Tracking Hypoxische Signalering binnen Encapsulated Cell Aggregaten
December 16th, 2011
Een methode voor het foto-inkapseling van cellen in een verknoopt PEG hydrogel wordt beschreven. Hypoxische signalering binnen ingekapseld murine insulinoom (MIN6) aggregaten is gevolgd met behulp van een fluorescerende marker-systeem. Dit systeem maakt serie onderzoek van de cellen binnen een hydrogel steiger en correlatie van hypoxische signalering met veranderingen in de cel fenotype.
Het algemene doel van deze procedure is om de cellulaire respons op hypoxie te monitoren in PEG-gekapselde celaggregaten. In de eerste stap worden verspreide cellen geïnfecteerd met het markervirus en vervolgens gekweekt op een shaker om de vorming van aggregaten mogelijk te maken. Vervolgens wordt lineaire peg gefunctionaliseerd en wordt de PEG DM rimer gezuiverd.
Vervolgens worden de celaggregaten ingekapseld in een PEG DM hydrogel. Ten slotte worden de hydrogels gekweekt onder verschillende zuurstofcondities terwijl ze fluorescerend worden gemonitord op het signaal van de hypoxiemarker. Uiteindelijk kan de locatie en mate van hypoxie-induceerbare factoractiviteit binnen levensvatbare, gekapselde celaggregaten worden gevisualiseerd door middel van eenvoudige fluorescentiemicroscopie.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van celapcapsulatie en cel-gebaseerde therapeutische bezorging, zoals Waar komt hypoxie voor binnen 3D-culturen, en hoe beïnvloedt het de celoverleving en functie? De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot benaderingen in de regeneratieve geneeskunde en de therapie van hormoondeficiënties zoals stipend diabetes vanwege de grote impact van hypoxie in geaggregeerd en gekapseld weefsel. Hypoxie-induceerbare factor een activiteit is aangetoond om te correleren met een aanzienlijk verminderde insulinesecretie van beta-cellen, wat aanzet tot pogingen om primaire oogjes te scheiden en ze te hervormen tot pseudo-oogje.
Aggregaten van kleinere diameter. Onze marker kan hypoxie-induceerbare factoractiviteit aangeven met aggregaten op cellulair niveau binnen elk losgekapseld materiaal. PEG werd gekozen als capsulemateriaal vanwege zijn gunstige overdrachtseigenschappen, cytocompatibiliteit en de gemakkelijke manier waarop het functioneel kan worden gemodificeerd.
Na het wegen van twee gram PEG in een glazen fles van 40 milliliter bij ongeveer 308 microliters methacrylzuuranhydride en de fles losjes sluiten met een hardplastic dop. Magnetron de fles twee minuten op hoog in een standaard huishoudelijke magnetron. Draag vervolgens hittebestendige handschoenen en meng de fles grondig door middel van vortexen en magnetron de oplossing nog eens vijf minuten op hoog.
Laat de fles kort afkoelen totdat deze kan worden gehanteerd en verwijder vervolgens de dop terwijl de fles wordt gedraaid. Meng langzaam methyleenchloride in, waarbij het monster wordt gevortext naarmate de oplossing helder en homogeen wordt. Voeg vervolgens de oplossing druppelsgewijs toe aan 200 milliliter geroerd koude dathylether om de PEG dm te laten precipiteren.
Verzamel vervolgens de PEG DM door vacuümfiltratie en laat het drogen. Zodra de PEG DM is opgedroogd, lost u het op in ongeveer 100 tot 150 milliliter gedeïoniseerd water. Daarna dialyseert u de oplossing gedurende vijf dagen tegen gedeïoniseerd water in dialysebuisjes met een molecuulgewichtsafsnijding van 1000 Daltons na dialyse.
Giet de oplossing in geschikte containers en bevries ze overnacht bij min 80 graden Celsius. Lyofiliseer vervolgens de oplossing gedurende vier dagen om een gezuiverd wit PEG DM-poeder te genereren om de cellen los te laten van het behandelde kweekflaconoppervlak. Zuig eerst het medium af, spoel de cellen met 37 graden CELs calciumvrij HBSS en zuig de HBSS af.
Voeg nu twee milliliter van 37 graden Celsius trips en EDTA-oplossing toe en laat de cellen gedurende drie minuten bij 37 graden Celsius incuberen. Schud vervolgens stevig de zijkant van de flacon om de cellen los te maken bij acht milliliter van 37 graden Celsius, medium in de flacon en pipet de celsuspensie krachtig op en neer. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in komen.
Na het overbrengen van de celsuspensie in een steriele centrifugeerbuis van 15 milliliter, telt u de cellen met behulp van een hemocytometer om het totale aantal cellen te bepalen dat geïnfecteerd moet worden. Voeg het benodigde volume celsuspensie toe om 400.000 cellen per putje te bereiken in de putjes van een zes-putjes suspensiecultuurplaat. Pipet 50 microliter HBSS per putje cellen om te worden geïnfecteerd in een microcentrifugebuis van 1,8 milliliter. Pipet vervolgens voorzichtig de juiste hoeveelheid virussuspensie in de voorbereide HBSS.
Voeg nu het juiste volume verdund virus toe aan elk putje om de gewenste MOI te bereiken, en voeg vervolgens medium toe aan elk putje om het totale volume op 1,7 milliliter te brengen. Plaats tenslotte de plaat op een orbitale shaker Binnen de incubator, zet de shaker op een lage stand van ongeveer 100 RPM zodat het medium zachtjes rond het putje spoelt en laat de cellen 24 tot 36 uur aggregatie toe. Begin met het afsnijden van de taps toelopende punt van een plastic spuit van één milliliter en plaats deze met de geopende kant omhoog in een rek om een vat te creëren waarin de hydrogel zal worden gevormd.
Pipet vervolgens 20 microliter fotoactieve PEG DM-oplossing in het opene uiteinde van de spuit op de plunjer, ervoor zorgen dat het volume het volledige oppervlak van de plunjer bedekt. Pas de plunjer in kleine incrementen aan om een vlakke vloeistofoppervlakte te bereiken. Plaats nu de pipetterug in het rek en positioneer het rek onder een UV-lamp gedurende ongeveer acht minuten om hydrogelvernetseling mogelijk te maken.
Tijdens deze tijd pipet volume met het gewenste aantal cellen en aggregaten in een microcentrifugebuis van 1,8 milliliter. Sluit de buis en centrifugeer vervolgens de cellen en aggregaten gedurende vijf minuten bij 130 gs. Verwijder vervolgens voorzichtig het supernatant met behulp van een micropipet zonder de celpellet aan het uiteinde van de buis te verstoren.
Terwijl de mediakop nadert de pellet, gebruik een fijnere 10 microliter pipettentip Gelijkmatig verspreid de celaggregaten door de gel precursor oplossing terwijl u ervoor zorgt dat ze volledig worden geïncapseld. Dit is het lastigste deel van deze procedure. Zorg er bij het uitvoeren van deze stap voor dat u het pellet zorgvuldig opnieuw bewaart en overbrengt.
Resuspendeer nu voorzichtig de celpellet in 20 microliter van de fotoactieve PEG DM-oplossing. Gebruik een breed mondpijp
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor foto-encapsulatie van cellen in een crosslinked PEG-hydrogel, waardoor het mogelijk is om hypoxische signalering in geëncapsulateerde murine insulinoma-aggregaten te volgen. De techniek maakt seriële onderzoeking van cellen binnen een hydrogel-scaffold mogelijk en correleert hypoxische signalering met veranderingen in celfenotype.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Cel-encapsulatie
- Hypoxie signalering
- Regeneratieve geneeskunde
Achtergrond
- Hypoxie beïnvloedt celoverleving en functie in 3D-culturen.
- PEG wordt gekozen vanwege zijn gunstige overdrachtseigenschappen en cytocompatibiliteit.
- Het begrijpen van hypoxie is cruciaal voor therapieën gericht op hormoondeficiënties.
- Hypoxie-induceerbare factor-activiteit correleert met insulinesecretie van bètacellen.
Doel van de studie
- Om cellulaire reacties op hypoxie in PEG-geëncapsulateerde aggregaten te monitoren.
- Om hypoxie-induceerbare factor-activiteit binnen levensvatbare cel-aggregaten te visualiseren.
- Om de implicaties voor cel-gebaseerde therapeutische afgifte te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Infectie van verspreide cellen met een fluorescent marker-virus.
- Kweek van cellen om aggregaten te vormen op een shaker.
- Functionalisering en zuivering van lineair PEG.
- Encapsulatie van cel-aggregaten in een PEG DM-hydrogel.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle encapsulatie van cellen binnen de hydrogel.
- Fluorescent monitoring van hypoxie-markersignaal onder verschillende zuurstofcondities.
- Visualisatie van hypoxie-induceerbare factor-activiteit op cellulair niveau.
- Inzichten in de impact van hypoxie op celoverleving en functie.
Conclusies
- De methode biedt een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van hypoxie in 3D-culturen.
- Het heeft potentiële toepassingen in regeneratieve geneeskunde en diabetestherapie.
- Verder onderzoek zou de begrip van cel-gebaseerde therapieën kunnen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Monitoring hypoxic signaling in encapsulated cell aggregates addresses a critical challenge in cell-based therapies: ensuring functional viability of transplanted tissues under diffusion-limited conditions. This method enables early detection of oxygen deprivation impacts on insulin-producing cells, supporting predictive confidence in therapeutic efficacy. By correlating HIF-1α activity with functional readouts, it aids in de-risking encapsulation strategies for diabetes and regenerative medicine applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking hypoxia-inducible factor activation to functional decline in insulin secretion.
- Operational Value: Provides a quantifiable fluorescent readout for pathway clarification in encapsulated beta-cell models.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by identifying oxygen thresholds that compromise cell function prior to in vivo testing.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized hydrogels with encapsulated aggregates for reproducible oxygen-gradient screening.
- Quantitative Output: Enables spatial and temporal mapping of hypoxic signaling via fluorescence microscopy.
- Platform Utility: Facilitates assay standardization across oxygen conditions to evaluate encapsulation material performance.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models the avascular microenvironment encountered by encapsulated pancreatic islets in type 1 diabetes therapy.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase hypoxia assessment to preclinical validation of graft survival and function.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs material selection and geometric design to mitigate hypoxia-induced functional loss in therapeutic candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling hypoxia assessment after aggregate formation and prior to functional screening, supporting lead identification of encapsulation formulations.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on oxygen-dependent pathways in encapsulated beta-cell aggregates.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible hydrogels for evaluating compound or material effects under controlled hypoxia.
- Analytics: Provides HIF-1α-driven fluorescence as a quantitative biomarker for comparing oxygen conditions and encapsulation efficacy.
- Translational Research: Connects in vitro hypoxia signaling to preclinical outcomes by correlating marker activity with insulin secretion data.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular platform for evaluating encapsulation materials across cell types and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by reducing ambiguity in hypoxia-mediated functional decline.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined encapsulation and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying hypoxia-related risks early in development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of encapsulation strategies based on functional preservation under low oxygen.
Implementation Considerations
- Requires expertise in virology, cell culture, and hydrogel fabrication.
- Depends on UV crosslinking infrastructure and fluorescent microscopy capabilities.
- Necessitates standardization of oxygen-controlled culture systems for cross-team comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the hypoxia reporter to primary or stem cell-derived aggregates.
- Practical limitations include signal resolution constraints for subcellular localization and dependency on viral transduction efficiency.
