Elektrofysiologische karakterisatie van GFP-uitdrukken celpopulaties in de Intact Retina

Het algemene doel van deze procedure is om de lichtresponsen en de morfologie van individuele neuronen in het intacte retina te bestuderen met behulp van een muizenlijn die een fluorescentiemarkering uitsluitend in specifieke celtypen tot expressie brengt. Dit wordt bereikt door eerst het oog te dissekeren om een geïsoleerd retina te verkrijgen. De tweede stap is om het retina onder een laser scanning microscoop te plaatsen en een cel te visualiseren via tweefoton infraroodexcitatie.

Vervolgens wordt een micropipet gebruikt om een whole-cell patchclamp-configuratie te verkrijgen voor registratie en het vullen met kleurstof. Uiteindelijk maakt deze preparatie registraties mogelijk van cellulaire reacties op fotostimulatie en onthult het de morfologie van de geregistreerde cel via confocale microscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals ongeleide patchclamp-registratie van het retina, is dat de registratie visueel kan worden gericht op een fluorescent gelabelde cel zonder het retina te stimuleren met het excitatielicht.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het onderzoek naar het netvlies, zoals wat de bijdrage is van een specifieke celpopulatie aan de verwerking van visuele informatie, zelfs wanneer de celpopulatie een lage dichtheid heeft en geen onderscheidende morfologische kenmerken vertoont die identificatie kunnen vergemakkelijken. Begin dit experiment door de muis ten minste drie uur voor het experiment aan het donker te laten wennen.

Bereid ondertussen de extracellulaire oplossing voor zoals beschreven in het bijbehorende manuscript en belucht deze met carbogeen bij kamertemperatuur. Offer daarna de muis en enucleer de ogen met een gebogen irisschaar. Breng ze over naar een schaal met extracellulaire oplossing.

Plaats het vervolgens met een veerschaartje onder een dissectiemicroscoop. Verwijder het hoornvlies en het ciliairlichaam door de oogbol langs de ora serrata te openen. Neem de lens eruit en scheid voorzichtig het netvlies van het pigmentepitheel.

Knip daarna de oogzenuw door tussen het netvlies en het pigmentepitheel. Verwijder het netvlies uit de oogbeker. Let op dat de binnenkant van het opgerolde netvlies de zijde van de ganglioncellen is.

De buitenkant is de zijde van de fotoreceptoren. Verwijder vervolgens het glasvocht van het binnenoppervlak van het netvlies door dit voorzichtig weg te trekken met behulp van een houten tandenstoker. Maak daarna korte incisies langs de rand van het netvlies om het platdrukken van het weefsel te vergemakkelijken.

Breng vervolgens het retina over naar de registratiekamer met de fotoreceptorkant naar beneden. Spreid het met een fijn penseel uit op de glazen bodem en immobiliseer het met een frame van roestvrij staal met nylon draden. Plaats de registratiekamer in het donker onder een rechtopstaande laser-scanningmicroscoop.

Perfuseer het retinaal preparaat continu met een snelheid van niet minder dan 5 mL per minuut. Met een met zuurstof verzadigde extracellulaire oplossing die is verwarmd tot 35 °C, is de microscoop geplaatst op een trillingsabsorberende luchttafel binnen een kooi van Faraday. Voor elektronische afscherming wordt de kooi bedekt met een ondoorzichtig gordijn om het preparaat in het donker te houden.

We schermen daarnaast het licht van computermonitoren af met rode transparante folies. Stel de infraroodlaser in op 850 tot 870 nanometer of langere golflengten. Schakel over naar de mode-locked conditie en gebruik tweefoton-excitatie om GFP-expresserende cellen te visualiseren.

Vul voor patchclamp-metingen borosilicaatglazen micropipetten met de intracellulaire oplossing die een fluorescerende probe bevat, zoals beschreven in het bijbehorende manuscript. Plaats vervolgens de micropipet in de houder. Zorg ervoor dat de referentie-elektrode in contact staat met de extracellulaire oplossing in de meetkamer.

Oefen vervolgens druk uit op de GFP-expresserende doelcel met de micropipet met behulp van een 40x waterimmersie-objectief. Omicron-cellichamen bevinden zich zowel in de ganglioncellaag als in het proximale deel van de interplexiforme laag. Voordat de micropipet contact maakt met de doelcel, moet het binnenste begrensingsmembraan aan het retinaloppervlak worden gepenetreerd. Succesvolle penetratie wordt herkend aan de intracellulaire oplossing die uit de tip van de micropipet wordt gedreven en het loslaten van het binnenste begrensingsmembraan van het onderliggende retinaleweefsel. De fluorescerende kleurstof in de intracellulaire oplossing kan de positie van de micropipet onthullen in het tweefotonbeeld tijdens het naderen van de gewenste cel.

Laat vervolgens de druk van de micropipet ontsnappen om een whole-cell patch-clamp configuratie te verkrijgen. In de current-clamp modus moet een bruikbare registratie een membraanpotentiaal van -50 tot -55 millivolt geven en ten minste 20 minuten aanhouden. Presenteer daarna de visuele stimuli die op een computermonitor zijn gecreëerd.

Stel de stimulusintensiteit in door neutraaldichtheidsfilters in het straalpad te plaatsen en pas de ruimtelijke positie van de stimulatie aan naar het centrum van de geregistreerde cel. Start vervolgens het stimulatieprotocol en registreer de lichtresponsen. Gebruik de stimulusgenerator om de registratiesoftware te triggeren.

Plaats een fotodiode in het straalpad om de timing van de stimulus te registreren. Wees voorzichtig en trek het cellichaam niet mee wanneer de micropipet wordt teruggetrokken. Zodra het vullen met kleurstof is voltooid, laat u het fluorescentiemiddel gedurende 30 tot 45 minuten diffunderen in de geregistreerde cel.

Hier is een voorbeeld van GFP-expresserende cellen in een retinaal flat mount onder hun promoter. Voor tyrosinehydroxylase kunnen twee populaties worden onderscheiden op basis van de helderheid van het GFP-signaal. Type één dopaminerge cellen, gelegen in de interclear laag, vertonen zwakke fluorescentie, zoals aangegeven door de pijlpuntjes in figuur A. Type twee cellen waren intens gelabeld en hebben cellichamen ofwel in de laag, zoals aangegeven door de pijlen in figuur A, of verplaatst naar de ganglioncellaag, zoals getoond in figuur B. Figuur C toont een dendritische stratificatie van type twee cellen in stratum drie van de binnenste plexiforme laag. Hier is een voorbeeld van de morfologie van een type twee cel die is geïnjecteerd met de tracer neurobiotine.

De tracer werd later gevisualiseerd door binding aan fluorescentielabelled streptavidine, hier weergegeven in magenta. Hier zijn verschillende responspatronen van een type 2-cel in de ganglioncellaag op wit licht. Voor een betere onderscheiding van de responscomponenten bij de stimulus, het begin en het einde van de stimulus, werd na deze procedure een verlengde stimulus van drie seconden gebruikt.

Andere methoden, zoals farmacologische experimenten, calcium-imaging of immunochemie, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de functionele rol van een bepaald celtype in het netvliessysteem.