Directe detectie van de acetaat-vormende activiteit van het enzym acetaat Kinase

Dit experiment beoogt een directe meting van de acetaatvormende activiteit van acetaatkinase. Start de reactie door het enzym toe te voegen aan een reactiemengsel dat acetylfosfaat en DP-substraten bevat. Voeg vervolgens hydroxylaminehydrochloride toe om het resterende acetylfosfaat om te zetten in acetylhydroxylaat.

Voeg ontwikkelingsoplossing toe om het acetylhydroxylaat om te zetten in een gekleurd ferric-hydroxylaatcomplex dat gemeten kan worden. Spectrofotometrisch bepaald op basis van de hoeveelheid acetylfosfaatsubstraat die in de reactie is verbruikt, maken de resultaten de bepaling van enzymkinetische parameters mogelijk. Het voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat deze gebaseerd is op de directe meting van het acetylfosfaatverbruik in plaats van de ontkoppeling van ATP-productie aan de reductie van ADP. Omdat deze assay niet afhankelijk is van ATP-productie, kan deze worden gebruikt voor een nieuwe groep acetaatkinasen die pyrofosfaat produceren in plaats van ATP. Voor een standaardcurve van zes tot acht punten wordt de acetylfosfaat-stockoplossing in 100 millimolar Tris verdund tot een finaal monstervolume van 300 µL; voeg ook een controlemonster zonder acetylfosfaat toe. Laat alle monsters één minuut equilibreren in een warmteblok van 37 °C.

Voeg nu 50 µL van twee molar hydroxylaminehydrochloride toe, meng door drie keer te schudden en incubeer vijf minuten in een warmteblok van 60 °C. Voeg vervolgens 100 µL ontwikkelingsoplossing toe, meng door drie keer te schudden en laat de kleur ten minste één minuut ontwikkelen bij kamertemperatuur. Centrifugeer de monsters met behulp van plastic cuvetten voor de spectrofotometer.

Meet de monsters bij 540 nanometers. Maak vervolgens een standaardcurve van de absorbentie bij 540 nanometers tegenover micromolen acetylfosfaat met geschikte software voor gegevensanalyse en grafieken. Bereken de r-kwadraatwaarde.

Verdeel aliquoten van 300 µL reactiemengsel over microcentrifugebuisjes. Vergeet niet een controle-reactie zonder enzym op te nemen. Laat de buisjes één minuut equilibreren bij 37 °C. Indien er meerdere reacties worden uitgevoerd, voeg dan op specifieke tijdsintervallen het enzym toe aan de buisjes en plaats elk buisje onmiddellijk terug in het warmteblok van 37 °C.

Voeg na vijf minuten 50 µL van twee molar hydroxylaminehydrochloride toe, meng en incubeer vijf minuten bij 60 °C. Voeg vervolgens 100 µL van de ontwikkelingsoplossing toe, meng en laat dit bij kamertemperatuur staan voor de kleurontwikkeling. Centrifugeer de monsters vervolgens één minuut bij 18.000 ×g.

Meet vervolgens de absorbentie bij 540 nanometer. Bepaal de hoeveelheid aanwezige acetylfosfaat door vergelijking met de standaardcurve voor acetylfosfaat. De gegevens kunnen worden uitgezet en gefit aan de McKayla Cementin-vergelijking voor de bepaling van kinetische parameters.

Deze assay bepaalt het verbruik van het acetylfosfaatsubstraat om de acetaatkinase-activiteit in de richting van acetaatvorming te meten. Acetylfosfaat dat na een bepaalde tijd tijdens de enzymatische reactie overblijft, wordt omgezet in acetyloxybataat en vervolgens in een ferric hydroxy-acetaatcomplex, dat een roodachtige kleur heeft die gemeten kan worden bij 540 nanometers. Deze typische standaardcurve, waarin de absorbentie bij 540 nanometers wordt uitgezet tegen micromol acetylfosfaat, heeft een helling van 1,2332 absorbentie-eenheden per micromol acetylfosfaat.

De resulterende r-kwadraatwaarde van 0,99 geeft aan dat de gegevens goed passen bij de lineaire vergelijking zoals hier afgebeeld. Deze assay kan worden gebruikt om de KM voor acetylfosfaat te bepalen voor verschillende enzympreparaten. Bij 5 mM DP met variërende concentraties acetylfosfaat volgt gezuiverd recombinant acetaatkinase uit methanol Sarina thermophilic standaard Michaelis-Menten-kinetiek voor elk substraat, wat resulteert in een schijnbare KM van 0,27 ± 0,01 mM acetylfosfaat.

In tegenstelling tot de standaard gekoppelde assay, kan deze directe assay de activiteit meten van acetaatkinasen die andere substraten dan een TP gebruiken. Bijvoorbeeld, bij de benutting van acetylfosfaat door het pyrofosfaat-producerende Entamoeba histolytica acetaatkinase, werd natriumfosfaat in het reactiemengsel gebruikt in plaats van een DP. De resulterende curve geeft een schijnbare KM-waarde aan van 0,50 plus of minus 0,006 millimolair acetylfosfaat. Na het bekijken van deze video zou u een goed beeld moeten hebben van hoe de acetaatkinase-activiteit direct kan worden gemeten door de hoeveelheid verbruikt acetylfosfaat te bepalen.

Een cruciale factor voor het verkrijgen van reproduceerbare resultaten is consistentie in elke stap, in het bijzonder bij het toevoegen van het enzym en tijdens de mengstap.