Pull-down van calmoduline-bindende eiwitten

Het algemene doel van deze procedure is om eiwitten te testen die op calciumafhankelijke wijze aan Cal Modlin binden. Dit wordt bereikt door eerst de eiwitten van belang te verzamelen. Vervolgens worden calmodulin serosnelheden bereid voor eiwitbinding.

Vervolgens worden de eiwitten geïncubeerd met calmodulin serosnelheden. Uiteindelijk worden de eiwitten die op calciumafhankelijke wijze binden, aangehaald. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die eiwitten laten zien die zich binden aan calmodulin in aanwezigheid of afwezigheid van calcium door middel van westerse bloedanalyse.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere bestaande methoden, zoals kalmchromatografie en immunoprecipitatie, is dat het minder eiwit en minder tijd vereist. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van cow modlin-signalering, zoals welke eiwitten zich op calciumafhankelijke wijze aan cow modlin binden, en hoe post-translationele modificaties hun binding aan cow modlin kunnen beïnvloeden. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang, omdat de stappen voor het handhaven van kralen essentieel zijn en de beschrijving van het heropstarten en het vasthouden van de kralen moeilijk te volgen is zonder het te zien.

Om weefsel voor homogeen inject organotypische hippocampale plakjes met een virus dat een plasmide bevat dat het recombinante eiwit van belang tot expressie brengt. In dit voorbeeld is het recombinante eiwit GFP-getagd Neuro Grandin. Laat het weefsel de eiwitovernacht ongeveer 12 tot 18 uur na virale injectie, voeg een milliliter dissectiebuffer toe aan een petrischaal.

Breng het gekweekte weefsel met inbreng over naar de petrischaal en voeg twee milliliter dissectiebuffer toe aan de inbreng om het weefsel onder te dompelen met behulp van een scalpel. Verzamel vijf tot tien organotypische hippocampale weefselsneden door het weefsel voorzichtig van de inbrengmembraan te schrapen met een omgekeerde weidepijp. Breng het gesuspendeerde weefsel over naar een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter.

Centrifugeer vervolgens de monsters gedurende één minuut bij 1500 RCF. Om het weefsel van de dissectiebuffer te scheiden, verwijdert u voorzichtig het supernatant door aspiratie. Zorg ervoor dat u het pellet niet verstoort.

Voeg voor elke gebruikte snede het weefsel toe aan 30 tot 60 microliters homogenisatiebuffer met een pipet van een milliliter met een afgesneden punt en homogeniseer het vervolgens grondig met behulp van een stamper voordat u het homogenaat in zijn oorspronkelijke buisje terugbrengt. Om cellulaire deeltjes te verwijderen, centrifugeert u het resterende homogenaat gedurende 10 minuten bij 1100 RCF en verzamelt u voorzichtig de snat door aspiratie, waarbij u besmetting door het pellet vermeedt. Deel 10% van het supernatant af als een monster van de invoer.

Bewaar het resterende supernatant op ijs tijdens de bereiding van de cal sero-kralen voor gebruik. Later, voor elke pull down pipet 400 microliters van de gesuspendeerde cal Modlin Sero-snelheden in een microcentrifugebuisje van twee milliliter met een relatief vlakke bodem om het oppervlak en de interactie van oplossingen met de kralen tijdens de incubaties te maximaliseren, draai het microcentrifugebuisje op zijn zij om de kralen nat te maken en centrifugeer vervolgens de kralen bij 21.000 RCF gedurende 30 seconden.

En verwijder voorzichtig het supernatant door aspiratie. Zorg ervoor dat u de kralen niet verstoort om de kralen te wassen bij 100 microliters van de respectieve homogenisatiebuffer die ofwel twee millimolar calciumchloride bevat voor kralen die worden gebruikt om calcium cal modlin-bindende eiwitten te trekken. Of twee millimolar E-D-T-A, een bekend calciumchelator voor kralen die worden gebruikt om apo cal modlin-bindende eiwitten te trekken.

Tik voorzichtig op het buisje om te resus. Plaats de kralen op en centrifugeer gedurende één minuut bij 1500 RCF. Verwijder voorzichtig het supernatant door aspiratie, zorg ervoor dat u de kralen niet verstoort om eiwitten aan calmodulin spheros voor pull down te binden.

Begin met het splitsen van de SNAT in twee gelijke volumes. Voeg, afhankelijk van de voorwaarde per aliquot, de juiste hoeveelheid calciumchloride of EDTA toe aan de supernat tot een eindconcentratie van twee millimolar. Voeg het supernatant toe aan de gewassen kralen in de juiste homogenisatiebuffer.

Tik voorzichtig op het buisje om te mengen. Incubeer de monsters gedurende drie uur op een shaker bij vier graden Celsius. We plaatsen de kralen om de 30 minuten om de efficiëntie van de binding te verhogen.

Centrifugeer vervolgens de monsters gedurende drie minuten bij 1500 RC F. Verwijder 50 microliters supernatant als een monster van ongebonden eiwit en verwijder voorzichtig de resterende snat door aspiratie en gooi het weg. Was de kralen drie keer zoals eerder met 100 microliters van de juiste homogenisatiebuffer.

De moeilijkste stap in deze procedure is het elucian van doeleiwitten op een efficiënte manier. De beste manier om succes te garanderen is om het juiste soort buis te gebruiken om verlies van kralen te minimaliseren en de kralen op de juiste manier te resuspenderen in elutiebuffer. De elutiebuffer van tevoren kan ook aanzienlijk helpen. Eluteer het eiwit bij 50 microliters eluciabuffer naar de kralen.

Steekjes die werden gehomogeniseerd en gebonden in buffer met calcium, werden geïmpliceerd in buffer met EDTA en steekjes die buffer met EDTA hadden, werden geïmpliceerd met calcium. Incubeer de kralen gedurende 30 minuten op een shaker op kamertemperatuur. Meng de kralen door het buisje ongeveer om de vijf minuten voorzichtig te tikken.

Centrifugeer de kralen gedurende drie minuten bij 1500 RCF en verwijder voorzichtig de 50 microliters SNAT voor het gebonden eiwitmonster door aspiratie. Zorg ervoor dat u de kralen niet verstoort. Voer SDS-pagina en westerse blotting uit om het eiwit van belang te identificeren als een positieve controle in de tegenovergestelde toestand.

Prop Pro-eiwit dat bekend staat om Cal Modlin te binden. Deze figuur toont een voorbeeld van een Cal Modlin pull down-test