MEF feeder cellen of Matrigel-gecoate platen. Na expansie opgericht hiPSC klonen moet worden getest met behulp van immunocytochemie (ICC) voor de expressie van pluripotency markers zoals in figuur 3. Bovendien moet een gedetailleerde moleculaire karakterisering van de gegenereerde iPS cellijnen zijn: analyse van de genexpressie pluripotentie met RT-PCR, demonstratie van de DNA demethylering de promoters van genen pluripotentie en analyseren van de transgenen geluiddempende 9. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3416/3416fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. De efficiëntie van transductie virale bepaald volgens GFP expressie retrovirus. (A, B) Human volwassen fibroblasten afgeleid van Friedreich ataxie patiënt (GM03665, Coriell Repository) werden gevisualiseerd na twee infecties met GFP retrovirale media. (C, D) humane fibroblasten werden geïnfecteerd met dezelfde partij van het GFP retrovirale media afcentrifugeren van de cellen direct op de 6-wells platen gedurende 1 uur bij 1600 g. Beelden werden gevangen genomen 48u na de infectie. <img alt='"Figuur' src='"/' files> Figuur 2. Identificatie en isolatie van hiPSC kolonies. (A) fase contrast beeld van een plaat met hiPSCs omgeven door fibroblasten. De cellen werden gedurende 21 dagen hES media. (B, C) Dezelfde hiPSC kolonie na verwijdering van de omringende fibroblast laag. (D) opnieuw aangeleerd hiPSC kolonies worden geïdentificeerd door live kleuring met Tra-1-81 oppervlak marker antilichaam, gesneden met behulp van een steriele naald (E, F) en overgedragen aan afzonderlijke putjes van een 24-wells plaat. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3416/3416fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. De expressie van het pluripotentie specifieke markers Oct3 / 4, NANOG, Sox2, SSEA4 en Tra-1-60 in hiPSCs werd bepaald door middel van immunocytochemie.

<ol><li>Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Mali, P., Chou, B. K., Yen, J., Ye, Z., Zou, J., Dowey, S., Brodsky, R. A., Ohm, J. E., Yu, W., Baylin, S. B., Yusa, K., Bradley, A., Meyers, D. J., Mukherjee, C., Cole, P. A., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Butyrate+greatly+enhances+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+promoting+epigenetic+remodeling+and+the+expression+of+pluripotency-associated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes.</a> Stem Cells. 28, 713-720 (2011).</li>
<li>Wernig, M., Meissner, A., Foreman, R., Brambrink, T., Ku, M., Hochedlinger, K., Bernstein, B. E., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448, 318-324 (2007).</li>
<li>Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., Pyle, A. D., Tchieu, J., Sridharan, R., Clark, A. T., Plath, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).</li>
<li>Dick, E., Matsa, E., Bispham, J., Reza, M., Guglieri, M., Staniforth, A., Watson, S., Kumari, R., Lochmuller, H., Young, L., Darling, D., Denning, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+new+protocols+to+enhance+the+production+and+isolation+of+human+induced+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Two new protocols to enhance the production and isolation of human induced pluripotent stem cell lines.</a> Stem Cell Res. 6, 158-167 (2011).</li>
<li>Ku, S., Soragni, E., Campau, E., Thomas, E. A., Altun, G., Laurent, L. C., Loring, J. F., Napierala, M., Gottesfeld, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friedreich%27s+ataxia+induced+pluripotent+stem+cells+model+intergenerational+GAATTC+triplet+repeat+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Friedreich's ataxia induced pluripotent stem cells model intergenerational GAATTC triplet repeat instability.</a> Cell Stem Cell. 7, 631-637 (2010).</li>
<li>Emre, N., Vidal, J. G., Elia, J., O'Connor, E. D., Paramban, R. I., Hefferan, M. P., Navarro, R., Goldberg, D. S., Varki, N. M., Marsala, M., Carson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ROCK+inhibitor+Y-27632+improves+recovery+of+human+embryonic+stem+cells+after+fluorescence-activated+cell+sorting+with+multiple+cell+surface+markers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers.</a> PLoS One. 5, e12148-e12148 (2011).</li>
<li>Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li>
<li>Maherali, N., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).</li>
<li>Yu, J., Thomson, J. A. Induced Pluripotent Stem Cell Derivation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYu%2C+J+%22Essentials+of+Stem+Cell+Biology%22">Essentials of Stem Cell Biology</a>. Lanza, R. , Elsevier Inc. 331-337 (2009).</li>
<li>Yu, J., Hu, K., Smuga-Otto, K., Tian, S., Stewart, R., Slukvin, I. I., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li>
<li>Woltjen, K., Michael, I. P., Mohseni, P., Desai, R., Mileikovsky, M., Hamalainen, R., Cowling, R., Wang, W., Liu, P., Gertsenstein, M., Kaji, K., Sung, H. K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+transposition+reprograms+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 458, 766-770 (2009).</li>
<li>Zhou, W., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+gene+delivery+can+reprogram+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).</li>
<li>Warren, L., Manos, P. D., Ahfeldt, T., Loh, Y. H., Li, H., Lau, F., Ebina, W., Mandal, P. K., Smith, Z. D., Meissner, A., Daley, G. Q., Brack, A. S., Collins, J. J., Cowan, C., Schlaeger, T. M., Rossi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+reprogramming+to+pluripotency+and+directed+differentiation+of+human+cells+with+synthetic+modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).</li>
<li>Kim, D., Kim, C. H., Moon, J. I., Chung, Y. G., Chang, M. Y., Han, B. S., Ko, S., Yang, E., Cha, K. Y., Lanza, R., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li>
<li>Han, S. S., Williams, L. A., Eggan, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+and+deconstructing+stem+cell+models+of+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Constructing and deconstructing stem cell models of neurological disease.</a> Neuron. 70, 626-644 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het bestuderen van menselijke ziekten, met name neurologische en neurodegeneratieve, is een bijzondere uitdaging door de ontoegankelijkheid van voldoende menselijke cellulaire modellen. De mogelijkheid om gemakkelijk verkrijgbaar somatische cellen te herprogrammeren tot geïnduceerde pluripotente stamcellen en het potentieel om te differentiëren in verschillende celtypes opende een mogelijkheid om cellulaire modellen van genetische ziekten te creëren. Daarnaast iPSCs bezit zijn van een grote belofte in de toekomst van re...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11330 </td></tr><tr><td> KSR </td><td> Invitrogen </td><td> 10828 </td></tr><tr><td> Niet-essentiële aminozuren </td><td> Invitrogen </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> Natriumbutyraat </td><td> Sigma </td><td> B5887 </td></tr><tr><td> Y27632 </td><td> Stemgent </td><td> 04-0012 </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> Stemgent </td><td> 03-0002 </td></tr><tr><td> Tra-1-81 antilichaam </td><td> Stemgent </td><td> 09-0069 </td></tr><tr><td> Oct3 / 4 antilichaam </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-8628 </td></tr><tr><td> NANOG antilichaam </td><td> Cell Signaling Technology </td><td> 4903S &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Tra-1-60 antilichaam </td><td> Millipore </td><td> MAB4360 </td></tr><tr><td> Sox2 antilichaam </td><td> Cell Signaling Technology </td><td> 3579S </td></tr><tr><td> SSEA4 </td><td> Millipore </td><td> MAB4304 </td></tr><tr><td> CF1 MEFs </td><td> Globalstem </td><td> GSC-6201G </td></tr><tr><td> Doelstelling marker </td><td> Nikon </td><td> MBW10010 </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 354277 </td></tr><tr><td> mTeSR1 </td><td> StemCell Technologies </td><td> 05850 </td></tr><tr><td> β-mercapto </td><td> Sigma </td><td> M7522 </td></tr><tr><td> Fugene 6 </td><td> Roche </td><td> 11814443001 </td></tr><tr><td> polybreen </td><td> Sigma </td><td> H9268 </td></tr><tr><td> Object marker </td><td> Nikon </td><td> MBW10010 </td></tr></tbody></table>

selecteren en isoleren van koloniën van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen geherprogrammeerd tegen adult fibroblasten

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Hierin we een protocol herprogrammering menselijke volwassen fibroblasten in humane geïnduceerde pluripotente cellen (hiPSC) met retrovirale vectoren die coderen Oct3 / 4 Sox2, Klf4 en c-myc (OSKM) in aanwezigheid van natriumbutyraat 1-3. We gebruikten deze methode om laat de passage herprogrammeren (&gt; p10) volwassen mens fibroblasten afgeleid van ataxie van Friedreich patiënt (GM03665, Coriell Repository). De herprogrammering aanpak omvat efficiënte transductie protocol het veelvuldig centrifugeren van fibroblasten in de aanwezigheid van virus-bevattende media. De geprogrammeerd hiPSC kolonies werden geïdentificeerd met levende immunohistochemie voor Tra-1-81 een oppervlak merker pluripotente cellen gescheiden van niet-geherprogrammeerd fibroblasten en handmatig gepasseerd 4,5. Deze hiPSC werden vervolgens overgebracht naar Matrigel platen en gekweekt in feeder-vrije omstandigheden, rechtstreeks van de herprogrammering plaat. Vanaf de eerste passage, hiPSC kolonies te tonen karakteristieke hES-like morfologie. Met deze protocol meer dan 70% van de geselecteerde kolonies met succes kan worden uitgebreid en opgesteld in cellijnen. De gevestigde hiPSC lijnen weergegeven kenmerk pluripotentie markers zoals markers TRA-1-60 SSEA-4, en nucleaire markers Oct3 / 4 Sox2 en NANOG. Het protocol hier gepresenteerd is vastgesteld en getest met behulp van volwassen fibroblasten afkomstig van ataxie van Friedreich patiënten en controle individuen 6, menselijke pasgeboren fibroblasten, maar ook humane keratinocyten.

We presenteren een protocol voor een efficiënte herprogrammering van menselijke somatische cellen in het menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) met behulp van retrovirale vectoren die coderen voor Oct3 / 4, Sox2, Klf4 en c-myc (OSKM) en de identificatie van de opnieuw aangeleerd hiPSC door live kleuring met Tra- 1-81 antilichaam.

Selecteren en isoleren van Koloniën van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen geherprogrammeerd tegen Adult Fibroblasten

Hierin presenteren wij een protocol voor het herprogrammeren van volwassen menselijke fibroblasten tot menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) met behulp van retrovirale vectoren die coderen voor ...

In dit videoartikel worden menselijke adulte fibroblasten gereprogrammeerd om pluripotente stamcellen te genereren met behulp van retrovirale vectoren. Eerst worden menselijke fibroblasten getransduceerd met retrovirale vectoren die coderen voor de transcriptiefactoren T three four, SOX two, KLF four en cmic.De geïnfecteerde fibroblasten worden gedurende 14 tot 28 dagen gekweekt op embryonale feeder-cellen van muizen. De resulterende culturen worden gekleurd met TRA 180 1-antilichamen om kolonies van hergeprogrammeerde cellen te identificeren. Positieve kolonies worden vervolgens overgezet naar platen die MEF bevatten voor expansie.Immunocytochemische kleuring bevestigt de expressie van pluripotentiemarkers en de totstandkoming van pluripotente stamcellijnen. Vervolgens moeten aanvullende studies worden uitgevoerd om de lijnen verder te karakteriseren. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met het herprogrammeren van somatische cellen en menselijke geïnduceerde pluripotente stamcelculturen moeite hebben, omdat het lastig is om de juiste IPSC-koloniën te identificeren.De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Sula Pollak, post-doc fellow uit mijn laboratorium. Begin

selecting-isolating-colonies-human-induced-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Tonen we het protocol voor het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke somatische cellen met behulp van lentivirus-gemedieerde levering van de menselijke factoren Oct4, Sox2, NANOG, en Lin28. Pluripotentie werd bevestigd door morfologie en de aanwezigheid van embryonale stamcellen (ES) cel-specifieke merkers.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van menselijke fibroblasten herprogrammeren met de Stemgent Human TF lentivirus Set

Een methode om de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) via retrovirus-gemedieerde ectopische expressie van OCT4 genereren, wordt SOX2, KLF4 en MYC beschreven. Een praktische manier om de menselijke IPSC kolonies op basis van GFP expressie te identificeren wordt ook besproken.

Herprogrammeren menselijke somatische cellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) Met behulp van retrovirale vector met GFP

This video demonstrates a technique for isolating induced neural progenitor cells (iNPCs) derived from adult human fibroblasts. It outlines the steps involved in isolating the iNPC colonies and culturing them in laminin-coated multi-well plate wells in the presence of suitable culture media that facilitate the continued proliferation and expansion of the iNPC population.

Isolating Induced Neural Progenitor Cell Colonies Derived From Adult Human Fibroblasts

Hier presenteren we onze gevestigde methode om menselijke somatische cellen herprogrammeren in-transgen vrij mens iPSCs met Sendai-virus, die in overeenstemming resultaat en verbeterde efficiëntie toont.

Efficiënte Generation humane geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke somatische cellen met Sendai-virus

We beschrijven een protocol voor het afleiden van op lentivirus gebaseerde, gereprogrammeerde en gekarakteriseerde factorvrije humane geïnduceerde pluripotente stamcellen en de omzetting hiervan in vermeende klinische-kwaliteitscondities.

Afleiden en karakterisatie van een Transgene gratis humane geïnduceerde pluripotente Stem Cell Line en de omschakeling naar Defined Klinisch-grade Voorwaarden

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen biedt fascinerende perspectieven voor de afleiding van autologe transplantaties. Echter, de progressie door middel van een pluripotente toestand en moeizaam re-differentiatie nog belemmert klinische vertaling. Hier beschrijven we de afleiding van volwassen humane fibroblasten en hun directe omzetting in geïnduceerde neurale progenitor cellen en de daaropvolgende differentiatie tot neuronale lijnen.

Afleiding van volwassen menselijke fibroblasten en hun directe omzetting in Expandable Neural Progenitor Cellen

Dit manuscript geeft een stapsgewijze procedure voor het verkrijgen en onderhouden van humane keratinocyten uit getrokken haar en de daaropvolgende generatie van integratievrije menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) door middel van episomale vectoren.

Generatie van Integratie-vrije mens geïnduceerde pluripotente stamcellen Met behulp van Hair-afgeleide keratinocyten

Robuuste afleiding van door mensen geïnduceerde pluripotente stam (hiPS) cellen werd bereikt door gebruik te maken van niet-integratie van Sendai virus (SeV) vector gemedieerde herprogrammering van dermale fibroblasten. HiPS cel onderhoud en clonale uitbreiding werd uitgevoerd met behulp van xeno-vrije en chemisch gedefinieerde kweekomstandigheden met recombinante humane laminine 521 (LN-521) matrix en essentiële E8 (E8) medium.

Integratie Gratis Derivatie van Menselijk Geïnduceerde Pluripotente Stamcellen Met Laminine 521 Matrix

Hier beschrijven we een klinisch relevante, hoog rendement, feeder-vrije methode om te herprogrammeren menselijke primaire fibroblasten in geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van gemodificeerde mRNAs codering herprogrammering factoren en volwassen microRNA-367/302 nabootst. Ook inbegrepen zijn methoden om herprogrammering efficiëntie, te beoordelen vouw klonale iPSC kolonies en bevestigen van de expressie van de pluripotent markering TRA-1-60.

RNA gebaseerde herprogrammering van menselijke primaire fibroblasten in geïnduceerde pluripotente stamcellen

Celherprogrammering vereist de introductie van belangrijke genen, die de pluripotente celtoestand reguleren en onderhouden. Het protocol beschreven maakt de vorming van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) kolonies van menselijke dermale fibroblasten zonder virale/integrerende methoden, maar met behulp van niet-gemodificeerde Rna's (NM-Rna's) in combinatie met immuun ontduiking factoren vermindering van cellulaire afweermechanismen.

Isolatie van volwassen menselijke dermale fibroblasten uit de buikhuid en de aanmaak van geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van een niet-integrerende methode

Leer hoe u menselijke fibroblasten omprogrammeert tot pluripotente stamcellen met retrovirale vectoren. Deze methode maakt efficiënte generatie van hiPSC-kolonies mogelijk voor regeneratieve geneeskunde.

Selecteren en isoleren van Koloniën van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen geherprogrammeerd tegen Adult Fibroblasten

Meer video's verkennen