Name: Elektrofysiologische karakterisatie van GFP-uitdrukken celpopulaties in de Intact Retina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Leer elektrofysiologische karakterisatie van fluorescerende celpopulaties in de intacte muisretina met behulp van patch-clamp en tweefotonenmicroscopie. Deze methode maakt gerichte opnames van lichtreacties mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (WE849/16 1 / 2 tot KD en RW). We zijn dankbaar dat Thomas Euler (Töbingen, Duitsland) voor de lichte stimulatie software QDS.

De volgende beschrijving wordt ervan uitgegaan dat de experimentator een basiskennis van het netvlies structuur, de patch-clamp-opname, en twee-foton microscopie is. Voor nuttige informatie over het opzetten en runnen van een patch-clamp installatie en twee-foton imaging-systeem te zien Refs [7-12]. 1. Dier-en het prepareren van weefsels <ol><li> Houd de muis donker aangepast voor minstens 3 uur In de tussentijd bereiden 1-2 L van extracellulaire oplossing bestaande uit (in mm) 125 NaCl, KCl 2,5, 1 CaCl 2, 1,6 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 10 D-glucose en evenwicht dat tot pH 7,4 door middel van vergassing met carbogen (5% CO 2 in O 2) bij kamertemperatuur. </li> een <li> Euthanaseren van de muis in een luchtdichte kamer van CO 2 een overdosis, gevolgd door cervicale dislocatie. Deze procedure en de volgende stappen moeten worden uitgevoerd in het donker. Gebruik dim lange golflengte verlichting (we blokkeren korte golflengten van een koude lichtbron met een 690 nm-longpass filter) om persoonlijke visie te ondersteunen terwijl het dier in de ogen aan het donker aangepaste (muizen alleen slecht zicht in het rode deel van het lichtspectrum). Voor het werk in volledige duisternis gebruik van infrarood verlichting (&gt; 800 nm) en slijtage night-vision goggles. </li><li> Ophelderen ogen met een paar van gebogen iris schaar en overbrengen naar een gerecht van extracellulaire oplossing onder een dissectie microscoop. </li><li> Verwijder het hoornvlies en corpus ciliare door het openen van de ogen bol langs de ora serrata (de grens tussen netvlies en corpus ciliare) met een paar van de lente schaar (we eerst een lancet te gebruiken om doorboren een startpunt voor het snijden). Haal de lens en het netvlies zorgvuldig gescheiden van het pigment epitheel. Als de richting van het netvlies is cruciaal voor je studie, het als aangeven in Ref [12]. Snijd de optische zenuw tussen netvlies en pigment epitheel en verwijder het netvlies van de oogschelp. Let op de richting van de retinale oppervlakken: de binnenkant van de gekrulde-up netvlies is het Ganglion cel kant, de buitenkant is de fotoreceptor kant. </li><li> Verwijder het glasvocht van het netvlies binnenste oppervlak door het voorzichtig uit met de hulp van een houten tandenstoker. Hiervoor gebruikt u een klein volume van de extracellulaire oplossing die alleen maar dekt het netvlies. Het glasvocht houdt zich aan de tandenstoker en kan centrifugaal worden weggesleept het netvlies. Dan, van toepassing korte insnijdingen langs de retinale omtrek te faciliteren afvlakking van het weefsel. </li><li> Overdracht van het netvlies in de opname kamer fotoreceptor naar beneden, spreid het uit op de glazen bodem (we gebruiken een fijn penseel) en met een nylon-geregen frame van roestvrij staal te immobiliseren. Bereid de tweede netvlies op dezelfde manier en houd het donker aangepast carboxygenated extracellulaire oplossing voor later gebruik. </li></ol> 2. Opnamen <ol><li> Installeer de opname kamer in het donker onder een rechte laser scanning microscoop en continu superfuse de retinale bereiding (niet minder dan 5 ml / min) met carboxygenated extracellulaire oplossing verwarmd tot 35 ° C. De microscoop (ook uitgerust met een infrarood-gevoelige CCD-camera) is gelegen op een schokabsorberende lucht tafel in een kooi van Faraday voor elektronische afscherming. Dek de kooi met een niet-transparant gordijn aan de voorbereiding te houden in de duisternis. We hebben ook af te schermen licht van computer-monitoren door rode transparante film. </li><li> Tune de infrarood laser om 850 tot 870 nm of langere golflengten, overschakelen naar en geblokkeerde modus staat, en twee-foton excitatie aan GFP-expressie brengende cellen te visualiseren gebruiken. Het verkleinen van de laser-uitvoer via grijsfilters gecontroleerd door de laser scanning software naar beneden in een mate die is net voldoende voor de duidelijke erkenning van de fluorescerende cel </li><li> Voor de patch-clamp opnamen in de huidige-clamp modus glas micropipetten (we gebruiken borosilicaatglas buis van 1,5 mm diameter en 0.225 mm wanddikte) gevuld met intracellulaire oplossing die bestaat uit (in mm) 125 K-gluconaat, 10 KCl, 0,5 EGTA, 10 HEPES, getitreerd tot pH 7,4 met KOH (het geven van een pipet weerstand van ongeveer 5 MΩ). Merk op dat andere experimentele condities, zoals voltage-clamp het opnemen van een andere oplossing nodig. Als kleurstof injecties gewenst zijn, voeg een fluorescente probe (we gebruiken 10 mM Alexa Fluor 594) of een tracer molecule (3% Neurobiotin). Steek de micropipet in de houder en zorg ervoor dat de referentie-elektrode (gechloreerde zilver draad) in contact komt met de extracellulaire oplossing in de opname kamer. </li><li> Druk op de micropipet en gericht op een GFP expressie cel (wij gebruiken een 40-voudige water immersie objectief, NA 1.25). Amacrine cellichamen zijn gelegen in het ganglion cellaag (direct onder de oppervlakte in de huidige oriëntatie van het netvlies) als in het proximale deel van de binnenste nucleaire laag (ongeveer 55 tot 75 micrometer diep in de voorbereiding). Voordat micropipet contact met de beoogde cel, de binnenste beperken membraan (een omhulling van gliale endfeet) op het netvliesoppervlak moet worden doorgedrongen. Succesvolle penetratie is erkend door intracellulaire oplossing die wordt verdreven uit het micropipet tip en los de binnenste membraan van het beperken van het onderliggende retinaal weefsel als kunnen worden waargenomen op een infrarood transmissie beeld dat met de IR-CCD camera. </li><li> Aanpak van de gewenste cel door het vergelijken van de soma positie van de twee-foton beeld met de afbeelding van de IR-CCD camera die de positie van de opname micropipet. Merk op dat deze stap niet gemakkelijk bereikt en vergt enige oefening, want de GFP expressie cel moet worden erkend in het infrarood transmissie afbeelding om de micropipet direct naar toe. De juiste targeting is bereikt wanneer de micropipet tip oorzaken kuiltjes van het celoppervlak die kan worden gezien in de twee-foton beeld. Alternatief voor deze procedure, gebruik dan een fluorescerende kleurstof (bv. Alexa Fluor 594, 100 uM) in de intracellulaire oplossing voor de micropipet positie zien in de twee-foton image. Twee-foton excitatie infrarood zorgt voor voldoende fluorescentie van deze kleurstof om de micropipet waarneembaar. Voor dit doel, past u de detectie-bereik in de laser scanning software uit te breiden tot rode fluorescentie. </li><li> Laat de druk van de micropipet en het verkrijgen van een whole-cell patch-clamp-configuratie in de huidige-klem-modus. Een bruikbare opname moet geven een membraanpotentiaal van -50 tot -55 mV en voor ten minste 20 minuten. </li><li> Aanwezig zijn visuele stimuli gecreëerd door een stimulatie software (we gebruiken QDS door Thomas Euler, Universiteit van Tübingen, Duitsland), 11 op een computer monitor. Pas de ruimtelijke positie van de stimulatie te midden van de opgenomen cel: Markeer de cel positie op de monitor met de overdracht beeld van de IR-CCD-camera en in het midden een spot-als stimulus op het. Stem de stimulus intensiteit door het invoegen van grijsfilters in de straal pad. Voor het kalibreren van de monitor spectrum en intensiteit zie ref [14]. Kies een prolonged interstimulus interval (bv. 15 s) om de aanpassing te voorkomen. Neem een ​​fotodiode in de straal weg naar record van de stimulus timing te houden. </li><li> Start de stimulatie protocol en noteer de lichte reacties (we gebruiken een samplefrequentie van 10 kHz met een filtering op 5 kHz voor niet-stekelige cellen; voor spike het opnemen van een hogere sampling rate als 20 kHz wordt aanbevolen). Gebruik het licht stimulatie software om de opname-software te activeren. </li><li> Voor het vullen van kleurstof laat de fluorescerende stof diffunderen in de opgenomen cel voor 30-45 min voor zorgvuldig het terugtrekken van de micropipet van de cel. Zorg ervoor dat niet te trekken uit het cellichaam. Als de niet-fluorescerende tracer Neurobiotin werd gebruikt, moet visualisatie door binding aan streptavidine geconjugeerd aan een fluorofoor (we gebruiken streptavidine-Cy3, 1:400 gedurende de nacht bij 4 ° C na 20 min paraformaldehyde fixatie van het netvlies, voor dye-koppeling studies streptavidine incubatie kan worden verlengd tot 3 d). Als alternatief kunnen injecties ook worden uitgevoerd metscherpe elektroden (&gt; 100 MΩ) wanneer de kleurstof iontophoretically wordt gedreven in de gespietst cel (rechthoekige pulsen: 0.25-1 nA, 100 ms, interval 100 ms, totale tijd 3-6 min). </li></ol> 3. Representatieve resultaten: De volgende resultaten zijn afkomstig van een studie over een muis te drukken groen fluorescerend eiwit (GFP) in het kader van de promotor voor tyrosine hydroxylase 13,14, het enzym katalyseert de snelheidsbepalende stap in catecholamine synthese (TH:: GFP muis). Op basis van de helderheid van het GFP-signaal twee verschillende celpopulaties worden onderscheiden (figuur 2A). Cellen die het hogere niveau beschikken over GFP cellichamen gelegen in de binnenste nucleaire laag (INL, figuur 2A) of verplaatst in het ganglion cellaag (GCL, figuur 2B) en stratificeren in het midden van de binnenste laag plexiform (IPL, figuur 2C) . Zij werden geïdentificeerd als type 2-cellen 14-16 en kan systematisch worden bestudeerd met betrekking tot de morfologie (Figuur 3) en te kiezenrical activiteit (figuur 4), hoewel de bevolkingsdichtheid bedraagt ​​slechts 250 cellen / mm 2. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Schematische weergave van de experimentele opstelling. Twee-foton excitatie (rode stippellijn licht pad) van fluorofoor expressie cellen in het netvlies intact laat visuele targeting op basis van een micropipet (groen emissie lichtpad). Het netvlies wordt blootgesteld aan optische stimuli geprojecteerd door de condensor van de microscoop (gele lichtpad), en cellulaire lichte reacties zijn opgenomen. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. GFP-expressie brengen in een retinale flatmount van een TH:: GFP muis. Twee populaties kan worden onderscheiden door de helderheid van het GFP-signaal: type 1 cellen (DA cellen) gelegen in het INL met een zwakke fluorescentie (A, zie pijlpunten) en intens gelabeld type 2-cellenmet cellichamen, hetzij in het INL (A, zie pijlen) of ontheemden in de GCL (B) en een dendritische gelaagdheid in stratum S3 van de IPL (C). Schaal van bars, 50 um. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Morfologie van een type 2 cel geïnjecteerd met de tracer Neurobiotin. De tracer werd vervolgens gevisualiseerd door streptavidine-Cy3 binding (magenta). De microfoto, die ook beeltenis van de GFP-signaal (groen), is een projectie van het beeld stapels met betrekking tot de GCL-en IPL. Schaalbalk, 50 um. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Licht de antwoorden van een type 2 cel bevindt zich in het GCL. Reactie patroon naar wit licht full-field verlichting van toenemende intensiteit in de scotopische bereik. Stimulus intensiteit wordt gegeven in photoisomerizations per staaf per seconde (Rh * / staaf / s). Een langdurige stimulans van 3 s werd gebruikt voor een betere verschillendeion van de respons componenten op stimulus onset (de respons) en offset (OFF respons).

<ol><li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+plan+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The fundamental plan of the retina.</a> Nat. Neurosci. 4, 877-886 (2001).</li>
<li>Baccus, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+and+computation+in+inner+retinal+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Timing and computation in inner retinal circuitry.</a> Annu. Rev. Physiol. 69, 271-290 (2007).</li>
<li>Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wässle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+green+fluorescent+protein+in+retinal+neurons+of+four+transgenic+mouse+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines.</a> Neuroscience. 160, 126-139 (2009).</li>
<li>Siegert, S., Gross-Scherf, B., Del Punta, K., Didkovsky, N., Heintz, N., Roska, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+address+book+for+retinal+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic address book for retinal cell types.</a> Nat. Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Euler, T., Detwiler, P. W., Denk, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directionally+selective+calcium+signals+in+dendrites+of+starburst+amacrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directionally selective calcium signals in dendrites of starburst amacrine cells.</a> Nature. 418, 845-852 (2002).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSakmann%2C+B+%22Single-Channel+Recording%22">Single-Channel Recording</a>. , Plenum Press. (1995).</li>
<li>Jackson, M. B. Whole-cell voltage clamp recording. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJackson%2C+MB+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22">Current Protocols in Neuroscience</a>. Gerfen, C. , Wiley. (1997).</li>
<li>Majewska, A., Yiu, G., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+custom-made+two-photon+microscope+and+deconvolution+system%5BTitle%5D)+AND+%22Pf%C3%BCgers+Arch.+-+Eur.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A custom-made two-photon microscope and deconvolution system.</a> Pfügers Arch. - Eur. J. Physiol. 441, 398-408 (2000).</li>
<li>Yuste, R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYuste%2C+R+%22maging+in+Neuroscience+and+Development%3A+A+Laboratory+Manual%22">maging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. (2005).</li>
<li>Euler, T., Hausselt, S. E., Margolis, D. J., Breuninger, T., Castell, X., Detwiler, P. B., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyecup+scope+-+optical+recordings+of+light+stimulus-evoked+fluorescence+signals+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Arch.+-+Eur.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Eyecup scope - optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina.</a> Pflügers Arch. - Eur. J. Physiol. 457, 1393-1414 (2009).</li>
<li>Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+targeted+recording+of+GFP-expressing+neurons+for+light+responses+and+live-cell+imaging+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina.</a> Nat. Protoc. 5, 1347-1352 (2010).</li>
<li>Matsushita, N., Okada, H., Yasoshima, Y., Takahashi, N., Kiuchi, K., Kobayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+tyrosine+hydroxylase+promoter+activity+during+midbrain+dopaminergic+neuron+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Dynamics of tyrosine hydroxylase promoter activity during midbrain dopaminergic neuron development.</a> J. Neurochem. 82, 295-304 (2002).</li>
<li>Knop, G. C., Feigenspan, A., Weiler, R., Dedek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inputs+underlying+the+ON-OFF+light+responses+of+type+2+wide-field+amacrine+cells+in+TH-GFP+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inputs underlying the ON-OFF light responses of type 2 wide-field amacrine cells in TH-GFP mice.</a> J. Neurosci. 31, 4780-4791 (2011).</li>
<li>Zhang, D. Q., Stone, J. F., Zhou, T., Ohta, H., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+genetically+labeled+catecholamine+neurons+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Characterization of genetically labeled catecholamine neurons in the mouse retina.</a> Neuroreport. 15, 1761-1765 (2004).</li>
<li>Contini, M., Lin, B., Kobayashi, K., Okano, H., Masland, R. H., Raviola, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+input+to+ON-biploar+cells+onto+the+dopaminergic+neurons+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Synaptic input to ON-biploar cells onto the dopaminergic neurons of the mouse retina.</a> J. Comp. Neurol. 518, 2035-2050 (2010).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).</li>
<li>Dedek, K., Breuninger, T., de Sevilla Müller, L. P., Maxeiner, S., Schultz, K., Janssen-Bienhold, U., Willecke, K., Euler, T., Weiler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+type+of+interplexiform+amacrine+cell+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A novel type of interplexiform amacrine cell in the mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 30, 217-228 (2009).</li>
<li>Denk, W., Detwiler, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+recording+of+light-evoked+calcium+signals+in+the+functionally+intact+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Optical recording of light-evoked calcium signals in the functionally intact retina.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 7035-7040 (1999).</li>
</ol>

Muizen werden behandeld en ingeslapen in overeenstemming met de institutionele richtlijnen voor dierenwelzijn en de wetten op dierproeven uitgegeven door de Duitse regering.

Deze methode biedt de mogelijkheid om elektrische eigenschappen van bepaalde neuronen in de retina intact onder visuele begeleiding bestuderen, zonder beïnvloeding van de adaptational conditie van het netvlies. Het is met name geschikt voor de karakterisering van de cellen die zijn op dit moment nogal slecht bestudeerd vanwege de lage bevolkingsdichtheid zoals de meeste populaties van amacrine cellen. Twee-foton excitatie maakt hoge resolutie en hoog contrast beeldvorming zelfs vanuit diepere delen van het weefsel 17, een voorwaarde voor nauwkeurige targeting en succesvolle patch-spannen van cellen met name in de INL met zijn hoge dichtheid van cellichamen. De geïsoleerde muis netvlies is haalbaar voor 3-4 uur onder de experimentele omstandigheden. Als de tweede netvlies wordt opgeslagen in volledige duisternis onder voortdurende carbogen vergassing, behoudt de paarse kleur van ongebleekte photopigment en kan gebruikt worden na het beëindigen van experimenten met de eerste netvlies. In het begin, gericht op degeselecteerde cel met de micropipet in de retinale wholemount is een beetje uitdagend en vereist enige oefening, vooral bij het werken in het donker. Inclusief een fluorescerende kleurstof in het micropipet kan vereenvoudiging van de procedure, omdat de cel en micropipet zijn zichtbaar onder twee-foton excitatie op hetzelfde moment. Echter, kan het toevoegen van componenten aan de intracellulaire oplossing belemmeren gigaseal vorming of kan de opnamekwaliteit te lijden. Een keer met succes, kan een goede opname duurt ongeveer 1 uur Overwegende dat de infrarood-excitatie licht zelf is slechts in geringe mate geabsorbeerd door het netvlies fotoreceptoren, opgewonden GFP-expressie cellen licht uitstralen in het zichtbare deel van het spectrum. Echter, fluoroforen enthousiast slechts in een klein brandpunt volume dat niet waarschijnlijk is de adaptational toestand van het netvlies te veranderen. Des te meer, excitatie is alleen nodig voor het richten en kan worden uitgeschakeld tijdens het opnemen van het licht de reacties. De usefulness van deze aanpak is al aangetoond door studies over specifieke populaties van cellen amacrine 14,18 uit die anders elektrofysiologische opnames mogelijk zou zijn alleen per ongeluk 12. Tot slot kan deze krachtige techniek verder worden uitgebreid door het opnemen van een farmacologische benadering 14, Ca 2 + imaging 19 of met behulp van ingespoten cellen voor immunocytochemische studies of elektronenmicroscopie. Op die manier kan de functionele positie van een bepaald celtype in de retinale circuits worden ontrafeld.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagens / Equip-ment </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> Night-vision goggles </td><td> Gutzeit GmbH, Warthausen, Duitsland </td><td> Xtron F1 </td><td> omvat een 800 nm lichtbron </td></tr><tr><td> Optische filter </td><td> Schott, Mainz, Duitsland </td><td> RG9 </td><td> longpass filter met cutoff bij 690 nm </td></tr><tr><td> Iris schaar </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14061-09 </td><td> gebogen met 22 mm zaagblad </td></tr><tr><td> Spring schaar </td><td> Fine Science Tools </td><td> 15000-00 </td><td> rechte met 3 mm zaagblad </td></tr><tr><td> Opname kamer </td><td> Luigs &amp; Neumann GmbH, Ratingen, Duitsland </td><td> 200 tot 100 500 0180 type A (TC) </td><td> Teflon kamer met bottom-gemonteerde glazen afdekplaat slip (ongeveer 0,15 mm; No 200-100 500 0182) </td></tr><tr><td> Boiler </td><td> Multichannel Systems, Reutlingen, Duitsland </td><td> PH01, TC01 </td><td> verwarmbare perfusie canule met de temperatuur sEnsor en temperatuurregelaar </td></tr><tr><td> Laser scanning microscoop </td><td> Leica Microsystems </td><td> DM LFS </td><td> gecontroleerd door Leica Confocale Software </td></tr><tr><td> Lucht tafel </td><td> Newport </td><td> VH 3036W-OPT </td><td></td></tr><tr><td> Laser </td><td> Spectra-Physics </td><td></td><td> Tsunami Mode-locked Ti: saffier-laser </td></tr><tr><td> CCD-camera </td><td> PCO AG, Kelheim, Duitsland </td><td> PixelFly QE </td><td> met inbegrip van controle-software </td></tr><tr><td> Micropipet glazen capillairen </td><td> Hilgenberg, Malsfeld, Duitsland </td><td> 1408411 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipet puller </td><td> Sutter Instrument </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A-20004 </td><td> fluorescerende kleurstof </td></tr><tr><td> Neurobiotin </td><td> Axxora </td><td> VC-SP-1120-M050 </td><td> niet-fluorescerende tracer </td></tr><tr><td> Streptavidine-Cy3 </td><td> Dianova </td><td> 016-160-084 </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulator </td><td> Luigs &amp; Neumann GmbH, Ratingen, Duitsland </td><td> 210-100 000 0010 </td><td> gemotoriseerde Mini25 manipulator unit met display SM-5 </td></tr><tr><td> Patch-clamp versterker </td><td> NPI electronic GmbH, Tamm, Duitsland </td><td> SEC-05LX NPI </td><td></td></tr><tr><td> Digitizer </td><td> National Instruments </td><td> BNC-2090 </td><td></td></tr><tr><td> Data acquisitie software WinWCP </td><td> John Dempster, Universiteit van Schotland, Glasgow, Verenigd Koninkrijk </td><td></td><td> http://spider.science.strath. ac.uk / sipbs / software.htm </td></tr><tr><td> Visuele stimulus generator QDS </td><td> Thomas Euler, Universiteit van Tübingen, Duitsland </td><td></td><td> moet worden bediend op een aparte computer de aansturing van 2 monitoren (user interface, stimulus monitor) </td></tr><tr><td> Grijsfilters </td><td> ITOS, Mainz, Duitsland </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

elektrofysiologische karakterisatie van gfp-uitdrukken celpopulaties in de intact retina

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Het bestuderen van de fysiologische eigenschappen en synaptische verbindingen van specifieke neuronen in de intact weefsel is een uitdaging voor die cellen die opvallende morfologische kenmerken ontbreken of tonen een lage bevolkingsdichtheid. Dit geldt vooral voor het netvlies amacrine cellen, een buitengewoon pluriforme klasse van interneuronen dat ongeveer 30 subtypes bij zoogdieren een omvatten. Ondanks dat een cruciaal onderdeel van de visuele verwerking door het vormgeven van de retina uitgang 2, zijn de meeste van deze subtypes niet bestudeerd tot nu toe in een functionele context, want de komst van deze cellen met een registratie-elektrode is een zeldzame gebeurtenis. Onlangs heeft een veelheid van transgene muis lijnen beschikbaar die uitdrukken fluorescerende markers, zoals groen fluorescerend eiwit (GFP) onder de controle van promotoren voor membraan receptoren of enzymen die specifiek zijn voor slechts een subset van neuronen in een bepaald weefsel 3,4. Deze pre-gelabelde cellen zijn dus accessible aan gerichte micro-elektrode te richten onder microscopische controle, waardoor de systematische studie van hun fysiologische eigenschappen in situ. Echter, is de excitatie van fluorescerende markers begeleid door het risico van fototoxiciteit voor het levend weefsel. In het netvlies, is deze aanpak bovendien gehinderd door het probleem dat excitatielicht juiste stimulatie van de fotoreceptoren oorzaken, dus het toebrengen van photopigment bleken en het overbrengen van de retina circuits in een licht aangepaste conditie. Deze nadelen worden ondervangen door met behulp van infrarood excitatie geleverd door een geblokkeerde modus laser in korte pulsen van de femtoseconde bereik. Twee-foton excitatie levert energie voldoende voor fluorofoor excitatie en op hetzelfde moment beperkt de opwinding tot een klein volume weefsel het minimaliseren van de gevaren van zonbeschadigde 5. Ook laat het netvlies reageren op visuele stimuli, aangezien infrarood licht (&gt; 850 nm) is slechts in geringe mate geabsorbeerd door photopigments 6. in situ opnames van GFP-expressie brengen die visueel het doelwit zijn van twee-foton excitatie. Het netvlies is bereid en in stand gehouden in de duisternis en kan worden onderworpen aan optische stimuli die volgens de prognoses door de condensor van de microscoop (figuur 1). Patch-clamp-opname van het licht de reacties kan worden gecombineerd met kleurstof vullen van de morfologie te openbaren en te controleren op gap junction-gemedieerde kleurstof koppeling aan naburige cellen, zodat de doelcel kan door bestudeerd op verschillende experimentele niveaus.

Dit artikel geeft de registratie van de individuele cellen van fluorescent gelabelde neuronale populaties in het intacte muis netvlies. Door het gebruik van twee-foton excitatie infrarood transgenetically gelabelde cellen waren gericht voor patch-clamp opnamen om hun licht te antwoorden, receptieve veld eigenschappen, en morfologie studie.

Elektrofysiologische karakterisatie van GFP-uitdrukken celpopulaties in de Intact Retina

Het bestuderen van de fysiologische eigenschappen en synaptische verbindingen van specifieke neuronen in intact weefsel vormt een uitdaging voor die cellen die geen ...

Het algemene doel van deze procedure is om de lichtresponsen en de morfologie van individuele neuronen in het intacte retina te bestuderen met behulp van een muizenlijn die een fluorescentiemarkering uitsluitend in specifieke celtypen tot expressie brengt. Dit wordt bereikt door eerst het oog te dissekeren om een geïsoleerd retina te verkrijgen. De tweede stap is om het retina onder een laser scanning microscoop te plaatsen en een cel te visualiseren via tweefoton infraroodexcitatie.Vervolgens wordt een micropipet gebruikt om een whole-cell patchclamp-configuratie te verkrijgen voor registratie en het vullen met kleurstof. Uiteindelijk maakt deze preparatie registraties mogelijk van cellulaire reacties op fotostimulatie en onthult het de morfologie van de geregistreerde cel via confocale microscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals ongeleide patchclamp-registratie van het retina, is dat de registratie visueel kan worden gericht op een fluorescent gelabelde cel zonder het retina te stimuleren met het excitatielicht.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het onderzoek naar het netvlies, zoals wat de bijdrage is van een specifieke celpopulatie aan de verwerking van visuele informatie, zelfs wanneer de celpopulatie een lage dichtheid heeft en geen onderscheidende morfologische kenmerken vertoont die identificatie kunnen vergemakkelijken. Begin dit experiment door de muis ten minste drie uur voor het experiment aan het donker te laten wennen.Bereid ondertussen de extracellulaire oplossing voor zoals beschreven in het bijbehorende manuscript en belucht deze met carbogeen bij kamertemperatuur. Offer daarna de muis en enucleer de ogen met een gebogen irisschaar. Breng ze over naar een schaal met extracellulaire oplossing.Plaats het vervolgens met een veerschaartje onder een dissectiemicroscoop. Verwijder het hoornvlies en het ciliairlichaam door de oogbol langs de ora serrata te openen. Neem de lens eruit en scheid voorzichtig het netvlies van het pigmentepitheel.Knip daarna de oogzenuw door tussen het netvlies en het pigmentepitheel. Verwijder het netvlies uit de oogbeker. Let op dat de binnenkant van het opgerolde netvlies de zijde van de ganglioncellen is.De buitenkant is de zijde van de fotoreceptoren. Verwijder vervolgens het glasvocht van het binnenoppervlak van het netvlies door dit voorzichtig weg te trekken met behulp van een houten tandenstoker. Maak daarna korte incisies langs de rand van het netvlies om het platdrukken van het weefsel te vergemakkelijken.Breng vervolgens het retina over naar de registratiekamer met de fotoreceptorkant naar beneden. Spreid het met een fijn penseel uit op de glazen bodem en immobiliseer het met een frame van roestvrij staal met nylon draden. Plaats de registratiekamer in het donker onder een rechtopstaande laser-scanningmicroscoop.Perfuseer het retinaal preparaat continu met een snelheid van niet minder dan 5 mL per minuut. Met een met zuurstof verzadigde extracellulaire oplossing die is verwarmd tot 35 °C, is de microscoop geplaatst op een trillingsabsorberende luchttafel binnen een kooi van Faraday. Voor elektronische afscherming wordt de kooi bedekt met een ondoorzichtig gordijn om het preparaat in het donker te houden.We schermen daarnaast het licht van computermonitoren af met rode transparante folies. Stel de infraroodlaser in op 850 tot 870 nanometer of langere golflengten. Schakel over naar de mode-locked conditie en gebruik tweefoton-excitatie om GFP-expresserende cellen te visualiseren.Vul voor patchclamp-metingen borosilicaatglazen micropipetten met de intracellulaire oplossing die een fluorescerende probe bevat, zoals beschreven in het bijbehorende manuscript. Plaats vervolgens de micropipet in de houder. Zorg ervoor dat de referentie-elektrode in contact staat met de extracellulaire oplossing in de meetkamer.Oefen vervolgens druk uit op de GFP-expresserende doelcel met de micropipet met behulp van een 40x waterimmersie-objectief. Omicron-cellichamen bevinden zich zowel in de ganglioncellaag als in het proximale deel van de interplexiforme laag. Voordat de micropipet contact maakt met de doelcel, moet het binnenste begrensingsmembraan aan het retinaloppervlak worden gepenetreerd. Succesvolle penetratie wordt herkend aan de intracellulaire oplossing die uit de tip van de micropipet wordt gedreven en het loslaten van het binnenste begrensingsmembraan van het onderliggende retinaleweefsel. De fluorescerende kleurstof in de intracellulaire oplossing kan de positie van de micropipet onthullen in het tweefotonbeeld tijdens het naderen van de gewenste cel.Laat vervolgens de druk van de micropipet ontsnappen om een whole-cell patch-clamp configuratie te verkrijgen. In de current-clamp modus moet een bruikbare registratie een membraanpotentiaal van -50 tot -55 millivolt geven en ten minste 20 minuten aanhouden. Presenteer daarna de visuele stimuli die op een computermonitor zijn gecreëerd.Stel de stimulusintensiteit in door neutraaldichtheidsfilters in het straalpad te plaatsen en pas de ruimtelijke positie van de stimulatie aan naar het centrum van de geregistreerde cel. Start vervolgens het stimulatieprotocol en registreer de lichtresponsen. Gebruik de stimulusgenerator om de registratiesoftware te triggeren.Plaats een fotodiode in het straalpad om de timing van de stimulus te registreren. Wees voorzichtig en trek het cellichaam niet mee wanneer de micropipet wordt teruggetrokken. Zodra het vullen met kleurstof is voltooid, laat u het fluorescentiemiddel gedurende 30 tot 45 minuten diffunderen in de geregistreerde cel.Hier is een voorbeeld van GFP-expresserende cellen in een retinaal flat mount onder hun promoter. Voor tyrosinehydroxylase kunnen twee populaties worden onderscheiden op basis van de helderheid van het GFP-signaal. Type één dopaminerge cellen, gelegen in de interclear laag, vertonen zwakke fluorescentie, zoals aangegeven door de pijlpuntjes in figuur A. Type twee cellen waren intens gelabeld en hebben cellichamen ofwel in de laag, zoals aangegeven door de pijlen in figuur A, of verplaatst naar de ganglioncellaag, zoals getoond in figuur B. Figuur C toont een dendritische stratificatie van type twee cellen in stratum drie van de binnenste plexiforme laag. Hier is een voorbeeld van de morfologie van een type twee cel die is geïnjecteerd met de tracer neurobiotine.De tracer werd later gevisualiseerd door binding aan fluorescentielabelled streptavidine, hier weergegeven in magenta. Hier zijn verschillende responspatronen van een type 2-cel in de ganglioncellaag op wit licht. Voor een betere onderscheiding van de responscomponenten bij de stimulus, het begin en het einde van de stimulus, werd na deze procedure een verlengde stimulus van drie seconden gebruikt.Andere methoden, zoals farmacologische experimenten, calcium-imaging of immunochemie, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de functionele rol van een bepaald celtype in het netvliessysteem.

electrophysiological-characterization-gfp-expressing-cell-populations

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit artikel geeft een beschrijving van hoe te ontleden en op te nemen van de geïsoleerde netvlies voorbereiding in de muis. In het bijzonder beschrijven we hoe de reacties aan het licht opnemen van een fluorescent gelabelde ganglion cel populatie en vervolgens te identificeren en analyseren van de morfologie.

Een geïsoleerde Retinale Voorbereiding op Light Response Opnemen van genetisch Labeled retinale ganglioncellen

Transfectie van Mouse retinale ganglioncellen door In vivo Elektroporatie

Het algemene doel van deze video is te laten zien hoe je doelgericht retinale injectie uit te voeren...

In Ovo Elektroporatie in Embryonale Chick Retina

The video demonstrates a method to study the excitability of neuronal cells expressing fluorescent protein using a whole-cell patch current clamp. In the current-clamp mode, action potentials indicative of neuronal excitability are generated.

Studying the Excitability of Fluorescent Neurons using a Whole-Cell Patch Clamp

Source: Laboissonniere, et. al. Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (2017). This video demonstrates a fluorescent tracing technique to identify retinal ganglion cell (RGC) subtypes in a transgenic mouse retina. The process involves securing the isolated retina in a recording chamber, maintaining cell viability with oxygenated perfusion, and targeting fluorescently labeled RGCs using a pipette with a tracer. By analyzing dendritic morphology and...

Identification of Mouse Retinal Ganglion Cell Subtypes Through Fluorescent Tracing

Hier presenteren we een combinatorische aanpak voor het classificeren van neuronale celtypes voorafgaand aan isolatie en voor de daaropvolgende karakterisering van enkelvoudige transcriptomen. Dit protocol optimaliseert de voorbereiding van monsters voor succesvolle RNA Sequencing (RNA-Seq) en beschrijft een methodologie die speciaal is ontwikkeld voor een beter begrip van cellulaire diversiteit.

Single-cell RNA-Seq van gedefinieerde subsetjes van retinale Ganglion-cellen

Zebravis netvlies regeneratie is meestal onderzocht met behulp van vaste netvliezen. Echter, dynamische processen zoals interkinetic nucleaire migratie optreden tijdens de regeneratieve respons en vereisen voor live-cell imaging om de onderliggende mechanismen te onderzoeken. We beschrijven hier de cultuur en beeldvorming voorwaarden te controleren Interkinetic Nuclear Migratie (INM) in real-time met behulp van multiphoton microscopie.

Cultuur van volwassen transgene zebravis Retina Explantaten voor Live-cell imaging van Multiphoton Microscopy

In vivo beeldvorming is een krachtig hulpmiddel voor de studie van biologie in gezondheid en ziekte. Dit protocol beschrijft transpupillaire beeldvorming van het netvlies van de muis met een standaard microscoop met twee fotonen. Het demonstreert ook verschillende in vivoimaging-methoden om fluorescerend meerdere cellulaire cohorten van het netvlies te labelen.

Transpupillaire twee-fotonen in vivo beeldvorming van het netvlies van de muis

Dit protocol beschrijft het gebruik van een genetisch gecodeerd waterstofperoxide (H2O2)-biosensor in gekweekte zebravisneuronen en larven voor het beoordelen van de fysiologische signaleringsrollen van H2O2 tijdens de ontwikkeling van het zenuwstelsel. Het kan worden toegepast op verschillende celtypen en worden aangepast met experimentele behandelingen om reactieve zuurstofsoorten (ROS) in de algemene ontwikkeling te bestuderen.

ROS Live Cell Imaging tijdens neuronale ontwikkeling

Netvliesprothesen hebben het vermogen om visuele waarnemingen te genereren. Om de ontwikkeling van nieuwe prothesen te bevorderen, zijn ex vivo-methoden nodig om apparaten te testen voordat ze worden geïmplanteerd. Dit artikel biedt een uitgebreid protocol voor het bestuderen van calciumactiviteit in de retinale ganglioncellaag bij blootstelling aan elektrische stimulatie.

Calciumbeeldvorming in elektrisch gestimuleerde plat gemonteerde netvliezen

Dit werk presenteert een alternatief flatmount retina-preparaat waarbij de verwijdering van fotoreceptorcellichamen een snellere verspreiding van antilichamen en verbeterde patchpipettoegang tot binnenste retinale neuronen mogelijk maakt voor immunohistochemie, in situ hybridisatie en elektrofysiologische experimenten.

Split Retina als een verbeterde flatmount-voorbereiding voor het bestuderen van neuronen in de binnenste nucleaire laag in het netvlies van gewervelde dieren

Leer elektrofysiologische karakterisatie van fluorescerende celpopulaties in de intacte muisretina met behulp van patch-clamp en tweefotonenmicroscopie. Deze methode maakt gerichte opnames van lichtreacties mogelijk.

Elektrofysiologische karakterisatie van GFP-uitdrukken celpopulaties in de Intact Retina

Meer video's verkennen