Name: Isoleren van LacZ-expressie Cellen van Mouse Inner Ear weefsels met behulp van flowcytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Leer de isolatie van LacZ-expressiecellen uit het cochleaweefsel van neonatale muizen met behulp van flowcytometrie. Deze methode maakt efficiënte sortering van specifieke celpopulaties mogelijk voor genexpressieonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken S. Heller, K. Oshima, R. Nusse en Y. Zeng voor de vruchtbare discussies en C. Tang, A. Lee, E. Liaw en het personeel van de Stanford Shared FACS Facility voor de technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door het Howard Hughes Medical Institute Medical Research Training Fellowship, het Stanford University Medical Scholars-programma (beide aan T.A.J.), het Stanford University Dean's Fellowship (aan R.C.), de American Otological Society, de Triological Society, de Percy Memorial Award, het Akiko Yamazaki and Jerry Yang Faculty Scholar Fund en NIDCD/NIH K08 DC011043 (allemaal aan A.G.C.).

1. Microdissectie van het slakkenhuis
<ol>
	<li>Bereid de dissectiemicroscoop onder de zuurkast voor door de oppervlakken af te nemen met 70% ethanol en ijsblokken klaar te leggen.</li>
	<li>Bereid 10-15 Petri-schalen van 35 mm onder steriele omstandigheden voor en vul deze tot het midden (~2 ml) met steriele Hank's Balanced Salt Solution met calcium (HBSS).</li>
	<li>Bereid twee Petri-schalen van 35 mm onder steriele omstandigheden voor en vul deze voor de helft (~2 ml) met steriele 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
	<li>Steriliseer de micro-pincetten in een Falcon-conische buis van 50 ml met 70% ethanol.</li>
	<li>Decapiteer in een ruimte terzijde van de steriele zuigkast 12-15 postnatale (P) 0-3 dagen oude Axin2-muizen met een irisschaar.LacZ/+ reportermuizen en plaats de koppen op een 60 mm Petri-schaal op een ijsblok.</li>
	<li>Excite de onderkaak en de tong met behulp van #5 Dumont-pincetten en iris-scharen, en snijd door de schedelbasis op het niveau van het gehemelte.</li>
	<li>Verwijder de overliggende huid van de calvaria en transecteer de schedelbasis door de schaar in te brengen vanaf het inferieure gedeelte van het foramen magnum tot in het midden van het palatum.</li>
	<li>Maak aan beide zijden een tweede incisie met irisscharen vanaf de snijkant van het palatum tot aan het superieure aspect van het calvaria, waarbij u er zorg voor draagt de otische capsule niet te beschadigen.</li>
	<li>Volledige isolatie van het slaapbeen door het maken van twee incisies onder een hoek van 45 graden, beginnend vanaf het superieure aspect van het foramen magnum en uitlopend tot de coronale snede bij het harde palatum.</li>
	<li>Plaats de geïsoleerde slaapbeenderen in Petri-schalen van 35 mm met HBSS op een ijsblok.</li>
	<li>Verzamel osseus temporalia van ongeveer 12-15 geofferde dieren, voor een totaal van 24-30 osseus temporalia.</li>
	<li>Plaats de petrischaal met de geïsoleerde slaapbeenderen in de vooraf voorbereide steriele dissectiekap (1.1).</li>
	<li>Overdraag vier slaapbeenderen naar elke vooraf geprepareerde 35 mm Petrischaal met HBSS (1,2) en plaats deze op een ijsblok.</li>
	<li>Begin de microdissectie door met twee #55 pincetten voorzichtig de cortex, hersenstam en het cerebellum in het slaapbeen boven de otische capsule te verwijderen.</li>
	<li>Verwijder delen van het cochleaire kapsel door deze weg te beitelen, beginnend bij de ingang van de nervus vestibulocochlearis in het otische kapsel, zonder het otische kapsel zelf te verwijderen.</li>
	<li>Nadat de basis van het slakkenhuis is blootgelegd, wordt het slakkenhuis en het omringende weefsel voorzichtig naar buiten getrokken. Verwijder het resterende spiraalganglion en de stria vascularis, beginnend bij de basis.</li>
	<li>Overdraag het slakkenhuis naar een Petri-schaal van 35 mm met PBS op een ijsblok.</li>
	<li>Voor een optimale weefsellevensvatbaarheid moet de totale dissectietijd minder dan 60 min bedragen.</li>
	<li>Herhaal de bovenstaande stappen voor 3-5 wildtype (WT) P0-P3 muizen als controles voor de Axin2-LacZ muizen.</li>
</ol>
2. Cel-dissociatie (gemodificeerd naar eerder beschreven methoden)2,10
<ol>
	<li>Plaatsen 50 μl steriele PBS in het midden van een putje in een niet-gecoate 6-wells kweekschaal.</li>
	<li>Hanteer maximaal 20 Axin2LacZ/+ cochleae in elk 50 μl druppel PBS. Een nieuwe 50 μl een druppel PBS moet voor meer dan 20 cochleae worden gebruikt.</li>
	<li>Voorverwarmen 50 μl aliquots van 0,125% trypsine gedurende ~2 minuten in een 37°C waterbad</li>
	<li>Toevoegen 50 μl van voorverwarmde 0,125% trypsine aan de PBS waarin de cochleae zich bevinden.</li>
	<li>Plaats de 6-wellschaal op 37°C gedurende 8 min, waarbij erop wordt gelet de schaal niet te schudden.</li>
	<li>Om de trypsinisatie te beëindigen, voegt u ... toe 50 μl van soja-trypsine-inhibitor aan elk 100 μl druppel.</li>
	<li>Voeg een aanvullende 50 μl van volledig medium (FM) (IGF-1, EGF, bFGF, HS, ampicilline in DMEM/F12)2</li>
	<li>Gebruik van een 300 μl stompe pipetpunt met een P200 Pipetteman ingesteld op 125 μltritureer de cellen voorzichtig 80 keer, waarbij u erop let dat er geen bellen ontstaan.</li>
	<li>Voeg na het tritureren van elke druppel een aanvullende 200 μl van FM in elke put.</li>
	<li>Breng de cellen door een 40 μm blauwe Falcon celzeef in een nieuwe put.</li>
	<li>Overdraag de cellen naar standaard Falcon FACS-buisjes (ongeveer 300 μl blijft over na trituratie en filtratie).
	<ol class="lalpha">
		<li>Verdeel cellen uit wildtype cochlea's over drie buisjes door te verdunnen 100 μl met 300 μl FM in elke buis. Eén buis wordt gebruikt als blanco controle, één buis wordt gekleurd met propidiumjodide (PI, 1 μg/ml) alleen (niet toe te voegen in deze stap), terwijl de laatste wordt gekleurd met 3-carboxyumbelliferyl β-D-galactopyranoside (CUG, zie 2.15) om achtergrondfluorescentie te detecteren.</li>
		<li>Plaatsen 400 μl van gedissocieerde cellen uit Axin2-LacZ-cochlea's in elke FACS-buis. Als controle voor alleen CUG, verdun 10 μl van cellen in 390 μl FM (zie buis F in stap 2.15). Breng het volume van alle overige buizen naar 400 μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Incubeer de cellen in een 37°C bevochtigde incubator voor 10 min.</li>
	<li>Bereid de CUG-oplossing:
	<ol class="lalpha">
		<li>Voorbereiden 200 μl van CUG voor elke FACS-buis die kleuring vereist.</li>
		<li>Verdun CUG in FM 1:50 in een donkere zuigkast met minimale blootstelling aan licht.</li>
		<li>Warm de verdunde CUG vooraf op bij 37°C gedurende 3-5 minuten.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Voeg vervolgens toe 200 μl van verdunde CUG aan elke corresponderende FACS-buis. Voeg aan buizen die niet zijn bestemd voor CUG enkel FM toe (zie 2.15).</li>
	<li>Op dit punt moeten er vijf categorieën buisjes zijn met de volgende inhoud (voeg in deze stap geen PI toe):
	<ol class="ualpha">
		<li>Wildtype - zonder CUG of PI (zie voor compensatie stap 3.5-6)</li>
		<li>Wildtype - alleen met PI (voor compensatie)</li>
		<li>Wildtype - met CUG en PI (ter controle tegenover Axin2-LacZ-cellen)</li>
		<li>Axin2-LacZ - enkel met CUG (voor compensatie)</li>
		<li>Axin2-LacZ - met CUG en PI (voor feitelijke cel sortering)</li>
		<li>Axin2-LacZ - met CUG en PI (voor eventanalyse)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bescherm alle buisjes tegen licht en incubeer ze in een 37°C 25 minuten in een bevochtigde incubator.</li>
	<li>Bereid een verse HEPES + foetaal kalfsserum (FBS)-oplossing voor om de reactie na incubatie te stoppen:
	<ol class="lalpha">
		<li>Verdunnen 400 μl van vers ontdooide FBS in 10 ml steriele 10 mM HEPES (in PBS) in een 15 ml Falcon-buis.</li>
		<li>Plaats de buis op ijs tot voltooiing van stap 2.16.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Voeg 1,8 ml ijskoude HEPES-oplossing toe aan elke FACS-buis onder een steriele laminaire flowkast met de lichten uit om blootstelling aan licht te minimaliseren.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 1200 rpm.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 300 μl FM, voeg alle aliquoten voor het sorteermonster samen (Axin2-LacZ gekleurd met CUG en PI).</li>
	<li>Voeg PI toe aan elke buis om een eindconcentratie te bereiken van 1 μg/ml.</li>
	<li>Plaats de cellen op ijs en bescherm ze tegen licht.</li>
</ol>
3. Flowcytometrie
<ol>
	<li>We gebruiken een BD Aria II uitgerust met 488-nm, 633-nm en 407-nm lasers. Detectie van CUG werd uitgevoerd met de 407-nm violette laser en PI met de 488-nm blauwe laser bij de Stanford Shared FACS Facility.</li>
	<li>Een getrainde flowcytometer-operator is vereist. Ga over naar de volgende stap nadat de lasers zijn opgewarmd, de detectoren van de cytometer zijn gekalibreerd volgens de instructies van de fabrikant en de optimale sorteerparameters zijn ingesteld. Uit onze ervaring blijkt dat het gebruik van een 100 μm nozzle de celviabiliteit optimaliseert voor daaropvolgende experimenten.</li>
	<li>De volgende parameters werden gebruikt: drempelwaarde op 5.000 events, stroomsnelheid minder dan 3.000 events/seconde, forward scatter (FSC) op 125 volt en side scatter (SSC) op 250 volt; het PE-Cy5 kanaal werd gebruikt voor PI en Cascade Blue voor CUG.</li>
	<li>Spoel de cytometerkamer twee keer met 70% ethanol en vervolgens twee keer met PBS, in die volgorde.</li>
	<li>Begin de analyse met ongekleurde wildtype-cellen (buis A in stap 2.15). Verzamel 1.000 events om de celdistributie op de FSC versus SSC plot te bepalen. Als de scatter niet gewenst is, pas dan de FSC- en SSC-parameters aan.</li>
	<li>Voer compensatie uit met ongekleurde WT-cellen (buis A), PI-gekleurde WT-cellen (buis B) en CUG-gekleurde Axin2-LacZ-cellen (buis D). Compensatie maakt een nauwkeurigere signaaldifferentiatie mogelijk tussen de verschillende golflengten van de laser.</li>
	<li>Start de analyse met wildtype PI- en CUG-gekleurde cellen (buis C) en stel de gating-parameters in voor:
	<ol class="lalpha">
		<li>Uitsluiting van debris op basis van de FSC versus SSC plot.</li>
		<li>Uitsluiting van doubletten en aggregaten met behulp van de FSC-height versus FSC-area plot.</li>
		<li>Uitsluiting van dode cellen op basis van de FSC-area versus PE-Cy5-area plot.</li>
		<li>Stel een plot op van FSC-area versus Cascade Blue-area met een willekeurige gate-plaatsing.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analyseer vervolgens 10.000 events uit de sorteerbuis die Axin2-LacZ PI- en CUG-gekleurde cellen bevat (buis F).
	<ol class="lalpha">
		<li>Alle gates die met wildtype-cellen zijn ingesteld, moeten hier worden toegepast.</li>
		<li>Maak, op basis van de plots voor de wildtype-cellen, gates voor Cascade Blue-high cellen die minder dan 1% van het totaal aantal events beslaan.</li>
		<li>Dezezelfde gates voor Cascade Blue-high omvatten nu ongeveer 15-20% van de cellen in het Axin2-LacZ monster; dit zijn de Axin2-high cellen.</li>
		<li>Maak, met behulp van de analyseplot van de Axin2-LacZ-cellen, een gate voor de minst fluorogene 15-20% van de cellen, voortaan de Axin2-low cellen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sorteer de cellen op basis van de bovengenoemde gating-strategie in FACS-buisjes met 500 μl FM: één buisje voor Axin2-high en het andere voor Axin2-low cellen. Zorg ervoor dat de opvangbuisjes tijdens het sorteren in een kamer staan die is gekoeld tot 4°C.</li>
	<li>Noteer het aantal cellen dat door de flowcytometer is geteld voor elke populatie.</li>
</ol>
4. Representatieve resultaten (zie figuur 2):
Met het bovenstaande protocol herstellen we doorgaans 40-45% debris-vrije cellen uit zowel de wildtype- als de Axin2LacZ/+ cochleae (Figuren 2A en B), waarvan ongeveer 70% vrij is van doubletten (zie Figuren 2A' en B'). De meeste gesorteerde cellen zijn levensvatbaar en hebben geen PI opgenomen (~95%) (Figuren 2A'' en B''). Gemiddeld worden de bovenste ~20% CUG-positieve cellen beschouwd als Axin2-LacZ-positieve cellen (Figuur 2B''') en correleren deze aan ongeveer 15.000 Axin2-LacZ-high cellen per 10-12 dieren.
Een flowcytometrie re-sort analyse van Axin2-high cellen onthulde een zuiverheid van meer dan 93% in het Cascade Blue-kanaal. Om de identiteit van deze cellen verder te bevestigen, hebben we een post-sort immunostaining uitgevoerd op zowel Axin2-high als Axin2-low cellen met behulp van anti-β-galactosidase antilichamen; hieruit bleek dat de Axin2-high cellen ~93,4% β-galactosidase-positieve cellen bevatten (meer dan 1.500 geanalyseerde cellen) en dat Axin2-low cellen ~4,8% β-galactosidase-positieve cellen bevatten.
Figuren en tabellen:
<img alt="Proces van cochlea-isolatie en LacZ-labeling; diagram van flowcytometrie-analyse." src="/files/ftp_upload/3432/3432fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figuur 1"> 
Figuur 1. Experimenteel paradigma. De bovenstaande figuur toont de algemene experimentele strategie en technieken zoals beschreven in de sectie protocol. Cochleae van wildtype en Axin2LacZ/+ muizen worden geoogst en gedissocieerd tot enkelvoudige cellen, die vervolgens werden behandeld met CUG, een fluorescent substraat voor β-galactosidase. Axin2-LacZ-high en -low cellen werden vervolgens gescheiden via flowcytometrie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3432/3432fig1large.jpg">Klik hier om een versie van deze afbeelding op volledig formaat te bekijken.</a>
<img alt="Flowcytometrie scatterplots, wildtype vs. Axin2-lacZ, debris, dubletten, levensvatbaarheid, LacZ-analyse." src="/files/ftp_upload/3432/3432fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figuur 2"> 
Figuur 2.Gating-strategieën. Deze figuur illustreert de gebruikte gating-strategieën voor flowcytometrie. A) Gedissocieerde wildtype cellen die dezelfde behandeling ondergingen als Axin2-LacZ-cellen worden hier geanalyseerd met in totaal 10.000 events. Het eerste paneel toont de side scatter area (SSC-A) tegenover de forward scatter area (FSC-A). Hier is een duidelijke groep events van een veel grotere omvang dan de events die dichter bij de y-as liggen. Deze events worden aangeduid als "Debris Negative". De volgende gate, A', analyseert de "Debris Negative"-cellen uit paneel A, wat 43,8% van het totaal aantal events bedraagt (zie onderstaande tabel). In dit paneel wordt de forward scatter height (FSC-H) tegenover de FSC-A gebruikt om dubletten uit te sluiten. Events die afwijken van het verwachte lineaire verloop van de plot worden uitgesloten. Deze voorbereiding levert doorgaans ~70% events binnen de aangewezen gate op, en de overige cellen worden uitgesloten. In paneel A'' wordt propidiumjodide (PI), gedetecteerd via het PE-Cy5-kanaal, gebruikt om dode cellen te labelen (5,3%). In het volgende paneel (A''') wordt het Cascade blue-kanaal gebruikt om het fluorescerende substraat CUG te detecteren. Hier bevatten de LacZ-high gates minder dan 1% van de totale events. B) Gedissocieerde cellen van Axin2-LacZ-muizen behandeld met CUG en PI worden hier geanalyseerd met in totaal 10.000 events. Identieke gates uit paneel A worden hier toegepast. B' laat zien dat 29,5% van de cellen als dubletten wordt uitgesloten, terwijl B'' aantoont dat 5,4% niet levensvatbaar is. De initiële gates voor LacZ-high en -low cellen worden getrokken met behulp van paneel B''', waarbij LacZ-high aanvankelijk is ingesteld op 19,7% en LacZ-low op 20,4%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3432/3432fig2large.jpg">Klik hier om een versie van deze afbeelding op ware grootte te bekijken.</a>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td>Eventnummer</td>
			<td>Percentage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A</td>
			<td>Wildtype-analyse</td>
			<td>10,000</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A'</td>
			<td>Debrisnegatief</td>
			<td>4,381</td>
			<td>43.80%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A''</td>
			<td>Dubbel Negatief</td>
			<td>3,116</td>
			<td>71.10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A'''</td>
			<td>PI-negatief</td>
			<td>2,951</td>
			<td>94.70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>LacZ-hoog</td>
			<td>16</td>
			<td>0.54%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>LacZ-laag</td>
			<td>2,790</td>
			<td>94.50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B</td>
			<td>Axin2-LacZ-analyse</td>
			<td>10,000</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B'</td>
			<td>Debris-negatief</td>
			<td>4,218</td>
			<td>42.2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B''</td>
			<td>Dubbelet Negatief</td>
			<td>2,973</td>
			<td>70.50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B'''</td>
			<td>PI-negatief</td>
			<td>2,813</td>
			<td>94.6%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>LacZ-hoog</td>
			<td>553</td>
			<td>19.70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>LacZ-laag</td>
			<td>573</td>
			<td>20.40%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabel 1. Kwantitatieve analyses van de gating-strategieën in Figuur 2.

<ol><li>Li, H., Liu, H., Heller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+from+the+adult+mouse+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med.%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells from the adult mouse inner ear.</a> Nat. Med.. 9, 1293-1299 (2003).</li>
<li>Oshima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+distribution+of+stem+cells+in+the+auditory+and+vestibular+organs+of+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Differential distribution of stem cells in the auditory and vestibular organs of the inner ear.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 8, 18-31 (2007).</li>
<li>Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449, 1003-1007 (2007).</li>
<li>Jaks, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5+marks+cycling%2C+yet+long-lived%2C+hair+follicle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Lgr5 marks cycling, yet long-lived, hair follicle stem cells.</a> Nat. Genet. 40, 1291-1299 (2008).</li>
<li>Kalani, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt-mediated+self-renewal+of+neural+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Wnt-mediated self-renewal of neural stem/progenitor cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 16970-16975 (2008).</li>
<li>Willert, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+proteins+are+lipid-modified+and+can+act+as+stem+cell+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wnt proteins are lipid-modified and can act as stem cell growth factors.</a> Nature. 423, 448-452 (2003).</li>
<li>Zeng, Y. A., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+proteins+are+self-renewal+factors+for+mammary+stem+cells+and+promote+their+long-term+expansion+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt proteins are self-renewal factors for mammary stem cells and promote their long-term expansion in culture.</a> Cell Stem Cell. 6, 568-577 Forthcoming.</li>
<li>Chai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Expression+of+Lgr5%2C+a+Wnt+Target+Gene%2C+in+the+Developing+and+Mature+Mouse+Cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Dynamic Expression of Lgr5, a Wnt Target Gene, in the Developing and Mature Mouse Cochlea.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. , Forthcoming.</li>
<li>Lustig, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+feedback+loop+of+Wnt+signaling+through+upregulation+of+conductin%2Faxin2+in+colorectal+and+liver+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Negative feedback loop of Wnt signaling through upregulation of conductin/axin2 in colorectal and liver tumors.</a> Mol. Cell Biol. 22, 1184-1193 (2002).</li>
<li>Diensthuber, M., Oshima, K., Heller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem%2Fprogenitor+cells+derived+from+the+cochlear+sensory+epithelium+give+rise+to+spheres+with+distinct+morphologies+and+features%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Stem/progenitor cells derived from the cochlear sensory epithelium give rise to spheres with distinct morphologies and features.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 10, 173-190 (2009).</li>
<li>Savary, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+stem%2Fprogenitor+cells+from+a+postnatal+cochlea+respond+to+Jagged1+and+demonstrate+that+notch+signaling+promotes+sphere+formation+and+sensory+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Cochlear stem/progenitor cells from a postnatal cochlea respond to Jagged1 and demonstrate that notch signaling promotes sphere formation and sensory potential.</a> Mech. Dev. 125, 674-686 (2008).</li>
<li>White, P. M., Doetzlhofer, A., Lee, Y. S., Groves, A. K., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cochlear+supporting+cells+can+divide+and+trans-differentiate+into+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian cochlear supporting cells can divide and trans-differentiate into hair cells.</a> Nature. 441, 984-987 (2006).</li>
<li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+growth+and+differentiation+of+hair+cell+progenitors+from+the+newborn+rat+cochlear+greater+epithelial+ridge%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation, growth and differentiation of hair cell progenitors from the newborn rat cochlear greater epithelial ridge.</a> J. Neurosci. Methods. 164, 271-279 (2007).</li>
</ol>

Geen conflicten van belang gemeld.

Onafhankelijke onderzoeksstudies hebben een beperkt regeneratief vermogen binnen de neonatale cochlea's gekenmerkt2,10,12,13. Met behulp van GFP-reportermuizen en flowcytometrie isoleerden White en collega's specifieke ondersteunende cellen van de cochlea en stelden vast dat deze kenmerken van progenitorcellen vertoonden12.
Er is aangetoond dat de canonieke Wnt-signaalroute stam-/progenitorcelpopulaties markeert in meerdere orgaansystemen, waaronder de hersenen, de melkkl...

<table><tbody><tr><td>Petrischaal, polystyreen, steriel Geriner Bio-one 35 x 10 mm &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>82050-540 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Celzeven, steriel, BD Biosciences, blauw, 40 &amp;mu;m &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>21008-949 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Gebalanceerde zoutoplossing (HBSS). Oplossing met calcium, magnesium en zonder fenolrood, steriel &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>45000-456 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar centrifugebuizen, polypropyleen, steriel, Greiner Bio-One, 50 ml &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>82050-346 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar centrifugebuizen, polypropyleen, steriel, Greiner Bio-One, 15 ml &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>82050-278 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>B-27 serumvrij supplement (50x), vloeibaar &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>N-2 supplement (100x), vloeibaar &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>bFGF, humane basische fibroblastengroeifactor &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0291 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>IGF-1, insulin-like growth factor-1 uit muis &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8779&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>EGF, epidermale groeifactor humaan &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;Gemodificeerd Eagle&amp;rsquo;s Medium/Ham&amp;rsquo;F-12 50/50 Mix: 1X, met L-glutamine en 15 mM HEPES&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>45000-350&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon ronde bodem buisjes, wegwerp, polystyreen, 12x75&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>60819-295&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine, 0,25% (1X) met EDTA 4Na, vloeibaar&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>ep Dualfilter TIPS 300uL, 960 TIPS&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Eppendorf</td><td>22491245&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-inhibitor, soja, gezuiverd&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS003570&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 40um celzeven&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>BD Biosciences</td><td>21008-949&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Multiwellplaten, polystyreen, Greiner Bio-One, onbehandelde platen, 6 wells&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>82050-846&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Markergen FACS Blue LacZ bèta-galactosidase detectiekit&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Marker Gene Technologies</td><td>M0255&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr></tbody></table>

isoleren van lacz-expressie cellen van mouse inner ear weefsels met behulp van flowcytometrie

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

De isolatie van specifieke celtypen maakt het mogelijk om zeldzame celpopulaties, zoals stam- en progenitorcellen, te analyseren. Een dergelijke benadering voor het bestuderen van weefsels van het binnenoor vormt een unieke uitdaging vanwege de schaarste aan cellen van belang en het beperkte aantal transgene reporter-muismodellen. Hier beschrijven we een protocol waarbij fluorescentie-geconjugeerde probes worden gebruikt om LacZ-positieve cellen uit neonatale cochlea's selectief te labelen.
De meest voorkomende onderliggende pathologie van sensorineuraal gehoorverlies is de onomkeerbare beschadiging en het verlies van cochleaire sensorische haarcellen, die nodig zijn om geluidsgolven om te zetten in neurale impulsen. Recent bewijs suggereert dat de auditieve en vestibulaire organen van muizen stam-/progenitorcellen bevatten die regeneratief potentieel kunnen hebben1,2. Deze bevindingen rechtvaardigen verder onderzoek, waaronder het identificeren van specifieke celtypen met kenmerken van stam-/progenitorcellen. Het is aangetoond dat de Wnt-signaleringsroute een cruciale rol speelt bij het in stand houden van stam-/progenitorcelpopulaties in verschillende orgaansystemen3-7. Onlangs hebben wij Wnt-responsieve Axin2-expresserende cellen in de neonatale cochlea geïdentificeerd, maar hun functie is grotendeels onbekend8.
Om het gedrag van deze Wnt-responsieve cellen in vitro beter te begrijpen, hebben we een methode ontwikkeld om Axin2-expresserende cellen te isoleren uit de cochleae van Axin2-LacZ reportermuizen9. Door middel van flowcytometrie om Axin2-LacZ-positieve cellen uit de neonatale cochleae te isoleren, konden we op onze beurt diverse experimenten op levende cellen uitvoeren om hun gedrag als stam-/progenitorcellen te onderzoeken. Hier beschrijven we in detail de stappen voor de microdissectie van de neonatale cochlea, de dissociatie van deze weefsels, het labelen van de LacZ-positieve cellen met behulp van een fluorogeen substraat en de cellsortering. Technieken voor het dissocieren van cochleae tot enkelvoudige cellen en het isoleren van cochleaire cellen via flowcytometrie zijn reeds beschreven2,10-12. We hebben aanpassingen aangebracht in deze technieken om een nieuw protocol vast te stellen voor het isoleren van LacZ-expresserende cellen uit de neonatale cochlea.

Flowcytometrie is een krachtig instrument waarmee specifieke celpopulaties kunnen worden geïsoleerd en bestudeerd. Dit protocol beschrijft de stappen voor het isoleren van LacZ-expresserende cellen uit cochleaire weefsels van neonatale transgene muizen. Gedissocieerde cochleaire cellen werden gelabeld met fluorescentie-geconjugeerde substraten van β-galactosidase voorafgaand aan de scheiding via flowcytometrie.

Isoleren van LacZ-expressie Cellen van Mouse Inner Ear weefsels met behulp van flowcytometrie

De isolatie van specifieke celtypen maakt het mogelijk om zeldzame celpopulaties, zoals stam-/progenitorcellen, te analyseren. Een dergelijke benadering voor het bestuderen van weefsels van het binnenoor ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om lax Z-positieve cellen uit het cochlea van neonatale muizen te isoleren met behulp van flowcytometrie. Dit wordt bereikt door eerst een groot aantal muis-cochlea's in een relatief kort tijdsbestek te isoleren om de cellen levensvatbaar te houden en voldoende startweefsel te hebben. Als tweede stap worden de LAX Z-positieve cellen gedissocieerd en vervolgens gelabeld om het weefsel voor te bereiden op sortering.De cellen worden vervolgens gesorteerd via flowcytometrie. De resulterende LAX Z high en lax low populaties kunnen daarna worden gebruikt voor verdere experimenten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het onderzoek naar het oor, zoals wat de genprofielen of specifieke celpopulaties in het binnenoor zijn.De procedure zal worden gedemonstreerd door Taha Gen, een geneeskundestudent uit ons laboratorium. Vul eerst Petri-schalen van 35 millimeter met HBSS en plaats deze op een ijsblok. Gebruik vervolgens irisscharen om 12 tot 15 geëuthanaseerde postnatale axon, two laxy reporter- en wildtype-muizen van nul tot drie dagen oud te onthoofden.Plaats de koppen in een Petri-schaal van 60 millimeter op een

isolating-lacz-expressing-cells-from-mouse-inner-ear-tissues-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Ontsteking speelt een centrale rol in de pathogenese van ischemische beroerte. Toenemend bewijs suggereert dat het als een tweesnijdend zwaard werkt, wat vroege hersenschade verergert, maar ook bijdraagt aan later herstel. Dit protocol beschrijft de isolatie van immuuncellen uit de ischemische hersenen en hun daaropvolgende flowcytometrische fenotypering.

Isolatie en Flow cytometrische analyse van de immuuncellen van de ischemische hersenen van muizen

Er bestaan verschillende zeldzame populaties van dendritische celsubpopulaties in lymfoïde organen en daarom zijn ze lastig te isoleren in voldoende aantallen en zuiverheid voor immunologische experimenten. Hier beschrijven we een methode met hoge efficiëntie en hoog rendement voor het isoleren van alle momenteel bekende belangrijke subpopulaties van dendritische cellen in de milt van muizen.

Een efficiënte en High Yield methode voor het isoleren van de muis dendritische cel subsets

Er is een groeiende interesse in de kwantitatieve karakterisering van intestinale lymfocyten vanwege de toenemende erkenning dat deze cellen een cruciale rol spelen bij een verscheidenheid aan intestinale en systemische ziekten. In dit protocol beschrijven we hoe je enkele celpopulaties kunt isoleren uit verschillende compartimenten van de dunne darm voor daaropvolgende flowcytometrische karakterisering.

Isolatie en Flowcytometrische karakterisatie van muizen dunne darm lymfocyten

Miljoenen mensen lijden aan retinale degeneratieve ziekten die leiden tot onomkeerbare blindheid. Een gemeenschappelijk element van veel van deze ziekten is het verlies van retinale ganglioncellen (RGC's). Dit gedetailleerde protocol beschrijft de isolatie van primaire murine RGC's door positieve en negatieve selectie met flowcytometrie.

Isolatie van Primaire Murine Retinale Ganglioncellen (RGC&#39;s) door Flow Cytometry

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de isolatie van lymfocyten van de inductieve sites met inbegrip van de darm-geassocieerde lymfoïde weefsel Peyer van patches en de zuig mesenterische lymfklieren, en de effector met inbegrip van de lamina propria en de intestinale epitheel van het kleine intestinale immuunsysteem.

Isoleren van lymfocyten van het immuunsysteem intestinale kleine muis

Na virale infectie, nier herbergt een relatief groot aantal CD8+ T cellen en biedt een kans om niet-mucosale TRM cellen te bestuderen. Hier beschrijven we een protocol om muisnierlymfocyten te isoleren voor stromingscytometrieanalyse.

Isolatie van Mouse Kidney-Resident CD8+ T cellen voor Flow Cytometry Analysis

Dit werk beschrijft een protocol voor de kwantificering van globale histonmodificaties met behulp van intranucleaire flowcytometrie in geïsoleerde hersenmicroglia. Het werk bevat ook het microglia-isolatieprotocol dat werd gebruikt voor het verzamelen van gegevens.

Kwantificering van globale histon posttranslationele modificaties met behulp van intranucleaire flowcytometrie in geïsoleerde microglia in de hersenen van muizen

Hier wordt een efficiënt protocol gepresenteerd voor de fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) isolatie van spiersatellietcellen van muizenledematen, aangepast aan de studie van transcriptieregulatie in spiervezels door splitsing onder doelen en afgifte met behulp van nuclease (CUT&amp;RUN).

Een efficiënt protocol voor CUT&amp;RUN-analyse van FACS-geïsoleerde muissatellietcellen

Dit artikel beschrijft een methode voor magnetische isolatie op basis van kralen van endotheelcellen van muizen uit dermale lymfatische capillairen. De geïsoleerde lymfatische endotheelcellen kunnen worden gebruikt voor stroomafwaartse in-vitro-experimenten en eiwitexpressie-analyse.

Isolatie van dermale lymfatische endotheelcellen bij muizen

Om de immuunrespons op hersenaandoeningen te onderzoeken, is een veelgebruikte benadering het analyseren van veranderingen in immuuncellen. Hier worden twee eenvoudige en effectieve protocollen gegeven voor het isoleren van immuuncellen uit muizen hersenweefsel en schedelbeenmerg.

Het isoleren van immuuncellen uit de hersenen en de schedel van muizen

Dit protocol beschrijft de isolatie van levende immuun- en niet-immuunpopulaties uit de muizenlong in een stabiele toestand en na griepinfectie. Het biedt ook poortstrategieën voor het identificeren van subsets van epitheelcellen en myeloïde cellen.

Isolatie van levende myeloïde en epitheelcelpopulaties uit de muizenlong

Leer de isolatie van LacZ-expressiecellen uit het cochleaweefsel van neonatale muizen met behulp van flowcytometrie. Deze methode maakt efficiënte sortering van specifieke celpopulaties mogelijk voor genexpressieonderzoek.

Isoleren van LacZ-expressie Cellen van Mouse Inner Ear weefsels met behulp van flowcytometrie

Meer video's verkennen