Isoleren van LacZ-expressie Cellen van Mouse Inner Ear weefsels met behulp van flowcytometrie

Het algemene doel van het volgende experiment is om lax Z positieve cellen te isoleren van de neonatale muis cochlea met behulp van flowcytometrie. Dit wordt bereikt door eerst een groot aantal muis cochlea's in een relatief korte tijd te isoleren om de cellen levensvatbaar te houden en voldoende startweefsel te hebben. Als tweede stap worden de LAX Z positieve cellen gedissocieerd en vervolgens gelabeld om het weefsel voor sortering voor te bereiden.

De cellen worden vervolgens door middel van flowcytometrie gesorteerd. De resulterende LAX Z hoge en laxe lage populaties kunnen vervolgens worden gebruikt voor verder experimenteel onderzoek. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van ooronderzoek, zoals wat zijn de genprofielen of specifieke celpopulaties binnen het binnenoor.

De procedure wordt gedemonstreerd door Taha Gen A, een medische student uit ons laboratorium. Vul eerst 35 millimeter petrischalen met HBSS en plaats ze op een ijsblok. Gebruik vervolgens irisschaar om 12 tot 15 geëuthaniseerde postnataal, nul tot drie dagen oude axon, twee laxe reporter en wildtype muizen te onthoofden.

Plaats de hoofden op een 60 millimeter petrischaal op een ijsblok. Gebruik vervolgens nummer vijf Dumont forceps en irisschaar om de kaak en tong uit de hoofden te snijden en snijd vervolgens door de basis van de schedel ter hoogte van het gehemelte. Verwijder nu de huid van de schedel en doorsnijd de schedelbasis door de schaar in het onderste deel van het foramen magnum tot het midden van het gehemelte in te brengen.

Maak een andere insnijding met de schaar vanaf de snede van het gehemelte tot het bovenste deel van de schedel aan beide kanten. Wees voorzichtig om de otische capsule niet te beschadigen. Voltooi vervolgens de isolatie van het temporale bot door twee 45 graden gebogen insnijdingen te maken, beginnend vanaf het bovenste deel van het raamwerk en het magnum tot aan de coronale snede bij het harde gehemelte.

Plaats vervolgens de geïsoleerde temporale botten in de 35 millimeter petrischalen met HBSS op het ijsblok en breng het ijsblok over naar een steriele dissectiekap. Vul vervolgens nog een 35 millimeter petrischaal, dit keer met PBS, en plaats deze op het ijsblok. Gebruik twee nummer 55 forceps.

Begin de microdissectie door voorzichtig de cortex, hersenstam en cerebellum van het temporale bot boven de otische capsule te verwijderen. Verwijder vervolgens, zonder de otische capsule te verwijderen, delen van de cochleaire capsule beginnend bij de ingang van de vestibulaire cochleaire zenuw en doorgaan tot in de otische capsule. Na de blootstelling van de basis van de cochlea, trek voorzichtig het orgaan van Corti en het omliggende weefsel eruit.

Begin vervolgens bij de basis, verwijder alle resterende spiraalganglion en stria ssis en breng de cochlea over naar het petrischaal gevuld met PBS. Pipetteer eerst 50 microliter steriel PBS in het centrum van een tot twee putjes van een niet-gecoate zes-putjes kweken schotel. Breng vervolgens niet meer dan 20 axon, twee laxe cochlea's over in elke druppel PBS.

Verwarm vervolgens 50 microliter aliquoten van 0,125% trypsine gedurende ongeveer twee minuten in een 37 graden Celsius waterbad. Voeg vervolgens de trypsine toe aan de cochlea. Zorg ervoor dat u de schotel niet schudt.

Incubeer de cochlea gedurende acht minuten bij 37 graden Celsius. Beëindig de trypsinisatie door 50 microliter soja-tripsine-remmer aan elke druppel toe te voegen en voeg vervolgens nog eens 50 microliter vol volledig medium toe nadat een P 200 pipetteerpomp is ingesteld op 125 microliters. Gebruik een 300 microliter stompe pipetteertip om de cellen 80 keer voorzichtig te mengen, zorg ervoor dat er geen bubbels ontstaan.

Voeg vervolgens na elk druppelen nog eens 200 microliter volledig medium toe aan elke. Plaats de cellen nu door een 40 micron celzeef in een nieuw putje. Binnen dezelfde zes-putjes plaat en breng vervolgens de cellen uit elk putje over naar individuele standaard faxbuizen.

Voeg vervolgens 100 microliter wildtype cellen toe aan elk van de drie buizen, gevolgd door verdunning met 300 microliter volledig medium voor de CUG-alleen. Verdun 10 microliter axon, twee LAX Z cellen in 390 microliter volledig medium. Breng de resterende axon twee laxe Z cellen over naar faxbuizen in 400 microliter OT's.

Nadat de buizen gedurende 10 minuten in een bevochtigde incubator van 37 graden Celsius zijn geïncubeerd, voeg je 200 microliter verdund CUG toe aan elke geschikte faxbuis. Bescherm vervolgens alle buizen tegen licht en incubeer de cellen gedurende 25 minuten in een bevochtigde incubator van 37 graden Celsius. Voor de kleuring terwijl de cellen incuberen, plaats 10 milliliter vers bereide heupen plus FBS in een 15 milliliter buisje en plaats het buisje op ijs.

Voeg vervolgens 1,8 milliliter van de ijskoude heupoplossing toe aan elk van de faxbuizen onder de steriele kap met de lichten uit om lichtblootstelling te minimaliseren. Centrifugeer vervolgens de cellen gedurende vijf minuten bij 1200 RPM op kamertemperatuur. Verwijder vervolgens het supernatant en suspendeer de pellets in 300 microliter volledig medium.

Verzamel alle aliquoten voor het sorteermonster en voeg vervolgens propidiumjodide toe aan elk geschikt buisje tot een eindconcentratie van één microgram per milliliter. Plaats de cellen vervolgens nogmaals op ijs. Stel de sorteergaten in door eerst 1000 gebeurtenissen van de ongeverfde wildtype cellen te verzamelen om de celverdeling op de voorwaarts versus zijwaartse verstrooiingsplot te bepalen.

Pas de voorwaartse en zijwaartse verstrooiingsparameters indien nodig aan. Compenseer vervolgens met de ongeverfde wildtype PI-geverfde wildtype en CUG-geverfde axon. Twee LAX Z cellen.

Vul twee faxbuizen met 500 microliter volledig medium. Begin