Name: Pull-down van calmoduline-bindende eiwitten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Leer de calmoduline pull-down assay om calciumafhankelijke eiwitinteracties te onderzoeken met behulp van CaM-sepharose kralen. Deze methode identificeert specifieke CaM-bindende eiwitten en geeft inzicht in cellulaire signaaltransductie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen graag Tiffany Cherry bedanken in haar te helpen bij het optimaliseren van dit protocol. Dit werk werd gefinancierd door National Institute of Aging (AG032320), evenals het bevorderen van een gezondere Wisconsin.

Zie figuur 1 voor een basis-schema van de procedure te beginnen met de homogenaat. Geschatte tijd vanaf de voorbereiding van de cellulaire extracten om elutie van CAM-gebonden eiwitten is ongeveer zes tot zeven uur. 1. Tissue voorbereiding <ol><li> Injecteer organotypische hippocampale plakken met een virus met een plasmide dat het recombinante eiwit van belang (in dit voorbeeld, groen fluorescerend eiwit (GFP)-gelabeld Ng) en laat een nacht weefsel te drukken eiwit. </li><li> Ongeveer 12 tot 18 uur na virale injectie (afhankelijk van het virale uitdrukking tijd), voor te bereiden op de weefsels te verzamelen. Voeg 1 ml dissectie buffer (10 mM glucose, 4mm KCl, 26mm NaHCO3, 233mm sucrose, 5mM MgCl2, 1 mM CaCl2, en 0,1% fenol-rood, vergast met 5% CO 2 van 95% O 2) tot een petrischaal. Transfer gekweekte weefsel / insert aan petrischaal en voeg 2 ml buffer dissectie van de voegen onder water het weefsel. </li><li> Collect organotypische hippocampus weefsel (tussen 5 en 10 plakjes) door voorzichtig schrapen het weefsel vrij zijn van de insert membraan met behulp van een scalpel. In het bijzonder het verwijderen van een bepaalde regio van belang (bijvoorbeeld CA1) is ook een optie. Overdracht van het gesuspendeerde vaatweefsel op een 1,5 ml microcentrifugebuis met behulp van een omgekeerde Pasteur pipet. </li><li> Centrifugeer monsters op 1500 RCF gedurende 1 minuut aan het weefsel te scheiden van de dissectie buffer. Verwijder voorzichtig het supernatant door aspiratie. Zorg ervoor dat niet aan de pellet te verstoren. </li><li> Voor elk segment gebruikt, voeg 30 tot 60 ul van homogenisering buffer (150mm NaCl, 20mm Tris pH 7,5, 1 mM DTT, 1μg/mL leupeptin, 1μg/mL chemostatin, 1μg/mL antipain, 1μg/mL pepstatine, en 1% Triton X -100) naar het weefsel en grondig gehomogeniseerd met stamper. </li><li> Met het oog op cellulair vuil te verwijderen, centrifuge de resterende homogenaat in 1100 RCF gedurende 10 minuten en voorzichtig het supernatant te verwijderen door aspiratie terwijl het vermijden van verontreiniging van de pellet. </li><li> Nemen 10% van de supernatant als een voorbeeld van de input (sample 1). Bewaar de overblijvende supernatant op het ijs tijdens de bereiding van de CAM-sepharose kralen voor gebruik in stap 3. </li></ol> Opmerking: Het weefsel hier gebruikt zijn organotypische hippocampus plakjes. Kan echter een gebruik losgekoppeld neuronen of een andere cel kweken systeem. In een dergelijk geval, te beginnen bij stap 1.4 na het verzamelen van uw weefsel op de juiste manier. 2. Voorbereiding van de kralen voor pull-down Bij de afhandeling van de korrels, is het belangrijk om de kralen te redden en de efficiëntie van de reacties te maximaliseren door te voorkomen dat de kralen van het drogen aan de zijkanten van de buis. Om dit te doen, is het het beste om je tubes draaien aan hun kant, waardoor oplossing voor de kralen nat op de wanden van de buis, vlak voor centrifugeren. <ol><li> Voor elke pull-down, pipet 400 pi van zwevende Calmoduline-Sepharose kralen in een 2 ml microcentrifugebuis met een relatief flaT-bottom aan de oppervlakte en de interactie van uw oplossingen te maximaliseren met de kralen tijdens uw incubaties. </li><li> Centrifugeer kralen aan 21.000 RCF gedurende 30 seconden en voorzichtig het supernatant te verwijderen door aspiratie. Zorg ervoor dat u de kralen te verstoren. </li><li> Te wassen de kralen, voeg 100 ul van de respectievelijke homogenisering buffer bestaande uit 2 mM CaCl 2 die wordt gebruikt om pull-down Ca 2 +-CaM bindende eiwitten en 2 mM EDTA (een bekende Ca 2 + chelator) voor kralen naar beneden te trekken ApoCaM bindende eiwitten. Tik voorzichtig de buis om opnieuw te schorsen kralen en centrifugeer op 1500 RCF gedurende 1 minuut. Verwijder voorzichtig het supernatant door aspiratie, ervoor te zorgen dat niet op de kralen te verstoren. </li></ol> Opmerking: Voor alle aspiratie stappen, is het aanbevolen om een ​​pipet tip dat een fijne opening (bijv. een gel laden tips) om de verwijdering van de oplossing mogelijk te maken zonder het verwijderen van kralen moet gebruiken. 3. Cam-Sepharose binding van eiwitten <ol><li> Splits uw supernatant in twee condities met een gelijk volume. Afhankelijk van uw conditie, voeg de juiste hoeveelheid CaCl 2 of EDTA om uw supernatant tot 2 mM concentratie voor elk. </li><li> Voeg supernatans van stap 1.7 tot kralen gewassen in de overeenkomstige homogenisering buffer. Tik voorzichtig de buis om te mengen. </li><li> Incubeer monsters bij 4 ° C gedurende 3 uur op een shaker. Re-schorten kralen elke 30 minuten of zo om de efficiëntie van binding te verhogen. </li><li> Centrifugebuis met de monsters en kralen op 1500 RCF gedurende 3 minuten. </li><li> Neem 50μL van supernatant als een steekproef van niet-gebonden eiwit (voorbeeld 2) en voorzichtig de resterende supernatant te verwijderen door aspiratie en gooi ze weg. </li><li> Was kralen drie keer, zoals beschreven in stap 2.3 met behulp van 100μL van de respectieve homogenisering buffer. </li></ol> 4. Elutie <ol><li> Voeg 50μL van elutie buffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, en 150 mm NaCl) met het tegenovergestelde toestand (10mm Cacl 2 of 10mm EDTA) om de kralen. Bijvoorbeeld, monsters die werden gehomogeniseerd en gebonden in een buffer met Ca 2 + worden geëlueerd in elutiebuffer met EDTA en vice-versa. </li></ol> Optioneel: Warming de elutiebuffer tot 37 ° C voor het toevoegen aan korrels kunnen het rendement te verbeteren. <ol start="2"><li> Broed-oplossing met kralen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten op een shaker. Meng de kralen door zachtjes tikken op de buis ongeveer om de 5 minuten. </li><li> Centrifugeer kralen bij 1.500 RCF gedurende 3 minuten en zorgvuldig de 50μL van de supernatant te verwijderen voor het gebonden eiwit (voorbeeld 3) door aspiratie. Zorg ervoor dat u de kralen te verstoren. </li><li> Voeg eiwit laadbuffer om alle monsters (dwz homogenaat, ongebonden en gebonden eiwit evenals die nog steeds gebonden aan de beads). </li></ol> Opmerking: Om elutie (vooral in het geval van inefficiënte elutie) te maximaliseren, voeg 50μL van de overeenkomstige elutiebuffer (bv. toevoeging van EDTA met buffer aan kralen gebonden zijn in de CaCl 2) om de kralen vóór het verwarmen monsters te helpen elueren resterende gebonden eiwit en herhaal de stappen beschreven in 4.3 van de resterende gebonden eiwitten te verwijderen. 5. SDS-PAGE en western blot Gedrag SDS-PAGE en analyseren met behulp van western blot door te zoeken naar uw proteïne van interesse en probe voor een eiwit waarvan bekend is CaM binden in de tegenovergestelde toestand als een positieve controle. 6. Representatieve resultaten Figuur 2B toont een voorbeeld van een CAM-pull-down test het testen van de CaM binding van GFP-gelabelde Ng ten opzichte van endogene Ng. Om dit te doen, was GFP-Ng tot overexpressie gebracht in onze organotypische hippocampale slices 's nachts en het weefsel werd gehomogeniseerd. Het homogenaat werd geïncubeerd met CaM-sepharose kralen in de aanwezigheid van een Ca 2 + of EDTA. Homogenaat ingang toont aan dat de GFP-Ng werd uitgedrukt in naast endogeen Ng en Ca 2 + / CAM-afhankelijke kinase II(CaMKII). Zoals verwacht op basis van de bekende binding van endogene Ng (geïllustreerd in Fig. 2A), GFP-gelabelde Ng werd geëlueerd in de afwezigheid van Ca 2 + (EDTA gebonden eiwit) en ongebonden in de aanwezigheid van Ca 2 + (Fig. 2B) . Daarentegen was de controle, CaMKII, geëlueerd alleen in de aanwezigheid van Ca 2 + (gebonden eiwit) en was ongebonden in zijn afwezigheid (EDTA). Hieruit blijkt dat de CAM kralen goed zijn functioneren en de eluties waren efficiënt. Het belangrijkste is, toont dit aan dat GFP-Ng bindt aan ApoCaM in een vergelijkbare wijze als de endogene vorm, wat suggereert dat het GFP-tag niet de functie van onze recombinant eiwit te veranderen. <img src="/files/ftp_upload/3502/3502fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Schets van de Cam pull-down test (A) Tissue homogenaat wordt afgedraaid om cellulaire vuil te verwijderen. Ongeveer 10% van de supernatant wordt beschouwd als een monster van de input (1). De overige supernatant is gelijk verdeeld voor de verschillendevoorwaarden en de juiste reagentia (CaCl 2 of EDTA) worden toegevoegd aan bindend te testen in deze voorwaarden. Elke supernatant (met of CaCl 2 of EDTA) is geladen op de respectievelijk voorbereide CaM-sepharose kralen en (B) geïncubeerd om bindend. Niet-gebonden eiwitten worden verwijderd (2) en (C) de gebonden eiwitten (3) worden geëlueerd off van de kralen met behulp van elutiebuffer (EB) met de tegenovergestelde voorwaarde als bindend. De eiwitsamenstelling van deze drie eiwit monsters kunnen worden geanalyseerd met behulp van SDS-PAGE en western blot-analyse. <img src="/files/ftp_upload/3502/3502fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. A.) Schematische voorstelling van Ca 2 +-afhankelijke CaM binding en elutie in pull-down test worden voorbeelden gegeven van twee soorten eiwitten die zich binden CaM in een Ca 2 +-afhankelijke manier. Neurogranin (Ng) vertegenwoordigt eiwitten die zich binden apo-CAM en CaMKII eiwitten die zich binden aan Ca 2 +-rijke vertegenwoordigtCam. CaM is te zien in de gedissocieerde toestand voorafgaand aan incubatie met de homogenaat eiwitten. Zodra geïncubeerd onder omstandigheden van hoge Ca 2 +-concentraties (2 mm) of in de aanwezigheid van een Ca 2 + chelator, EDTA (2 mM), de eiwitten zal dienovereenkomstig binden aan CAM. Ng bindt CaM in de EDTA staat omdat er weinig tot geen Ca 2 + aanwezig is, en zou worden geëlueerd uit de CAM-Sepharose kralen in de aanwezigheid van Ca 2 +. CaMKII zou echter binden aan CaM in de aanwezigheid van grote hoeveelheden Ca 2 + en zou distantiëren zodra de Ca 2 + was chelaatvorm. B.) De resultaten van bijvoorbeeld CaM pull-down test. Deze figuur toont het verwachte eindresultaat van een CAM-sepharose naar beneden trekken met de monsters gepeild Voor aardgas-en CaMKII. Zowel de endogene Ng en GFP-Ng aanwezig zijn in de lanen van eiwitten gebonden aan CaM in de aanwezigheid van EDTA. Geen Ng is gebonden wanneer monsters worden geïncubeerd met CaM in de aanwezigheid van Ca 2 +, waaruit blijkt dat Ng bindt alleen apo-Cam. Onze positieve controle, CaMKII, aan de andere kant, bindt zich aan CaM alleen in de aanwezigheid van Ca 2 +.

<ol><li>Vincenzi, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin+in+the+regulation+of+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+West+Pharmacol+Soc%22%5BJournal%5D)">Calmodulin in the regulation of intracellular calcium.</a> Proc. West Pharmacol Soc. 22, 289-294 (1979).</li>
<li>Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin+plays+a+pivotal+role+in+cellular+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation.</a> Science. 207, 19-27 (1980).</li>
<li>Zhang, M., Tanaka, T., Ikura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-induced+conformational+transition+revealed+by+the+solution+structure+of+apo+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium-induced conformational transition revealed by the solution structure of apo calmodulin.</a> Nat. Struct. Biol. 2, 758-767 (1995).</li>
<li>Alexander, K. A., Wakim, B. T., Doyle, G. S., Walsh, K. A., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+the+calmodulin-binding+domain+of+neuromodulin%2C+a+neurospecific+calmodulin-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of the calmodulin-binding domain of neuromodulin, a neurospecific calmodulin-binding protein.</a> J. Biol. Chem. 263, 7544-7549 (1988).</li>
<li>Huang, K. P., Huang, F. L., Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+7.5-kDa+protein+kinase+C+substrate+%28RC3+protein%2C+neurogranin%29+from+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Characterization of a 7.5-kDa protein kinase C substrate (RC3 protein, neurogranin) from rat brain.</a> Arch. Biochem. Biophys. 305, 570-580 (1993).</li>
<li>Bahler, M., Rhoads, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin+signaling+via+the+IQ+motif%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Calmodulin signaling via the IQ motif.</a> FEBS Lett. 513, 107-113 (2002).</li>
<li>Routtenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+activation+leading+to+protein+F1+phosphorylation+may+regulate+synaptic+plasticity+by+presynaptic+terminal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Neural.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C activation leading to protein F1 phosphorylation may regulate synaptic plasticity by presynaptic terminal growth.</a> Behav. Neural. Biol. 44, 186-200 (1985).</li>
<li>Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogranin+enhances+synaptic+strength+through+its+interaction+with+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin.</a> EMBO J. 28, 3027-3039 (2009).</li>
<li>Needham, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+and+adenosinetriphosphate+in+relation+to+muscle+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Myosin and adenosinetriphosphate in relation to muscle contraction.</a> Biochim. Biophys. Acta. 4, 42-49 (1950).</li>
<li>Hathaway, D. R., Adelstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+platelet+myosin+light+chain+kinase+requires+the+calcium-binding+protein+calmodulin+for+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Human platelet myosin light chain kinase requires the calcium-binding protein calmodulin for activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 1653-1657 (1979).</li>
<li>Fukunaga, K., Yamamoto, H., Matsui, K., Higashi, K., Miyamoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+a+Ca2%2B-+and+calmodulin-dependent+protein+kinase+from+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of a Ca2+- and calmodulin-dependent protein kinase from rat brain.</a> J. Neurochem. 39, 1607-1617 (1982).</li>
<li>Yang, S. D., Tallant, E. A., Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcineurin+is+a+calmodulin-dependent+protein+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Calcineurin is a calmodulin-dependent protein phosphatase.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 106, 1419-1425 (1982).</li>
<li>Huestis, W. H., Nelson, M. J., Ferrell, J. E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin-dependent+spectrin+kinase+activity+in+human+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Clin.+Biol.+Res%22%5BJournal%5D)">Calmodulin-dependent spectrin kinase activity in human erythrocytes.</a> Prog. Clin. Biol. Res. 56, 137-155 (1981).</li>
<li>Yamniuk, A. P., Vogel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin%27s+flexibility+allows+for+promiscuity+in+its+interactions+with+target+proteins+and+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Calmodulin's flexibility allows for promiscuity in its interactions with target proteins and peptides.</a> Mol. Biotechnol. 27, 33-57 (2004).</li>
<li>Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogranin+phosphorylation+fine-tunes+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De verstrekte protocol maakt gebruik van CaM-sepharose kralen te onderzoeken van de Ca 2 +-afhankelijkheid van de CAM-bindende eiwitten. Veel eiwitten binden CaM in een Ca 2 +-afhankelijke manier. Deze interacties zijn van groot belang gezien het aantal van de Cam-bindende eiwitten en hun kritische rol in vele signaleringsroutes. In dit protocol zijn CaM-sepharose kralen gebruikt voor het CAM-bindende eiwitten te scheiden van weefsel homogenaat in de aanwezigheid of afwezigheid van Ca 2 +.</su...

<table border="1"><tr><td> Product </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Opmerkingen </td></tr><tr><td> Calmodulin-Sepharose kralen </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0529-01 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CaMKII Alpha </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6974 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-neurogranin </td><td> Millipore </td><td> 07-425 </td><td></td></tr><tr><td> Gel wordt geladen Pipet Tips </td><td> Visser </td><td> 02-707-138 </td><td> Gebruik voor aspiratie van supernatantia </td></tr><tr><td> Microcentrifugebuizen (2,0 ml) </td><td> Visser </td><td> 05-408-146 </td><td> Te gebruiken voor alle stappen met betrekking tot calmodulin-sepharose kralen </td></tr></table>

pull-down van calmoduline-bindende eiwitten

Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

Calcium (Ca 2 +) is een ion van vitaal belang bij het ​​reguleren van cellulaire functie door een verscheidenheid van mechanismen. Een groot deel van Ca 2 + signalering wordt gemedieerd door de calcium-bindende eiwit bekend als calmodulin (CAM) 1,2. CaM is betrokken op verschillende niveaus in bijna alle cellulaire processen, met inbegrip van apoptose, metabolisme, gladde spiercontractie, synaptische plasticiteit, zenuwgroei, ontsteking en de immuunrespons. Een aantal van de eiwitten helpen reguleren deze routes door hun interactie met Cam. Veel van deze interacties zijn afhankelijk van de conformatie van CAM, dat is duidelijk anders wanneer gebonden aan Ca 2 + (Ca 2 +-CAM) in tegenstelling tot de Ca 2 +-vrije staat (ApoCaM) 3. Terwijl de meeste doelwit eiwitten binden Ca 2 +-CAM, bepaalde eiwitten binden aan ApoCaM. Sommige binden CaM door middel van hun IQ-domein, met inbegrip neuromodulin 4, neurogranin (Ng) 5, en bepaalde myosins <sup&gt; 6. Deze eiwitten is aangetoond dat ze een belangrijke rol in presynaptische functie 7, postsynaptische functie 8, en samentrekken van de spieren 9 te spelen, respectievelijk. Hun vermogen om te binden en laat CaM in de afwezigheid of aanwezigheid van Ca 2 + staat centraal in hun functie. In tegenstelling tot vele eiwitten binden Ca 2 +-CaM en vereisen deze binding voor hun activering. Voorbeelden hiervan zijn myosine lichte keten kinase 10, Ca 2 + / CAM-afhankelijke kinasen (CaMKs) 11 en fosfatasen (bijv. calcineurine) 12, en spectrin kinase 13, die een verscheidenheid van directe en downstream effecten 14 hebben. De effecten van deze eiwitten op cellulaire functie zijn vaak afhankelijk van hun vermogen om te CaM te binden in een Ca 2 +-afhankelijke manier. Bijvoorbeeld, testten we de relevantie van Ng-CaM verbindend in synaptische functie en hoe de verschillende mutaties deze binding beïnvloeden. We genereerden een GFP-gelabelde Ng construct met specifieke mutaties in het IQ-domein dat het vermogen van Ng om CaM te binden in een Ca 2 +-afhankelijke manier zou veranderen. De studie van deze verschillende mutaties gaf ons veel inzicht in belangrijke processen die betrokken zijn bij synaptische functie 8,15. Echter, in deze studies, is het essentieel om aan te tonen dat de gemuteerde eiwitten de verwachte gewijzigde binding aan CaM hebben. Hier presenteren we een methode voor het testen van het vermogen van proteïnen om naar CaM te binden in de aanwezigheid of afwezigheid van Ca 2 +, met behulp van CaMKII en Ng als voorbeelden. Deze methode is een vorm van affiniteitschromatografie aangeduid als een CAM pull-down test. Het maakt gebruik van CAM-Sepharose kralen om te testen eiwitten die zich binden aan CaM en de invloed van Ca 2 + op deze bindend. Het is aanzienlijk meer tijd efficiënter en vereist minder eiwit ten opzichte van kolomchromatografie en andere testen. Alles bij elkaar levert dit een waardevol instrument is om Ca 2 + verkennen / CAM-signalering en eiwitten die interact met CAM.

Calmoduline (CAM) pull-down test is een effectieve manier om de interactie van CaM te onderzoeken met verschillende eiwitten. Deze methode maakt gebruik van CAM-sepharose kralen voor een efficiënte en specifieke analyse van de CAM-bindende eiwitten. Dit levert een belangrijk instrument om CaM signalering verkennen in cellulaire functie.

Pull-down van calmoduline-bindende eiwitten

Calcium (Ca2+) is een ion dat essentieel is voor de regulatie van de cellulaire functie via uiteenlopende mechanismen. Veel van de Ca2+-signalering wordt gemedieerd via de ...

Het algemene doel van deze procedure is om eiwitten te testen die op een calciumafhankelijke wijze aan Cal Modlin binden. Dit wordt bereikt door eerst de eiwitten van belang te verzamelen. Vervolgens worden calmodulin sero speeds voorbereid voor eiwitbinding.Vervolgens worden de eiwitten geïncubeerd met calmodulin-serbolken. Ten slotte worden de eiwitten die op een calciumafhankelijke manier binden, geëlueerd. Uiteindelijk kunnen er resultaten worden verkregen via western blot-analyse die eiwitten tonen die binden aan calmodulin, zowel in aanwezigheid als in afwezigheid van calcium.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere bestaande methoden, zoals affiniteitschromatografie en immunoprecipitatie, is dat er minder proteïne en minder tijd nodig is. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van cow modlin-signalering, zoals welke proteïnen op een calciumafhankelijke manier binden aan cow modlin en hoe posttranslationele modificaties hun binding aan cow modlin kunnen beïnvloeden. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de stappen voor het hanteren van de beads essentieel zijn en de beschrijving van het re

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Het endoplasmatisch reticulum speelt een belangrijke rol in de eiwit-biogenese en in de calcium homeostase. We hebben een experimenteel systeem dat ons in staat stelt om de rol van Ca2 + lekkage te verhelpen en om hun vermeende regulerende mechanismen te karakteriseren. Dit systeem houdt in siRNA gemedieerde gene silencing en live cell imaging Ca2 +.

Live-Cell Calcium Imaging Gecombineerd met siRNA gemedieerde gen-silencing Identificeert Ca 2 + Lek Kanalen in het ER membraan en de regulerende mechanismen

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), een epitheliale chloride kanaal, is gemeld om te communiceren met verschillende eiwitten en belangrijke cellulaire processen te reguleren, onder wie de CFTR PDZ motief-gemedieerde interacties zijn goed gedocumenteerd. Dit protocol beschrijft methodes die we ontwikkeld tot een PDZ-afhankelijke CFTR macromoleculaire signaleren van complexe...

In vitro analyse van PDZ-afhankelijke CFTR Macromoleculaire signaalcomplexen

Wij presenteren protocollen voor de toepassing van onze genetisch gecodeerde calciumindicator (GECI) CatchER + voor het monitoren van snelle calcium transiënten in het endoplasmatische / sarcoplasmatische reticulum (ER / SR) van HEK293 en skeletspier C2C12 cellen met behulp van real-time fluorescentiemicroscopie. Een protocol voor de in-situ K d meting en kalibratie wordt ook besproken.

Monitoring ER / SR Calciumvrijstelling met de gerichte Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensor CatchER<sup&gt; +</sup

De differentiële radiale capillaire werking van Ligand Assay (DRaCALA) kan worden gebruikt om kleine ligandbindende eiwitten van een organisme te identificeren met behulp van een ORFeome-bibliotheek.

Identificatie van de bindende eiwitten van kleine liganden met de differentiële radiale capillaire werking van ligandtest (DRaCALA)

Het huidige protocol beschrijft monstervoorbereiding en gegevensanalyse om eiwitfosforylering te kwantificeren met behulp van een verbeterde single-molecule pull-down (SiMPull) assay.

Een geoptimaliseerde single-molecule pull-down test voor kwantificering van eiwitfosforylering

Hier beschrijven we een methode voor de bacteriële co-expressie van differentieel gelabelde eiwitten met behulp van een reeks compatibele vectoren, gevolgd door de conventionele pulldown-technieken om eiwitcomplexen te bestuderen die niet in vitro kunnen worden samengevoegd.

Pulldown-test in combinatie met co-expressie in bacteriecellen als een tijdefficiënt hulpmiddel voor het testen van uitdagende eiwit-eiwitinteracties

Er is een verbeterd protocol ontwikkeld voor een calciummobilisatietest met endotheelcellen, die wordt gebruikt om liganden van protease-geactiveerde receptoren (PAR's) te identificeren. Het nieuwe protocol verkort de totale testtijd met 90-120 minuten en levert reproduceerbare concentratie-responscurves op.

Karakterisering van modulatoren van protease-geactiveerde receptoren met een calciummobilisatietest met behulp van een plaatlezer

In deze video tonen we een methode voor de elektroforetische scheiding van eiwitten met behulp van poly-acrylimide gelelektroforese (PAGE).

Elektroforetische scheiding van eiwitten

Na de scheiding door elektroforetische methoden, kunnen eiwitten in een gel worden gedetecteerd door verschillende kleuren methoden. Kleuring van eiwitten met Coomassie Blauw, Zilver kleuring, SYPRO Orange, SYPRO Ruby worden gedemonstreerd in deze video.

Kleuring Eiwitten in Gels

Microcontact afdrukken wordt op grote schaal gebruikt voor het patroon eiwitten en andere moleculen op materiaal oppervlakken. Tonen we de basisstappen van dit proces, stempelen patronen van fibronectine op glas.

Microcontact afdrukken van eiwitten voor Celbiologie

Leer de calmoduline pull-down assay om calciumafhankelijke eiwitinteracties te onderzoeken met behulp van CaM-sepharose kralen. Deze methode identificeert specifieke CaM-bindende eiwitten en geeft inzicht in cellulaire signaaltransductie.

Pull-down van calmoduline-bindende eiwitten

Meer video's verkennen