Tracking Hypoxische Signalering binnen Encapsulated Cell Aggregaten

Het algemene doel van deze procedure is om de cellulaire respons op hypoxie in PEG-ingekapselde celaggregaten te monitoren. In de eerste stap worden verspreide cellen geïnfecteerd met het marker-virus en vervolgens gekweekt op een schudapparaat om de vorming van aggregaten mogelijk te maken. Vervolgens wordt lineaire PEG gefunctionaliseerd en wordt de PEG DM-primer gezuiverd.

Vervolgens worden de celaggregaten ingekapseld in een PEG DM-hydrogel. Ten slotte worden de hydrogels gekweekt onder verschillende zuurstofcondities, waarbij het signaal van de hypoxiemarker fluorescent wordt gemonitord. Uiteindelijk kan de locatie en omvang van de activiteit van de hypoxie-induceerbare factor binnen levensvatige ingekapselde celaggregaten worden gevisualiseerd via eenvoudige fluorescentiemicroscopie.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de velden van celencapsulatie en celgebaseerde therapeutische toediening, zoals: waar treedt hypoxie op binnen 3D-culturen, en hoe beïnvloedt dit de overleving en functie van cellen? De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot regeneratieve geneeskundebenaderingen en de therapie voor hormoondeficiënties zoals diabetes, vanwege de grote impact van hypoxie in geaggregeerde en ingekapselde weefsels. Het is aangetoond dat de activiteit van hypoxie-induceerbare factor 1 correleert met een sterk verminderde insulinesecretie uit bètacellen, wat pogingen motiveert om primaire eilandjes te dissociëren en deze te hervormen tot pseudo-eilandjes.

Aggregaten met een gereduceerde diameter. Onze marker kan de activiteit van hypoxia-induceerbare factor aangeven met aggregaten op cellulair niveau binnen elk losgelaten inkapselingsmateriaal. PEG werd gekozen als kapselmateriaal vanwege de gunstige transfereigenschappen, cytocompatibiliteit en het gemak waarmee het functioneel kan worden gemodificeerd.

Weeg twee gram PEG af in een glazen flacon van 40 milliliter met ongeveer 308 µL methacrylzuumhydride en sluit de flacon losjes af met een harde plastic dop. Verwarm de flacon twee minuten op de hoogste stand in een standaard huishoudelijke magnetron. Vortex de flacon vervolgens grondig terwijl u hittebestendige handschoenen draagt en verwarm de oplossing nogmaals vijf minuten op de hoogste stand in de magnetron.

Laat het flacon kort genoeg afkoelen om gehanteerd te kunnen worden en draai vervolgens de dop eraf terwijl u met het flacon walselt. Meng langzaam methyleenchloride erdoor en vortex het monster indien nodig totdat de oplossing helder en homogeen oogt. Voeg de oplossing vervolgens druppelsgewijs toe aan 200 milliliters geroerde koude dathylether om de PEG dm te laten neerslaan.

Verzamel vervolgens de PEG DM door vacuümfiltratie en laat deze drogen. Zodra de PEG DM is gedroogd, wordt deze opgelost in ongeveer 100 tot 150 milliliter gedeïoniseerd water. Dialyseer de oplossing vervolgens gedurende vijf dagen tegen gedeïoniseerd water in dialysebuizen met een molecular weight cutoff van 1000 Daltons na dialyse.

Giet de oplossing in geschikte containers en vries deze gedurende de nacht in bij -80 °C. Lyofiliseer de oplossing vervolgens gedurende vier dagen om een gezuiverd wit PEG DM-poeder te verkrijgen om de cellen van het oppervlak van de behandelde kweekfles te laten loslaten. Aspireer eerst het medium, spoel de cellen met calcium- en magnesiumvrij HBSS bij 37 °C en aspireer het HBSS.

Voeg nu twee milliliter trypsin-EDTA-oplossing van 37 °C toe en laat de cellen drie minuten incuberen bij 37 °C. Schud vervolgens stevig tegen de zijkant van de kolf om de cellen los te maken. Voeg acht milliliter medium van 37 °C toe aan de kolf en pipetteer de celsuspensie krachtig op en neer, waarbij u er zorg voor draagt dat er geen luchtbellen ontstaan.

Nadat de celoplossing is overgebracht naar een steriele centrifugebuis van 15 milliliter, worden de cellen geteld met een hemocytometer om het totaal aantal te infecteren cellen te bepalen. Voeg het benodigde volume celсусpensie toe aan de wells van een six-well suspensiecultuurplaat om 400.000 cellen per well te bereiken. Aliquoteer 50 microliters HBSS per well met te infecteren cellen in een microcentrifugebuis van 1,8 milliliter. Pipetteer vervolgens zorgvuldig de juiste hoeveelheid virusсусpensie in het voorbereide HBSS.

Voeg nu het juiste volume verdund virus toe aan elke put om de gewenste MOI te bereiken, en voeg vervolgens medium toe aan elke put om het totale volume aan te vullen tot 1,7 milliliters. Plaats de plaat vervolgens op een orbitale schudmachine in de incubator, stel de schudmachine in op een lage stand van ongeveer 100 RPM, zodat het medium zachtjes door de put spoelt, en laat de cellen 24 tot 36 uur aggregeren. Begin met het afsnijden van de taps toelopende punt van een plastic spuit van één milliliter en plaats deze met de open zijde naar boven in een rek om een vat te creëren waarin de hydrogel zal worden gevormd.

Pipetteer vervolgens 20 µL van de foto-actieve PEG DM-oplossing in het open uiteinde van de spuit op de zuiger, waarbij u ervoor zorgt dat het volume het gehele oppervlak van de zuiger bedekt. Pas de positie van de zuiger in kleine stappen aan om een vlak vloeistofoppervlak te verkrijgen. Plaats de pipet nu terug in het rek en positioneer het rek gedurende ongeveer acht minuten onder een UV-lamp om de cross-linking van de hydrogel mogelijk te maken.

Pipette gedurende deze tijd het volume met het gewenste aantal cellen en aggregaten in een microcentrifugebuis van 1,8 milliliter. Sluit de buis en centrifugeer de cellen en aggregaten vervolgens vijf minuten bij 130 gs. Verwijder daarna met een micropipet voorzichtig het supernatant zonder de celpellet aan de onderkant van de buis te verstoren.

Wanneer de kop van de pipet het pellet nadert, gebruik dan een fijnere pipetpunt van 10 µL. Verdeel de celaggregaten gelijkmatig over de gel-precursoroplossing en zorg ervoor dat ze volledig zijn ingekapseld. Dit is het meest uitdagende deel van deze procedure. Let er bij het uitvoeren van deze stap op dat het pellet voorzichtig wordt geresuspendeerd en overgebracht.

Resuspendeer nu voorzichtig de celpellet in 20 microliters van de fotoactieve PEG DM-oplossing. Gebruik een pipetpunt met een brede opening om de celsuspensie in de spuit, bovenop het gecrosslinkte hydrogelgedeelte, aan te brengen; stel de spuit vervolgens bloot aan nog eens acht minuten UV-licht om de constructie van de hydrogel te voltooien. Wanneer dit is voltooid, moeten de cellen volledig ingekapseld zijn binnen de cilindrische hydrogel.

Voeg tenslotte één milliliter HBSS toe aan één well van een 24-wells plaat en één milliliter medium aan een andere well. Spuit vervolgens de hydrogel uit de spuit in de HBSS om de gel kort te wassen. Verplaats de gel naar het medium en cultiveer de plaat onder de gewenste condities.

Op elk gewenst moment tijdens de cultuur kunnen de cellen worden afgebeeld met fluorescentiemicroscopie om de initiatie van de hypoxische signalering te volgen. Plaats de 24-wellplaat op de objecttafel van de microscoop en centreer de well met de hydrogel onder het objectief. Het signaal is specifiek genoeg om individuele signalerende cellen te identificeren, maar de resolutie kan onvoldoende zijn om de intracellulaire lokalisatie van het signaal te bepalen. In signalerende cellen wordt het signaal doorgaans uniform waargenomen in het gehele cytoplasma.

Deze figuur toont een representatief voorbeeld van minx-aggregaten ingekapseld in een PEG-hydrogel binnen de gelcel. Aggregaten moeten volledig in de matrix omsloten zijn en homogeen verdeeld zijn om een beter nutriententransport mogelijk te maken, zoals hier te zien is. Let op hoe de gecrosslinkte gel overal solide is en de vorm aanneemt van het vat waarin de reactie is uitgevoerd.

In deze figuur wordt representatieve fluorescente hypoxiesignalering getoond in geaggregeerde min six-cellen in een PEG DM-hydrogel; cellen die werden ingekapseld en vervolgens 44 uur lang werden geïncubeerd bij 20% zuurstof. De cellen links vertonen geen hypoxiesignalering, terwijl cellen die werden ingekapseld en vervolgens 44 uur lang bij 2% zuurstof werden geïncubeerd, zoals rechts afgebeeld, een duidelijk alomtegenwoordig signaal vertonen. Hypoxie kan ook worden gevolgd in andere celtypen.

Deze figuur toont representatieve hypoxische signalering in ingekapselde aggregaten van mesenchymale stamcellen. Zoals te zien is in de meest linkse figuur, is het fluorescentiesignaal na 12 uur bij 2% oxygen niet detecteerbaar; vervolgens is dit, zoals te zien is in de middelste figuur, duidelijker aanwezig na 24 uur bij 2% oxygen. Ten slotte is er, zoals rechts te zien is, een sterke expressie na 96 uur bij 2% oxygen na het volgen van deze procedure.

Andere methoden, zoals ELISA, analyse van uitgescheiden eiwitten en celviabiliteitsassays, kunnen worden uitgevoerd om hypoxische signalering te correleren met het celfenotype. Met deze ontwikkeling zou deze techniek de weg kunnen vrijmaken voor onderzoekers op het gebied van tissue engineering en celgebaseerde therapeutische toediening om de overlevingsfunctie en differentiatie van cellen binnen scaffolds en inkapselingsmaterialen te onderzoeken.