Pull-down van calmoduline-bindende eiwitten

Het algemene doel van deze procedure is om eiwitten te testen die op een calciumafhankelijke wijze aan Cal Modlin binden. Dit wordt bereikt door eerst de eiwitten van belang te verzamelen. Vervolgens worden calmodulin sero speeds voorbereid voor eiwitbinding.

Vervolgens worden de eiwitten geïncubeerd met calmodulin-serbolken. Ten slotte worden de eiwitten die op een calciumafhankelijke manier binden, geëlueerd. Uiteindelijk kunnen er resultaten worden verkregen via western blot-analyse die eiwitten tonen die binden aan calmodulin, zowel in aanwezigheid als in afwezigheid van calcium.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere bestaande methoden, zoals affiniteitschromatografie en immunoprecipitatie, is dat er minder proteïne en minder tijd nodig is. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van cow modlin-signalering, zoals welke proteïnen op een calciumafhankelijke manier binden aan cow modlin en hoe posttranslationele modificaties hun binding aan cow modlin kunnen beïnvloeden. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de stappen voor het hanteren van de beads essentieel zijn en de beschrijving van het resuspenderen en reteneren van de beads moeilijk te volgen is zonder dit te zien.

Om weefsel voor te bereiden voor homogene injectie van organotypische hippocampale plakjes met een virus dat een plasmide bevat dat het recombinante eiwit van belang tot expressie brengt. In dit voorbeeld is het recombinante eiwit GFP-getagde Neurogranine. Laat het weefsel het eiwit overnight tot expressie brengen; ongeveer 12 tot 18 uur na de virale injectie voegt u één milliliter dissectiebuffer toe aan een petrischaal.

Breng het gekweekte weefsel met de insert over naar de Petrischaal en voeg twee milliliters dissectiebuffer toe aan de insert om het weefsel met een scalpel onder te dompelen. Verzamel vijf tot 10 organotypische hippocampusweefselsneden door het weefsel voorzichtig met een inverted Pasteur-pipet van het insertmembraan los te schrapen. Breng het gesuspendeerde weefsel over naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuis.

Centrifugeer vervolgens de monsters gedurende één minuut bij 1500 RCF. Verwijder voorzichtig het supernatant door aspiratie om het weefsel van de dissectiebuffer te scheiden. Zorg ervoor dat het pellet niet wordt verstoord.

Voeg voor elke gebruikte plak weefsel het weefsel toe aan 30 tot 60 µL homogenisatiebuffer met een pipet van 1 ml met een afgeknipt tipje, en homogeniseer het vervolgens grondig met een stamper voordat het homogenaat wordt teruggeplaatst in de oorspronkelijke buis. Centrifugeer het resterende homogenaat om celresten te verwijderen bij 1100 RCF gedurende 10 minuten en verzamel voorzichtig het supernatant door aspiratie, waarbij contaminatie door het pellet wordt vermeden. Neem een aliquot van 10% van het supernatant op als monster van de input.

Bewaar het resterende supernatant op ijs tijdens de voorbereiding van de cal sero beads voor gebruik. Pipetteer later, voor elke pull down, 400 µL gesuspendeerde cal Modlin Sero beads in een microcentrifugebuis van 2 mL met een relatief vlakke bodem om het oppervlak en de interactie van de oplossingen met de beads tijdens de incubaties te maximaliseren, roteer de microcentrifugebuis op zijn zij om de beads te bevochtigen en centrifugeer de beads vervolgens bij 21.000 ×g gedurende 30 seconden.

Verwijder vervolgens voorzichtig het supernatant via aspiratie. Zorg ervoor dat de beads niet worden verstoord en was de beads met 100 µL van de betreffende homogenisatiebuffer, die ofwel twee millimol calciumchloride bevat voor beads die worden gebruikt om calcium-calmoduline-bindende eiwitten neer te slaan, ofwel twee millimol EDTA, een bekende calciumchelator, voor beads die worden gebruikt om apo-calmoduline-bindende eiwitten neer te slaan.

Tik voorzichtig tegen de buis om de kralen te resuspenderen en centrifugeer gedurende één minuut bij 1500 RCF. Verwijder het supernatant zorgvuldig door aspiratie, waarbij u erop let dat de kralen niet worden verstoord, om eiwitten te binden aan calmodulin-spheros voor pull-down.

Begin met het verdelen van het SNAT in twee gelijke volumes. Voeg, afhankelijk van de conditie per aliquot, de juiste hoeveelheid calciumchloride of EDTA toe aan het supernatant tot een eindconcentratie van twee millimolar. Voeg het supernatant toe aan de gewassen beads in de bijbehorende homogenisatiebuffer.

Tik voorzichtig tegen de buis om te mengen. Incubeer de monsters gedurende drie uur bij vier graden Celsius op een schudapparaat. We resuspenderen de beads ongeveer elke 30 minuten om de bindingsefficiëntie te verhogen.

Centrifuge de monsters vervolgens 3 minuten bij 1500 RC F. Neem 50 µL supernatant af als monster van ongebonden eiwit en verwijder voorzichtig de resterende supernatant door aspiratie en gooi dit weg. Was de beads drie keer zoals voorheen met 100 µL van de juiste homogenisatiebuffer.

De moeilijkste stap in deze procedure is het op een efficiënte manier elueren van de doeleiwitten. De beste manier om succes te garanderen, is door het juiste type buisje te gebruiken om beadverlies te minimaliseren en door de beads op de juiste wijze te resuspenderen in voorverwarmde elutiebuffer. Het vooraf verwarmen van de elutiebuffer kan ook aanzienlijk helpen. Voeg 50 µL elutiebuffer toe aan de beads om het eiwit te elueren.

Monsters die waren gehomogeniseerd en gebonden in buffer met calcium worden opgelost in buffer met EDTA, en monsters die in buffer met EDTA waren, worden opgelost met calcium. Incubeer de beads gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een schudapparaat. Meng de beads door de buis ongeveer elke vijf minuten voorzichtig op te tikken.

Centrifugeer de kraaltjes bij 1500 RCF gedurende drie minuten en verwijder voorzichtig de 50 µL SNAT voor het gebonden eiwitmonster via aspiratie. Zorg ervoor dat de kraaltjes niet worden verstoord. Voer SDS-PAGE en western blotting uit om het eiwit van interesse te identificeren als positieve controle in de tegenovergestelde conditie.

Prop Pro-eiwit dat bekend staat om het binden van Cal Modlin. Deze figuur toont een voorbeeld van een Cal Modlin pull-down assay waarin de binding van Cal MODLIN aan GFP TAG Neuro Grandin wordt getest in vergelijking met endogeen neuro Grandin. De homogene input laat zien dat GFP neuro Grandin werd tot expressie gebracht naast endogeen neuro grandin en calcium-calmoduline-afhankelijk kinase twee, zoals verwacht op basis van de bekende binding van endogeen neuro Grandin.

GFP-getagde Neurogranine werd geëlueerd in afwezigheid van calcium en bond niet in aanwezigheid van calcium. In tegenstelling hiermee werd de controle, calcium-calmoduline-afhankelijke kinase twee, alleen geëlueerd in aanwezigheid van calcium en bleef het ongebonden bij afwezigheid daarvan. Dit toont aan dat de calmoduline-beads correct functioneerden en dat de EEU efficiënt waren.

Het belangrijkste is dat dit aantoont dat GFP neuro grine bindt aan Apoch Cal Modlin op een vergelijkbare wijze als de endogene vorm, wat suggereert dat de GFP-tag de functie van het recombinante eiwit niet heeft veranderd. Zodra deze techniek onder de knie is, kan de procedure, exclusief SDS-PAGE en Western blot-analyse, in zes uur worden voltooid mits correct uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om alle monsters en buisjes voor de betreffende conditie te labelen, aangezien elke verandering in de calciumconcentratie het gehele experiment in gevaar kan brengen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u efficiënt kunt bepalen of specifieke eiwitten in staat zijn om op een calciumafhankelijke wijze aan een CAL-module te binden.

Door de eiwitten van belang te verzamelen, deze te incuberen met de op de juiste wijze geprepareerde co-modulant SRO-beads, de gebonden eiwitten te elueren en deze te testen met behulp van Western blot-analyse.