Name: Tracking Hypoxische Signalering binnen Encapsulated Cell Aggregaten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Leer hoe je hypoxische signalering volgt in PEG-gekapselde cellaggregaten met fluorescentiemicroscopie. Deze methode maakt seriële monitoring van hypoxie-induceerbare factoractiviteit mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dankzij de Kristi Anseth lab van de Universiteit van Colorado, Boulder voor het leveren van ruim MIN6 cellen. Financiering voor dit project is verstrekt door de NSF.

1. PEGDM synthese en fotoactieve PEGDM macromer oplossing voor de voorbereiding <ol><li> Weeg 2g van PEG (lineair, 10.000 Da) in een 40 ml glazen flacon met een hard plastic dop. </li><li> Voeg ongeveer 308μL van methacrylzuuranhydride en losjes dop van de flacon. </li><li> Magnetron de flacon op hoge gedurende 2 minuten in een standaard huishoudelijk magnetron. Het dragen van hittebestendige handschoenen, grondig vortex de flacon, dan is de magnetron op hoog voor een extra 5 minuten. </li><li> Kort zodat de flacon genoeg koelen worden behandeld met handschoenen. Haal het beschermkapje het en voeg langzaam methyleenchloride, terwijl wervelende de flacon. Voeg genoeg, zodat de oplossing blijkt duidelijk en homogeen, vortexen het monster als dat nodig is. Het totale volume van de gebruikte methyleenchloride moet 1,5 - 2 ml. </li><li> Neerslag PEGDM in 200 ml koud, geroerd diëthylether door het toevoegen van de oplossing druppelsgewijs. </li><li> Verzamel de PEGDM door vacuümfiltratie en laat het drogen. </li><li> Los de PEGDM in voldoende mategedeïoniseerd water (meestal 100 -150 ml). </li><li> Dialyze de oplossing tegen gedemineraliseerd water gedurende 5 dagen in dialyse buis met een moleculair gewicht van cut-off van 1000 Da. Vervang het water eenmaal daags. </li><li> Aliquot de oplossing in daarvoor bestemde containers en invriezen bij -80 ° C gedurende de nacht. Lyophilize de oplossing voor 4 dagen naar een gezuiverde witte poeder PEGDM opleveren. Bewaar het poeder bij 4 ° C wanneer niet in gebruik. </li><li> Ter voorbereiding op een fotoactieve PEGDM oplossing, prepareert u eerst een 0,5 gewichtsprocent fotoinitiator stockoplossing door het oplossen van Irgacure 2959 in gedeïoniseerd water. Vortex de oplossing en bewaar het in het donker. </li><li> Bereid een 10 gew% PEGDM en 0,025 gew% Irgacure 2959 oplossing in Balanced Salt Solution Hank&#39;s (HBSS). Vortex grondig op ontbinding van de PEGDM te verzekeren. We meestal voor te bereiden 1 ml van deze oplossing op een moment. </li><li> Steriliseer de oplossing door te filteren door middel van een injectiespuit 0,2 um filter in een 1,8 ml microcentrifugebuis. Wikkel de buis in aluminiumfolieen bewaar bij 4 ° C </li></ol> 2. Cultuur, infectie en aggregatie van MIN6 cellen <ol><li> MIN6 cellen worden gekweekt in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FBS, 7mm glucose, 100 eenheden / ml penicilline / streptomycine, en 0,5 pg / ml amphotercin B in een vochtige omgeving bij 37 ° C en 5% CO 2. </li><li> Vrij te geven de cellen van het behandelde oppervlak cultuur fles, zuig het medium, spoel de cellen met 37 ° C calcium / magnesium-vrij HBSS, aspiratie van de HBSS, voeg vervolgens 2 ml van 37 ° C trypsine-EDTA oplossing en laat de cellen incubeer gedurende 3 minuten. </li><li> Stevig potje aan de zijkant van de buis om de cellen te kloppen gratis, voeg vervolgens 8 mL van 37 ° C medium en krachtig de celsuspensie omhoog pipet en neer zorg niet te bellen introduceren. </li><li> Pipetteer de cellen in een steriele 15 ml centrifugebuis en het uitvoeren van een celgetal met behulp van een hemocytometer of een andere cel tellen procedure. </li><li> Bij de voorbereiding van de cellen te infecteren met de makervirus, eerst bepalen het totale aantal cellen besmet worden en bereken het volume van het virus suspensie nodig is om de gewenste multipliciteit van infectie (MOI) (50 tot 100 besmettelijke deeltjes per cel) te bereiken. </li><li> Verdun het virus in HBSS door voorzichtig pipetteren de juiste hoeveelheid van het virus suspensie in een pre-gealiquoteerd volume van HBSS in een 1,8 ml microcentrifugebuis. 50 ul van HBSS per putje van de samenvoeging van cellen geschikt is. </li><li> De verspreiding van de cellen door pipetteren ze op en neer in hun buis, dan pipet het nodige volume van 400.000 cellen per putje te bereiken in de putjes van een 6-well ophanging cultuur plaat. </li><li> Voeg de juiste volume verdund virus aan elk putje om de gewenste MOI te bereiken. </li><li> Voeg medium in elk putje om het totale volume aan te passen aan 1,7 ml. </li><li> Plaats de plaat op een rondschudapparaat in de incubator. Zet de shaker op een lage stand, zodat het medium voorzichtig wast rond de putten (~ 100 rpm). Laat de cellen aggregatieniveaute voor 24-36 uur. Aggregaten met een geschatte diameter van 75 tot 175 micrometer moet worden gevormd. </li></ol> 3. Inkapseling van cellen in PEGDM <ol><li> Cellen kunnen worden ingekapseld als een dispersie (stap 2.4), of na aggregatie (stap 2.10). Sinds de hydrogel precursor PEGDM oplossing is een vloeistof, kunnen cellen hebben de neiging om zich te vestigen voorafgaand aan verknoping en hydrogel vorming. Indien de afwikkeling zal naar verwachting snel plaatsvinden, zoals met grotere aggregaten, kan het nuttig zijn om de hydrogel te produceren in twee stappen, zodat de cellen af ​​te wikkelen naar een centrale vlak van de gel. Een een-stap hydrogel synthese procedure geschikt is voor verspreide cellen wordt getoond (Figuur 2) en de twee-staps procedure wordt getoond als goed (Figuur 3) en gedetailleerde hieronder (3,2 tot +3,9). </li><li> Maak een vat waarin de hydrogel wordt gevormd door het snijden van de taps toelopende tip van een 1 ml plastic spuit en het plaatsen van het open uiteinde in een rack. </li><li> Pipetteer 20 ul van fotoactieve PEGDM zolutie in het open uiteinde van de spuit op de zuiger ervoor te zorgen dat het volume beslaat de gehele zuiger oppervlak. Pas de zuiger in kleine stappen op een vlakke ondergrond vloeistof te bereiken. </li><li> Plaats de pipet in het rek en plaats het rek onder een UV-lamp (365nm, ~ 7 mW / cm 2) voor ongeveer 8 minuten zodat voor de hydrogel verknoping. Gedurende deze tijd kan de voorbereiding van de cellen worden begonnen </li><li> Pipet een volume met het gewenste aantal cellen / aggregaten in een 1,8 ml microcentrifugebuis, cap, en centrifugeer de buis op 130 g gedurende 5 minuten. </li><li> Met behulp van een micropipettor, verwijder voorzichtig de media zonder de celpellet aan het uiteinde van de buis. Zoals de media het hoofd nadert de korrel, kan het nuttig zijn om een ​​fijner te gebruiken, 10 pi pipet tip. </li><li> Voorzichtig resuspendeer de cel pellet in 20 ul fotoactieve PEGDM oplossing (gebruik van een brede mond pipet tip bij het werken met aggregaten) en voeg de celsuspensie aan de spuit op de top van ee eerder verknoopt hydrogel gedeelte. </li><li> Expose de spuit om een ​​extra 8 minuten van het UV-licht voor de bouw van de hydrogel te voltooien. Wanneer u klaar bent, moet de cellen volledig worden ingekapseld in de cilindrische hydrogel (figuur 3). </li><li> Verwijder de hydrogel uit de spuit in 1 ml van HBSS in het putje van een 24-well plaat om kort was de gel. Breng de gel tot 1 ml van media in het putje van een 24-wells plaat en cultuur onder de gewenste condities. </li></ol> 4. Hypoxie tracking <ol><li> Op elk moment tijdens de cultuur, het imago van de cellen met behulp van fluorescentie microscopie om de opening van hypoxische signalering track. Afhankelijk van wat wordt afgebeeld kunt u beeld in de multi-well plaat of de gel op een objectglaasje voor transfer naar plaatsing op de microscoop podium. Peak excitatie van Ds Red is bereikt bij 556nm en de piek emissie vindt plaats bij 586nm. -Emissie is vrij intens en dus fotobleking is niet waarneembareed te zijn problematisch. Vertraging tussen de aanvang van de eiwitproductie en eerste signaal detectie is ongeveer 12 uur. Signaal is specifiek genoeg voor bepaalde signalering cellen te identificeren, maar resolutie kan onvoldoende voor het bepalen van intracellulaire signaal lokalisatie. Bij het signaleren van cellen, is het signaal meestal uniform tijdens de hele het cytoplasma. Intensiteit van het signaal kan ook toenemen bij langdurige blootstelling aan hypoxie, al hebben we nog niet volledig vastgesteld of dit te wijten is aan verhoogde eiwitexpressie, de totale eiwit ophoping, of vertraagd eiwit rijping. </li></ol> 5. Representatieve resultaten Een representatief voorbeeld van MIN6 aggregaten ingekapseld in een PEG hydrogel is weergegeven in Figuur 4. De verknoopte gel wordt sterk zijn, waarbij de vorm van het vat waarin de reactie werd uitgevoerd. Een gel met gladde buitenkant is de voorkeur voor implantatie te helpen bij de preventie van een vreemd lichaam response. In de gel, moet cel aggregaten volledig worden ingesloten in de matrix en homogeen verdeeld om een ​​betere transport van nutriënten. Representatief beeld van hypoxische signalering in MIN6 aggregaten zijn afgebeeld in figuur 5. Identieke MIN6 aggregaten besmet met het virus marker werden gekweekt in een van beide 20% O 2 (5 bis) of 1% O 2 (5b) voor 44 uur voordat de foto vast te leggen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig1.jpg" /> Figuur 1. Schematische voorstelling van de activiteit van onze hypoxie merker-systeem. Adenovirale het inbrengen van de Ds Red DR gen en upstream HRE promotor zorgt voor hypoxie-geïnduceerde productie van het fluorescerende eiwit onder de controle van HIF-1. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig2.jpg" /> Figuur 2. Procedurele stroomschema voor de single-step inkapseling van MIN6 cellen verspreid in een crosslinked PEGDM hydrogel. Voor elke gel, worden de verspreid cellen gesuspendeerd in 40μL van de fotoactieve PEGDM macromer oplossing. Dit is geplaatst in een onthoofd 1 ml spuit en de hydrogel wordt gevormd onder 365nm UV-licht na 10-12 minuten. Na voltooiing wordt de hydrogel schijf verwijderd uit de spuit, gewassen en geplaatst in een medium-gevulde wells plaat voor incubatie. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig3.jpg" /> Figuur 3. Procedurele stroomschema voor de dual-stap inkapseling van geaggregeerde MIN6 cellen in een verknoopt PEGDM hydrogel. Voor elke gel, is een half-gel eerst gemaakt door middel van UV verknoping van 20μL van de fotoactieve PEGDM macromer oplossing gedurende 8 minuten. MIN6 aggregaten zijn zorgvuldig gesuspendeerd in een extra 20μL van fotoactieve macromer oplossing die wordt toegevoegd op de top van de voorgevormde half-gel. De volledige gel wordt gevormd door een extra 8 minuten van UV-straling met aggregaten volledig ingekapseld in de medialevlak van de gel. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig4.jpg" /> Figuur 4. Afbeelding van een 40μL hydrogel onder een vergroting van 20x. MIN6 aggregaten (~ 400.000 totaal-cellen) zijn duidelijk te zien in de gel. Hydrogel diameter is ongeveer 6 mm (bar = 1mm). <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig5.jpg" /> Figuur 5. Fluorescent hypoxie signalisatie in geaggregeerde MIN6 cellen in een PEGDM hydrogel. Cellen die zijn ingekapseld en vervolgens geplaatst in de incubatie bij 20% O 2 voor 44 uur doen hypoxie signalisatie (a) niet weergegeven, terwijl cellen die vervolgens werden ingekapseld geïncubeerd in 2% O 2 voor 44 uur een leeg scherm alomtegenwoordig signaal. (Bar = 100 urn) (b).

<ol><li>Kelly, W., Lillehei, R., Merkel, F., Idezuki, Y., Goetz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allotransplantation+of+the+pancreas+and+duodenum+along+with+the+kidney+in+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Allotransplantation of the pancreas and duodenum along with the kidney in diabetic nephropathy.</a> Surgery. 61, 827-837 (1967).</li>
<li>Shapiro, J. A. M., Ricordi, C., Hering, B. J., Auchincloss, H., Lindblad, R., Robertson, R. P., Secchi, A., Brendel, M. D., Berney, T., Brennan, D. C., Cagliero, E., Alejandro, R., Ryan, E. A., DiMercurio, B., Morel, P., Polonsky, K. S., Reems, J., Bretzel, R. G., Bertuzzi, F., Froud, T., Kandaswamy, R., Sutherland, D. E. R., Eisenbarth, G., Segal, M., Preiksaitis, J., Korbutt, G. S., Barton, F. B., Viviano, L., Seyfert-Margolis, V., Bluestone, J., Lakey, J. R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+trial+of+the+Edmonton+Protocol+for+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Eng.+J.+Med.%22%5BJournal%5D)">International trial of the Edmonton Protocol for islet transplantation.</a> N. Eng. J. Med.. 355, 1318-1330 (2006).</li>
<li>Sun, A. M., O'Shea, G. M., Goosen, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+microencapsulated+islet+cells+as+a+bioartificial+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Appli.+Biochem.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Injectable microencapsulated islet cells as a bioartificial pancreas.</a> Appli. Biochem. Biotechnol. 10, 87-99 (1984).</li>
<li>Iwata, H., Amemiva, H., Matsuda, T., Takano, H., Hayashi, R., Akutsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+microencapsulated+islets+in+agarose+gel+as+bioartificial+pancreas+by+studies+of+hormone+secretion+in+culture+and+by+xenotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Evaluation of microencapsulated islets in agarose gel as bioartificial pancreas by studies of hormone secretion in culture and by xenotransplantation.</a> Diabetes. 39, 224-225 (1989).</li>
<li>Zhang, W. J., Laue, C., Hyder, A., Schrezenmeir, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purity+of+alginate+affects+the+viability+and+fibrotic+overgrowth+of+encapsulated+porcine+iselt+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Purity of alginate affects the viability and fibrotic overgrowth of encapsulated porcine iselt xenografts.</a> Transplant Proc. 33, 3517-3519 (2001).</li>
<li>Lin-Gibson, S., Bencherif, S., Cooper, J. A., Wetzel, S. J., Antonucci, J. M., Vogel, B. M., Horkay, F., Washburn, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+PEG+dimethacrylates+and+their+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of PEG dimethacrylates and their hydrogels.</a> Biomacromolecules. 5, 1280-1287 (2004).</li>
<li>Weber, L. M., He, J., Bradley, B., Haskins, K., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG-based+hydrogels+as+an+in+vitro+encapsulation+platform+for+testing+controlled+%CE%B2-cell+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Biomater%22%5BJournal%5D)">PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled β-cell microenvironments.</a> Acta. Biomater. 2, 1-8 (2006).</li>
<li>Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+PEG+hydrogel+crosslinking+density+on+protein+diffusion+and+encapsulated+islet+survival+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 90, 720-729 (2009).</li>
<li>Bryant, S. J., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+properties+influence+ECM+production+by+chondrocyte+photoencapsulated+in+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">Hydrogel properties influence ECM production by chondrocyte photoencapsulated in poly(ethylene glycol) hydrogels.</a> J. Biomed. Mater. Res. 59, 63-72 (2001).</li>
<li>Bryant, S. J., Nuttelman, C. R., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytocompatibility+of+UV+and+visible+light+photoinitiating+systems+on+cultured+NIH%2F3T3+fibroblasts+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomater.+Sci.+Polymer+Edn%22%5BJournal%5D)">Cytocompatibility of UV and visible light photoinitiating systems on cultured NIH/3T3 fibroblasts in vitro.</a> J. Biomater. Sci. Polymer Edn. 11, 439-457 (2000).</li>
<li>Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+oxygen+on+isolated+pancreatic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Trans.+Am.+Soc.+Artif.+Intern.+Organs%22%5BJournal%5D)">Effect of oxygen on isolated pancreatic tissue.</a> Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs. 35, 739-741 (1989).</li>
<li>Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+hypoxia+on+insulin+secretion+by+isolated+rat+and+canine+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Effect of hypoxia on insulin secretion by isolated rat and canine islets of Langerhans.</a> Diabetes. 42, 12-21 (1993).</li>
<li>De Groot, M., Schuurs, T. A., Keizer, P. P. M., Fekken, S., Leuvenink, H. G. D., van Schilfgaarde, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+encapsulated+rat+pancreatic+islets+to+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Response of encapsulated rat pancreatic islets to hypoxia.</a> Cell Transplant. 12, 867-875 (2003).</li>
<li>Fancy, M. L., Topiwala, R., Sahai, P., S,, Blanchette, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlating+hypoxia+with+insulin+secretion+using+a+fluorescent+hypoxia+detection+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+B%22%5BJournal%5D)">Correlating hypoxia with insulin secretion using a fluorescent hypoxia detection system.</a> J. Biomed. Mater. Res. B. 97, 148-155 (2011).</li>
<li>Webb, J. D., Coleman, M. L., Pugh, C. W. H. ypoxia <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hypoxia-inducible+factors+%28HIF%29%2C+HIF+hydroxylases+and+oxygen+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">hypoxia-inducible factors (HIF), HIF hydroxylases and oxygen sensing.</a> Cell. Mol. Life Sci. 66, 3539-3554 (2009).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De hier gepresenteerde methode biedt een snelle en eenvoudige techniek voor mobiele inkapseling in een PEG hydrogel met minimale gebruik van niet-fysiologische omstandigheden. PEG is een zeer nuttige inkapseling materiaal voor de biocompatibiliteit en het gemak van de wijziging. Eenvoudige variatie van PEG percentage in het fotoactieve oplossing, bijvoorbeeld, kan worden gebruikt om mechanische eigenschappen, zoals druk-modulus, en transport eigenschappen aan te passen door middel van poriegrootte. Ook is PEG eenvoudig worden aangepast door de toevoeging van zijketens. PEG hydrogels, dus, is zowel een veelbelovende klinische apparaat en een flexibel platform voor in-vitro-onderzoek Een methode voor het bijhouden van hypoxie in de PEG-ingekapselde cellen is ook gepresenteerd. Deze methode is handig voor de eenvoud van hypoxie detectie en voor het voorkomen van de noodzaak om de cellen van belang te offeren. De techniek kan worden toegepast op een verscheidenheid van soorten cellen in een uiteenlopende omstandigheden te maken zijn wijefulness breed. Zo kan hypoxie als een cue voor de stamcellen differentiatie worden bijgehouden in stamcellen Micromass culturen. Toch kan deze methode alleen worden toegepast op cel-systemen of systeem waarin verspreide cellen zijn later samengevoegd verspreiden. Ook kan de detectie van het fluorescentie-signaal moeilijk zijn in grotere of dichter weefsels.

<table border="1"><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties (optioneel </td></tr><tr><td> PEG </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 309028-500G </td><td></td></tr><tr><td> Methacrylzuuranhydride </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 276685-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Magnetron </td><td> Emerson </td><td> MW8784SB </td><td></td></tr><tr><td> Vortexer </td><td> Wetenschappelijke Industries </td><td> SI-A236 </td><td></td></tr><tr><td> Methyleenchloride </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D65100-1L </td><td></td></tr><tr><td> Diethylether </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 346136-1L </td><td></td></tr><tr><td> Dialyse Tubing </td><td> Spectrum </td><td> 132640 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Laboratoria </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vriezer </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td&gt; Vriesdroger </td><td> Labconco </td><td> 7670521 </td><td></td></tr><tr><td> Vacuümpomp </td><td> Bedriegen </td><td> 8917Z-01 </td><td></td></tr><tr><td> Irgacure 2959 </td><td> Ciba-Geigy </td><td> 029891301PS04 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Mediatech </td><td> 21-022-CV </td><td></td></tr><tr><td> Spuitfilter </td><td> VWR </td><td> 28145-477 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Mediatech </td><td> * </td><td> * Custom formulering </td></tr><tr><td> FBS </td><td> PAA Laboratories </td><td> A15-351 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilline-streptomycine </td><td> Mediatech </td><td> 30 tot 002-CI </td><td></td></tr><tr><td> Amfotericine B </td><td> Mediatech </td><td> 30 tot 003-CF </td><td></td></tr><tr><td> Couveuse </td><td> Thermo Scientific </td><td> 3597 </td><td> Napco Series 8000 WJ w / O2 onderdrukking </td></tr><tr><td> Trypsine EDTA </td><td> Mediatech </td><td> 25 tot 052-CI </td><td></td></tr><tr><td> Orbital Shaker</td><td> VWR </td><td> 12620-926 </td><td></td></tr><tr><td> UV-lamp </td><td> Sanyo Denri </td><td> FLR40SBLB / M </td><td> Heeft twee 40W, 365nm blacklight blauw UV-lampen </td></tr><tr><td> Centrifuge </td><td> Eppendorf </td><td> 5811 000.010 * </td><td> * Ordernummer. Model 5810 R </td></tr><tr><td> Microscoop </td><td> Nikon </td><td> TI-Pd6-PFS </td><td> Met filterset voor 556nm excitatie / 586nm emissie </td></tr></table>

tracking hypoxische signalering binnen encapsulated cell aggregaten

Tracking Hypoxic Signaling within Encapsulated Cell Aggregates

In Diabetes mellitus type 1, auto-immune vernietiging van de pancreas β-cellen resulteert in het verlies van de productie van insuline en potentieel dodelijke hyperglykemie. Als een alternatieve behandelingsoptie zijn voor exogene insuline-injectie, is transplantatie van functionele pancreas weefsel onderzocht 1,2. Deze aanpak biedt de belofte van een meer natuurlijke, lange termijn herstel van normoglycemia. Bescherming van de donor weefsel van het immuunsysteem van de gastheer nodig om te voorkomen dat afwijzing en inkapseling is een methode die wordt gebruikt om te helpen dit doel te bereiken. Biologisch afgeleide materialen, zoals alginaat 3 en 4 agarose, zijn de traditionele keuze voor de capsule de bouw, maar kan een ontsteking of een fibrotische overgroei 5 die voedingsstoffen en zuurstof transport kunnen belemmeren induceren. Als alternatief, synthetische poly (ethyleenglycol) (PEG)-gebaseerde hydrogels zijn niet-afbrekende, gemakkelijk gefunctionaliseerde, beschikbaar op hoge zuiverheid,hebben regelbare poriegrootte, en zijn extreem biocompatibel, 6,7,8. Als bijkomend voordeel, kan PEG hydrogels snel worden gevormd in een eenvoudige foto-crosslinking reactie die niet nodig is de toepassing van niet-fysiologische temperaturen 6,7. Een dergelijke procedure wordt hier beschreven. In de verknopingsreactie, UV degradatie van de foto-initiator, 1 - [4 - (2-hydroxyethoxy)-fenyl]-2-hydroxy-2-methyl-1-propaan-1-een (Irgacure 2959), produceert vrije radicalen die aanval de vinyl koolstof-koolstof dubbele bindingen van dimethacrylated PEG (PEGDM) induceren verknoping aan de ketting uiteinden. Verknoping kan worden bereikt binnen 10 minuten. PEG hydrogels gebouwd op een zodanige wijze is aangetoond dat ze positief te ondersteunen cellen 7,9, en de lage fotoinitiator concentratie en korte blootstelling aan UV-straling is niet schadelijk voor de levensvatbaarheid en functie van de ingekapselde weefsel 10. Terwijl we methacrylaat onze PEG met de hierna beschreven methode, kan PEGDM ook directly gekocht van leveranciers zoals Sigma. Een inherent gevolg van inkapseling is isolatie van de cellen van een vasculaire netwerk. Aanvoer van voedingsstoffen, met name zuurstof, is daarom verminderd en beperkt door diffusie. Deze verminderde beschikbaarheid van zuurstof kan met name gevolgen voor β-cellen waarvan de insuline secretie functie is sterk afhankelijk van zuurstof 11-13. Capsule samenstelling en de geometrie zal ook gevolgen hebben diffusie tarieven en lengtes voor zuurstof. Daarom hebben we ook een beschrijving van een techniek voor het identificeren van hypoxische cellen binnen onze PEG capsules. Infectie van de cellen met een recombinant adenovirus zorgt voor een fluorescent signaal wordt geproduceerd wanneer intracellulaire hypoxia-induceerbare factor (HIF) paden worden geactiveerd 14. Omdat HIFs zijn de belangrijkste regulatoren van de transcriptionele respons op hypoxie, zij vertegenwoordigen een ideaal doelwit marker voor de detectie van hypoxische signalering 15. Deze aanpak zorgt voor eenvoudige en snelle detectie van HYPOXIc cellen. Kortom, het adenovirus is de sequentie voor een rood fluorescerend eiwit (Ds Red DR uit Clontech) onder de controle van een hypoxie-responsief element (HRE) trimeer. Stabilisatie van HIF-1 door lage zuurstofgehalte zal rijden transcriptie van het fluorescente eiwit (figuur 1). Aanvullende details over de bouw van dit virus zijn eerder 15 gepubliceerd. Het virus wordt opgeslagen in 10% glycerol bij -80 ° C zoveel 150 pi porties in 1,5 ml centrifugebuis bij een concentratie van 3,4 x 10 10 PFU / ml. Eerdere studies in ons laboratorium hebben aangetoond dat MIN6 cellen ingekapseld als aggregaten behouden hun levensvatbaarheid gedurende vier weken van de cultuur in 20% zuurstof. MIN6 aggregaten gekweekt op 2 of 1% zuurstof beide tekenen van necrotische cellen (nog ongeveer 85-90% levensvatbare) toonde door kleuring met ethidiumbromide en morfologische veranderingen ten opzichte van cellen in 20% zuurstof. De gladde bolvormige vorm van de aggregaten worden weergegeven op 20% was lost en aggregaten leek meer op ongeorganiseerde groepen van cellen. Terwijl het lage zuurstof-spanning niet leiden tot een uitgesproken daling van de levensvatbaarheid, is duidelijk van invloed MIN6 aggregatie en functie zoals gemeten door glucose-gestimuleerde insuline secretie 15. Western blot analyse van ingekapselde cellen in 20% en 1% zuurstof toonde ook een significante toename van HIF-1α voor cellen gekweekt in het lage zuurstofgehalte, die correleert met de expressie van de DsRed DR eiwit.

Een methode voor het foto-inkapseling van cellen in een verknoopt PEG hydrogel wordt beschreven. Hypoxische signalering binnen ingekapseld murine insulinoom (MIN6) aggregaten is gevolgd met behulp van een fluorescerende marker-systeem. Dit systeem maakt serie onderzoek van de cellen binnen een hydrogel steiger en correlatie van hypoxische signalering met veranderingen in de cel fenotype.

Tracking Hypoxische Signalering binnen Encapsulated Cell Aggregaten

Bij diabetes mellitus type 1 leidt auto-immuunvernietiging van de pancreatische $\beta$-cellen tot verlies van insulineproductie en potentieel dodelijke ...

Het algemene doel van deze procedure is om de cellulaire respons op hypoxie in PEG-ingekapselde celaggregaten te monitoren. In de eerste stap worden verspreide cellen geïnfecteerd met het marker-virus en vervolgens gekweekt op een schudapparaat om de vorming van aggregaten mogelijk te maken. Vervolgens wordt lineaire PEG gefunctionaliseerd en wordt de PEG DM-primer gezuiverd.Vervolgens worden de celaggregaten ingekapseld in een PEG DM-hydrogel. Ten slotte worden de hydrogels gekweekt onder verschillende zuurstofcondities, waarbij het signaal van de hypoxiemarker fluorescent wordt gemonitord. Uiteindelijk kan de locatie en omvang van de activiteit van de hypoxie-induceerbare factor binnen levensvatige ingekapselde celaggregaten worden gevisualiseerd via eenvoudige fluorescentiemicroscopie.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de velden van celencapsulatie en celgebaseerde therapeutische toediening, zoals: waar treedt hypoxie op binnen 3D-culturen, en hoe beïnvloedt dit de overleving en functie van cellen? De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot regeneratieve geneeskundebenaderingen en de therapie voor hormoondeficiënties zoals diabetes, vanwege de grote impact van hypoxie in geaggregeerde en ingekapselde weefsels. Het is aangetoond dat de activiteit van hypoxie-induceerbare factor 1 correleert met een sterk verminderde insulinesecretie uit bètacellen, wat pogingen motiveert om primaire eilandjes te dissociëren en deze te hervormen tot pseudo-eilandjes.Aggregaten met een gereduceerde diameter. Onze marker kan de activiteit van hypoxia-induceerbare factor aangeven met aggregaten op cellulair niveau binnen elk losgelaten inkapselingsmateriaal. PEG werd gekozen als kapselmateriaal vanwege de gunstige transfereigenschappen, cytocompatibiliteit en het gemak waarmee het functioneel kan worden gemodificeerd.Weeg twee gram PEG af in een glazen flacon van 40 milliliter met ongeveer 308 µL methacrylzuumhydride en sluit de flacon losjes af met een harde plastic dop. Verwarm de flacon twee minuten op de hoogste stand in een standaard huishoudelijke magnetron. Vortex de flacon vervolgens grondig terwijl u hittebestendige handschoenen draagt en verwarm de oplossing nogmaals vijf minuten op de hoogste stand in de magnetron.Laat het flacon kort genoeg afkoelen om gehanteerd te kunnen worden en draai vervolgens de dop eraf terwijl u met het flacon walselt. Meng langzaam methyleenchloride erdoor en vortex het monster indien nodig totdat de oplossing helder en homogeen oogt. Voeg de oplossing vervolgens druppelsgewijs toe aan 200 milliliters geroerde koude dathylether om de PEG dm te laten neerslaan.Verzamel vervolgens de PEG DM door vacuümfiltratie en laat deze drogen. Zodra de PEG DM is gedroogd, wordt deze opgelost in ongeveer 100 tot 150 milliliter gedeïoniseerd water. Dialyseer de oplossing vervolgens gedurende vijf dagen tegen gedeïoniseerd water in dialysebuizen met een molecular weight cutoff van 1000 Daltons na dialyse.Giet de oplossing in geschikte containers en vries deze gedurende de nacht in bij -80 °C. Lyofiliseer de oplossing vervolgens gedurende vier dagen om een gezuiverd wit PEG DM-poeder te verkrijgen om de cellen van het oppervlak van de behandelde kweekfles te laten loslaten. Aspireer eerst het medium, spoel de cellen met calcium- en magnesiumvrij HBSS bij 37 °C en aspireer het HBSS.Voeg nu twee milliliter trypsin-EDTA-oplossing van 37 °C toe en laat de cellen drie minuten incuberen bij 37 °C. Schud vervolgens stevig tegen de zijkant van de kolf om de cellen los te maken. Voeg acht milliliter medium van 37 °C toe aan de kolf en pipetteer de celsuspensie krachtig op en neer, waarbij u er zorg voor draagt dat er geen luchtbellen ontstaan.Nadat de celoplossing is overgebracht naar een steriele centrifugebuis van 15 milliliter, worden de cellen geteld met een hemocytometer om het totaal aantal te infecteren cellen te bepalen. Voeg het benodigde volume celсусpensie toe aan de wells van een six-well suspensiecultuurplaat om 400.000 cellen per well te bereiken. Aliquoteer 50 microliters HBSS per well met te infecteren cellen in een microcentrifugebuis van 1,8 milliliter. Pipetteer vervolgens zorgvuldig de juiste hoeveelheid virusсусpensie in het voorbereide HBSS.Voeg nu het juiste volume verdund virus toe aan elke put om de gewenste MOI te bereiken, en voeg vervolgens medium toe aan elke put om het totale volume aan te vullen tot 1,7 milliliters. Plaats de plaat vervolgens op een orbitale schudmachine in de incubator, stel de schudmachine in op een lage stand van ongeveer 100 RPM, zodat het medium zachtjes door de put spoelt, en laat de cellen 24 tot 36 uur aggregeren. Begin met het afsnijden van de taps toelopende punt van een plastic spuit van één milliliter en plaats deze met de open zijde naar boven in een rek om een vat te creëren waarin de hydrogel zal worden gevormd.Pipetteer vervolgens 20 µL van de foto-actieve PEG DM-oplossing in het open uiteinde van de spuit op de zuiger, waarbij u ervoor zorgt dat het volume het gehele oppervlak van de zuiger bedekt. Pas de positie van de zuiger in kleine stappen aan om een vlak vloeistofoppervlak te verkrijgen. Plaats de pipet nu terug in het rek en positioneer het rek gedurende ongeveer acht minuten onder een UV-lamp om de cross-linking van de hydrogel mogelijk te maken.Pipette gedurende deze tijd het volume met het gewenste aantal cellen en aggregaten in een microcentrifugebuis van 1,8 milliliter. Sluit de buis en centrifugeer de cellen en aggregaten vervolgens vijf minuten bij 130 gs. Verwijder daarna met een micropipet voorzichtig het supernatant zonder de celpellet aan de onderkant van de buis te verstoren.Wanneer de kop van de pipet het pellet nadert, gebruik dan een fijnere pipetpunt van 10 µL. Verdeel de celaggregaten gelijkmatig over de gel-precursoroplossing en zorg ervoor dat ze volledig zijn ingekapseld. Dit is het meest uitdagende deel van deze procedure. Let er bij het uitvoeren van deze stap op dat het pellet voorzichtig wordt geresuspendeerd en overgebracht.Resuspendeer nu voorzichtig de celpellet in 20 microliters van de fotoactieve PEG DM-oplossing. Gebruik een pipetpunt met een brede opening om de celsuspensie in de spuit, bovenop het gecrosslinkte hydrogelgedeelte, aan te brengen; stel de spuit vervolgens bloot aan nog eens acht minuten UV-licht om de constructie van de hydrogel te voltooien. Wanneer dit is voltooid, moeten de cellen volledig ingekapseld zijn binnen de cilindrische hydrogel.Voeg tenslotte één milliliter HBSS toe aan één well van een 24-wells plaat en één milliliter medium aan een andere well. Spuit vervolgens de hydrogel uit de spuit in de HBSS om de gel kort te wassen. Verplaats de gel naar het medium en cultiveer de plaat onder de gewenste condities.Op elk gewenst moment tijdens de cultuur kunnen de cellen worden afgebeeld met fluorescentiemicroscopie om de initiatie van de hypoxische signalering te volgen. Plaats de 24-wellplaat op de objecttafel van de microscoop en centreer de well met de hydrogel onder het objectief. Het signaal is specifiek genoeg om individuele signalerende cellen te identificeren, maar de resolutie kan onvoldoende zijn om de intracellulaire lokalisatie van het signaal te bepalen. In signalerende cellen wordt het signaal doorgaans uniform waargenomen in het gehele cytoplasma.Deze figuur toont een representatief voorbeeld van minx-aggregaten ingekapseld in een PEG-hydrogel binnen de gelcel. Aggregaten moeten volledig in de matrix omsloten zijn en homogeen verdeeld zijn om een beter nutriententransport mogelijk te maken, zoals hier te zien is. Let op hoe de gecrosslinkte gel overal solide is en de vorm aanneemt van het vat waarin de reactie is uitgevoerd.In deze figuur wordt representatieve fluorescente hypoxiesignalering getoond in geaggregeerde min six-cellen in een PEG DM-hydrogel; cellen die werden ingekapseld en vervolgens 44 uur lang werden geïncubeerd bij 20% zuurstof. De cellen links vertonen geen hypoxiesignalering, terwijl cellen die werden ingekapseld en vervolgens 44 uur lang bij 2% zuurstof werden geïncubeerd, zoals rechts afgebeeld, een duidelijk alomtegenwoordig signaal vertonen. Hypoxie kan ook worden gevolgd in andere celtypen.Deze figuur toont representatieve hypoxische signalering in ingekapselde aggregaten van mesenchymale stamcellen. Zoals te zien is in de meest linkse figuur, is het fluorescentiesignaal na 12 uur bij 2% oxygen niet detecteerbaar; vervolgens is dit, zoals te zien is in de middelste figuur, duidelijker aanwezig na 24 uur bij 2% oxygen. Ten slotte is er, zoals rechts te zien is, een sterke expressie na 96 uur bij 2% oxygen na het volgen van deze procedure.Andere methoden, zoals ELISA, analyse van uitgescheiden eiwitten en celviabiliteitsassays, kunnen worden uitgevoerd om hypoxische signalering te correleren met het celfenotype. Met deze ontwikkeling zou deze techniek de weg kunnen vrijmaken voor onderzoekers op het gebied van tissue engineering en celgebaseerde therapeutische toediening om de overlevingsfunctie en differentiatie van cellen binnen scaffolds en inkapselingsmaterialen te onderzoeken.

tracking-hypoxic-signaling-within-encapsulated-cell-aggregates

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

We presenteren protocollen voor de 3-dimensionale (3D) het inkapselen van de cellen binnen synthetische hydrogels. De inkapseling procedure is beschreven voor de twee meest gebruikte methodes van verknoping (michael-type naast en licht geïnitieerde vrije radicalen mechanismen), evenals een aantal technieken voor het beoordelen van ingekapselde cel gedrag.

Cellulaire Encapsulation in 3D Hydrogelen voor Tissue Engineering

Live-cell imaging van caspase-3-gemedieerde apoptose in vereeuwigd N19-oligodendrocyt celculturen met behulp van...

Monitoring gekliefde caspase-3 activiteit en apoptose van geïmmortaliseerde Oligodendrogliale cellen met behulp van live-cell imaging en Cleaveable fluorogene-dye Substraten Na Kalium-geïnduceerde membraandepolarisatie

Wij presenteren een eenvoudig protocol om gebieden van geprogrammeerde celdood (PCD) in muizenembryo's en onderscheidende embryonale stamcellen (ES) celkweken met een sterk oplosbare kleurstof genoemd LysoTracker visualiseren.

Het gebruik van LysoTracker tot geprogrammeerde celdood detecteren in embryo&#39;s en differentiëren van embryonale stamcellen

In this video, we demonstrate the technique to measure transcellular interactions between synaptic cell adhesion molecules through the HEK cell aggregation assay. In this assay, an equal number of HEK cells expressing a desired presynaptic cell adhesion molecule and a fluorescent protein are mixed with HEK cells expressing a post-synaptic cell adhesion molecule and another fluorescent protein. The interaction between the cell adhesion molecules forces the cells to aggregate, which can be...

Cell Aggregation Assay to Detect Trans Interactions between Cell Adhesion Molecules

Het begrip anastasis verwijst naar het fenomeen waarbij stervende cellen in een laat stadium een celdoodproces omkeren, zichzelf repareren en uiteindelijk overleven. Hier demonstreren we protocollen voor het detecteren en volgen van cellen die anastasis ondergaan.

Strategieën voor Tracking Anastasis, A Cell Survival verschijnsel dat apoptose Keert

Anastasis is technisch uitdagende te detecteren in vivo omdat de cellen die de cel dood proces hebben omgekeerd morfologisch niet te onderscheiden van normale gezonde cellen kunnen. Hier beschrijven we protocollen voor het opsporen en volgen van cellen die anastasis in levende dieren ondergaan met behulp van ons nieuw ontwikkelde in vivo CaspaseTracker biosensor systeem.

Opsporen van Anastasis In Vivo door CaspaseTracker Biosensor

We hebben een permeabele microporeuze membraaninzet aangepast om het tumormicro-omgeving (TME) te imiteren. Het model bestaat uit een gemengde celcultuur, maakt een vereenvoudigde generatie van sterk verrijkte individuele celpopulaties mogelijk zonder het gebruik van fluorescente markering of celsortering, en maakt het mogelijk om intercellulaire communicatie binnen het TME te bestuderen onder normale of stressomstandigheden.

Een Mimic van de tumor micro: Een eenvoudige methode voor het genereren van verrijkte celpopulaties en Onderzoeken intercellulaire communicatie

Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol om snel en semiquantitatief ligand-receptor interacties in trans te meten in een heterologe celsysteem met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Transcellulaire interacties meten via eiwitaggregatie in een heterologe celsysteem

Het huidige protocol ontwikkelt een beeldgebaseerde techniek voor snelle, niet-destructieve en labelvrije regionale celdichtheids- en levensvatbaarheidsmeting binnen 3D-tumoraggregaten. Bevindingen onthulden een celdichtheidsgradiënt, met hogere celdichtheden in kerngebieden dan buitenste lagen in ontwikkelende aggregaten en overwegend perifere celdood in HER2 + aggregaten behandeld met Trastuzumab.

Niet-destructieve evaluatie van regionale celdichtheid binnen tumoraggregaten na medicamenteuze behandeling

Hier presenteren we een methode om verbindingen te identificeren die het ADCC-mechanisme moduleren, een belangrijk kankerceldodend mechanisme van antitumorantilichamen. Het cytotoxische effect van NK-cellen wordt gemeten in sferoïden van borstkankercellen in aanwezigheid van Trastuzumab. Beeldanalyse identificeert levende en dode killer- en doelcellen in sferoïden.

Kwantificering van antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit in een tumorsferoïde model: aanvraag voor ontdekking van geneesmiddelen

Leer hoe je hypoxische signalering volgt in PEG-gekapselde cellaggregaten met fluorescentiemicroscopie. Deze methode maakt seriële monitoring van hypoxie-induceerbare factoractiviteit mogelijk.

Tracking Hypoxische Signalering binnen Encapsulated Cell Aggregaten

Meer video's verkennen