Name: Modeling and Imaging 3-Dimensionale Collectief Cell Invasion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Leer hoe je 3D-matrixinvasieassays opzet voor kankeronderzoek met behulp van Matrigel en confocale microscopie. Deze methode biedt kwantitatieve en kwalitatieve inzichten in tumorcelinvasie die traditionele 2D-assays niet kunnen leveren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De financiering voor dit onderzoek is van Cancer Research Verenigd Koninkrijk.

1. Retrovirale labeling van cellen met fluorescente eiwitten <ol><li> Plaat retrovirale verpakking cellen (bv. Phoenix) uit op 0,25 x 10 6 cellen per putje van een 6-well schotel in 10% foetaal bovine serum (FBS) / DMEM. </li><li> Transfecteren cellen met retrovirale DNA 48 uur later cellen met behulp van Effectene volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Spoel twee keer putten later met medium 24 uur, voeg vervolgens 1,5 ml van 10% FBS / DMEM per well. </li><li> Verzamel verpakt virus in weefselkweek medium 48 uur later door pipetteren en het overdragen tot en met 2 mL microcentrifugebuizen. </li><li> Centrifugeer bij 1600 rpm gedurende 5 minuten tot pellet alle cellen. </li><li> Verwijder supernatant een schoon buisje en bewaar bij -80 ° C. </li><li> Cellen retrovirally worden getransduceerd worden uitgeplaat op 1,5 x 10 5 cellen per putje van een 6 goed schotel en geplaatst in een bevochtigde incubator bij 37 ° C gedurende de nacht. </li><li> De volgende dag, verwijder de media uit de cellen en ad-d 1 ml van het virus voorraad aangevuld met 4 ul polybreen (2 mg / ml) aan elk putje. Vervang de platen in de broedstoof. </li><li> Na incubatie gedurende 5-6 uur, voeg 2 ml 10% FBS / DMEM aan elk putje en platen worden vervangen in de 37 ° C inbubator 's nachts. </li><li> De volgende dag, vervang dan de media en laat cellen 24 uur voor het toevoegen van geschikte selectieve media. </li><li> Bij de samenvloeiing (die afhankelijk is van de groei van de cellen, en efficiëntie van de retrovirale transductie, maar meestal neemt van 4-14 dagen), cellen en sorteren trypsinize voor fluorescentie met behulp van niet-getransduceerde cellen als een referentie, te verzamelen en zwembad cellen met fluorescentie groter is dan de niet-getransduceerde cellen en vries porties bij -80 ° C voor toekomstig gebruik. </li></ol> 2. Inverse Matrigel invasie assay <ol><li> Langzaam ontdooien een portie van volledige Matrigel (dwz met groeifactoren) op ijs (Figuur 1A). </li><li> Eenmaal ontdooid, verdunnen Matrigel 01:01 in ijskoud PBS (samen met eventuele andere extrabehandelingen op 2x concentratie in het PBS voorafgaand aan verdunning; figuur 1B). Om het makkelijker te hanteren Matrigel voor polymerisatie, alle plasticware (bv tips, buizen, enz.) moeten ijskoud worden. </li><li> Steek zoveel 8 micron porie 6,5 ongecoat mm diameter Transwells zoals vereist in de putjes van een 24 goed weefselkweek plaat, dan voorzichtig pipet 100 ul van de verdunde Matrigel in de putten en laat het gedurende ~ 30 minuten incuberen bij 37 ° C te stollen (Figuur 1C). </li><li> Gedurende deze tijd, bereiden een of meer fluorescent gelabelde celsuspensies tussen 1 en 4 x 10 5 cellen per ml, afhankelijk van de cellijn, van elk voorbehandeld voorwaarde (g e.. SiRNA, behandeling met geneesmiddelen) in hun normale groei medium (figuur 1D). </li><li> Wanneer de Matrigel gestold is, draai de Transwells en pipet 100 pi van de celsuspensie op het naar boven gericht zijn onderkant van de filter (figuur 1E). </li><li> Voorzichtig dekking van de Transwells met de basis van een 24 goed tissuecultuur plaat, contact maken met elke druppel celsuspensie (Figuur 1F). </li><li> Incubeer de plaat in de omgekeerde toestand voor 4 uur mogelijk te maken celhechting (figuur 1G). </li><li> Naar aanleiding van deze tijd, draai de platen rechts-side-up en was iedere Transwell door opeenvolgende dompelen in 2 x 1 ml serum vrij medium (figuur 2A). </li><li> Laat de Transwells in een derde goed in met alle medicijnen of behandelingen vereist (figuur 2B). </li><li> Voorzichtig 100 ul van 10% FBS / DMEM plus chemoattractant pipet (e. g. EFG op 25 ng / ml) in de Transwell op de top van de gestolde Matrigel / PBS mengsel, vervang het deksel en incubeer gedurende 3-5 dagen bij 37 ° C met 5% CO 2 (figuur 2C). </li></ol> 3. Vlekken en visualisatie <ol><li> Cellen die fluorescerende eiwitten kunnen overslaan de onderstaande stappen voorafgaand aan de confocale microscopie </li><li> Om het beeld niet-fluorescerende cellen binnen te vallen Matrigel, plaats Transwells in verse 24 goed gerechten en pipet 1 ml van 4 uMCalceïne AM vlek oplossing op de top van elke Matrigel plug, waardoor het overtollige water over de zijkanten en van de boven-en onderkant vlek. Calceïne AM (acetoxymethyl ester van calceïne) is een levende cellen kleurstof die vlekken het hele cellen groen en vereist geen fixatie. </li><li> Incubeer 1 uur bij 37 ° C in 5% CO 2 vochtige atmosfeer, op welk moment cellen zijn volledig gekleurd en klaar om te worden afgebeeld door de confocale microscopie. </li><li> Als alternatief kunnen niet-fluorescerende cellen binnen te vallen Matrigel worden gefixeerd en gekleurd zoals hieronder beschreven in +3,5 tot +3,9. </li><li> Breng elke Transwell om een ​​nieuwe 24-well plaat. Overlay 1 ml van 4% para-formaldehyde/0.2% Triton-X 100. </li><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 0,5 uur. </li><li> Verwijder fixatief en was 3 keer met 1 ml PBS. </li><li> Verwijder cytoplasmatisch RNA met 30 min RNase behandeling met behulp van 100 ug / ml RNase. Was twee keer met PBS. </li><li> Voor visualisatie toe te voegen 0,01 mg / ml propidiumjodide (PI) verdund in PBS en laat bij kamertemperatuur in de dark voor 0,5 uur. Was drie keer met PBS. In dit stadium, PI-lood transwell kunnen worden bewaard bij kamertemperatuur in het donker gedurende ten minste 1 maand. </li><li> Nauwkeurige beeldvormende technieken door confocale microscopie zijn afhankelijk van de beschikbare middelen. Met behulp van een omgekeerde confocale microscoop, plaats Transwell met een kleine hoeveelheid van de resterende PBS op groot dekglaasje (Controleer of er geen luchtbellen aanwezig zijn) ten opzichte van niet-immersie 20 X doelstelling en vastleggen optische secties om de 10-15 urn van de bodem van de Matrigel stekker. Afzonderlijke optische schijven kunnen worden gebruikt om de mate van invasie (figuur 3A) kwantificeren of te bouwen in 3-dimensionale objecten met behulp van geschikte software zoals Volocity (Figuur 3B). </li></ol> 4. Representatieve resultaten Een voorbeeld van een Z-serie van optische schijfjes is weergegeven in figuur 3A. In dit geval werden de cellen gekleurd met Calceïne AM en het aantal cellen uit de filter binnenvallende is te zien dat af met de afstand. Kwantificering van de invasion kan worden gedaan door analyse van de verhouding van Calceïne AM positieve pixels naar negatief pixels bij elk interval, of door gebruik te maken van de fixatie / kleuringsmethode hierboven beschreven en het tellen van PI positieve kernen op elke positie. Een voordeel van Calceïne AM kleuring is dat de drie-dimensionale reconstructies van celinvasie kunnen worden geassembleerd met behulp van software zoals Volocity, het geven van een visuele voorstelling van de wijze van invasie (Figuur 3B). Als cellen worden gelabeld door expressie van fluorescerende eiwitten, dan is de positie van elke kleur cel kan gevisualiseerd worden in 3-dimensionale reconstructies, zowel bekeken van de zijkant (Figuur 3C) of door het maken van plakjes door de reconstructie (Figuur 3D). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3525/3525fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Schematische weergave van de stappen die betrokken zijn bij het ​​opzetten van omgekeerde invasie test. A) Matrigel ECM ontdooide op ijs. B) Matrigel wordt verdund 1:1 met PBS dat elke behandeling met geneesmiddelen op twee keer een eindconcentratie. C) Transwell inserts worden geplaatst in multiwell platen, en Matrigel gepipetteerd in elk. D) celsuspensies gemaakt op de gewenste concentratie. E) Als de Matrigel heeft ingesteld, de plaat is omgekeerd en verwijderd, worden de cellen uitgeplaat op de onderkant filter van de Transwell inserts. F) In de omgekeerde positie, is de meerwandige plaat voorzichtig geplaatst over Transwell inserts, contact maken met de celsuspensie. G) De cellen mogen zich te houden aan het filter voor 4 uur. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3525/3525fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Voortzetting van het schema voor de inverse invasie test. A) Als cellen hebben gehandeld, duik iedere Transwell in serum-vrij medium tweemaal op losse cellen te verwijderen. B) Plaats gewassen Transwell in een definitieve goed bevattende media plus behandelingen nodig. C) Media met chemoattractant (bijv. 10% foetaal bovine serum) met behandelingen zoals vereist wordt zorgvuldig gelaagd op Matrigel. ENT "&gt; <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3525/3525fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Representatieve beelden van de resultaten van inverse invasie assay. A) Optische delen van cellen gekleurd met Calceïne AM binnenvallende Matrigel, genomen op 15 um periodiek door confocale microscopie. B) Reconstructie van een 3-dimensionale reconstructie van cel invasie van een stapel van confocale Z-serie beelden, gezien vanaf de zijkant. Overgenomen uit referentie 10. C) Drie-dimensionale reconstructie van GFP en RFP-gelabelde cellen binnenvallen Matrigel gezien vanaf de zijkant. D) Optische slice door de 3-dimensionale reconstructie van GFP en RFP-gemerkte cellen. Overgenomen uit referentie 10.

<ol><li>Olson, M. F., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin+cytoskeleton+in+cancer+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">The actin cytoskeleton in cancer cell motility.</a> Clin. Exp. Metastasis. 26, 273-287 (2008).</li>
<li>Hoelzinger, D. B., Demuth, T., Berens, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine+factors+that+sustain+glioma+invasion+and+paracrine+biology+in+the+brain+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer.+Inst%22%5BJournal%5D)">Autocrine factors that sustain glioma invasion and paracrine biology in the brain microenvironment.</a> J. Natl. Cancer. Inst. 99, 1583-1593 (2007).</li>
<li>Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perspective+on+cancer+cell+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A perspective on cancer cell metastasis.</a> Science. 331, 1559-1564 (2011).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hallmarks+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Hallmarks of Cancer.</a> Cell. 100, 57-70 (2000).</li>
<li>Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+advanced+spontaneous+metastasis+for+experimental+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics.</a> Nat. Rev. Cancer. 11, 135-141 (2011).</li>
<li>Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+migration+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Tumor cell migration in three dimensions.</a> Methods. Enzymol. 406, 625-643 (2006).</li>
<li>Croft, D. R., Olson, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulating+the+conversion+between+rounded+and+elongated+modes+of+cancer+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulating the conversion between rounded and elongated modes of cancer cell movement.</a> Cancer Cell. 14, 349-351 (2008).</li>
<li>Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-step+pericellular+proteolysis+controls+the+transition+from+individual+to+collective+cancer+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion.</a> Nat. Cell. Biol. 9, 893-904 (2007).</li>
<li>Hennigan, R. F., Hawker, K. L., Ozanne, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fos-transformation+activates+genes+associated+with+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Fos-transformation activates genes associated with invasion.</a> Oncogene. 9, 3591-3600 (1994).</li>
<li>Scott, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIM+kinases+are+required+for+invasive+path+generation+by+tumor+and+tumor-associated+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">LIM kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells.</a> J. Cell. Biol. 191, 169-185 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Matrigel invasie assays zijn van oudsher opgezet met cellen geplaatst op een laag van extracellulaire matrix eiwit met chemoattractant geïnduceerde beweeglijkheid naar en door een filter aan de onderkant. Invasiviteit werd gescoord als een functie van het aantal cellen kunnen worden geteld aan de onderkant van het filter. Hoewel praktisch is er weinig verschil met de &quot;inverse&quot; invasie assay hierboven beschreven, is er aanzienlijk meer informatie over het proces van invasie die kan worden bepaald door het visua...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het reagens </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th></tr><tr><td> DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium) </td><td> GIBCO </td><td> 21969 </td></tr><tr><td> Foetaal Bovine Serum </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td></tr><tr><td> Penicilline Streptomycine </td><td> GIBCO </td><td> 15140 </td></tr><tr><td> 200 mM L-Glutamine (100x) </td><td> GIBCO </td><td> 25050-032 </td></tr><tr><td> Puromycine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8833 </td></tr><tr><td> 0,05% Trypsine EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 25300 </td></tr><tr><td> Polybreen </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> AL-118 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> 11668019 </td></tr><tr><td> 6.5mm Transwells, 8,0 urn poriegrootte </td><td> Corning </td><td> 3422 </td></tr><tr><td> Compleet Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 354234 </td></tr> &lt;tr&gt; <td> Calceïne AM </td><td> Invitrogen </td><td> C1430 </td></tr><tr><td> RNase </td><td> Qiagen </td><td> 19101 </td></tr><tr><td> Propidiumjodide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4864 </td></tr><tr><td> Confocale microcope </td><td> Leica </td><td> SP2MP </td></tr></tbody></table>

modeling and imaging 3-dimensionale collectief cell invasion

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

Een kenmerkende eigenschap van kanker maligniteit is invasie en metastase 1. In sommige kankers (e. g. Glioma 2), locale invasie in het omringende gezonde weefsel is de oorzaak van ziekte en dood. Voor andere vormen van kanker (e. g. Borstkanker, longkanker, enz..), Het is het proces van metastase, waarbij tumorcellen zich van een primaire tumor massa, koloniseren distale sites en uiteindelijk bij te dragen tot orgaanfalen, dat leidt uiteindelijk tot morbiditeit en sterfte 3. Er wordt geschat dat de invasie en metastasen zijn verantwoordelijk voor 90% van de sterfgevallen door kanker 4. Als gevolg hiervan, is er intense belangstelling voor het identificeren van de moleculaire processen en kritische eiwit bemiddelaars van invasie en metastasering ten behoeve van verbetering van de diagnose en de behandeling 5. Een uitdaging voor kanker wetenschappers is het ontwikkelen van invasie assays die voldoende lijken op de in vivo situatieom nauwkeurige ziekte modelleren 6 mogelijk te maken. Twee-dimensionale celbeweeglijkheid tests zijn louter informatief over een aspect van invasie en geen rekening houden met de extracellulaire matrix (ECM) eiwit remodeling, die ook is een cruciaal element. Onlangs heeft onderzoek verfijnd ons begrip van tumorcel invasie en toonde aan dat individuele cellen kunnen verplaatsen door lange of bolvormige modes 7. Daarnaast is er een grotere waardering van de bijdrage van collectieve invasie, waarbij de cellen binnen te dringen in strengen, lakens en clusters, met name in zeer gedifferentieerde tumoren die te behouden epitheliale kenmerken, om de verspreiding van kanker 8. We presenteren een verfijnde methode 9 voor de behandeling van de bijdragen van kandidaat-eiwitten op collectieve invasie 10. In het bijzonder, door engineering aparte zwembaden van cellen om verschillende fluorescerende eiwitten te drukken, is het mogelijk om moleculair ontleden de activiteiten en proteins nodig in het leiden van cellen ten opzichte van die welke vereist zijn in de volgende cellen. Het gebruik van RNAi biedt de moleculaire tool om experimenteel te demonteren de processen die betrokken zijn bij individuele cel invasie alsook in verschillende posities van de collectieve invasie. In deze procedure, mengsels van fluorescent gelabelde cellen worden uitgeplaat op de bodem van een Transwell insert eerder gevuld met Matrigel ECM-eiwit, daarna liet men het &quot;omhoog&quot; binnen te dringen door het filter en in de Matrigel. Reconstructie van z-series image stacks, verkregen door confocale beeldvorming, in drie-dimensionale representaties zorgt voor visualisatie van collectief invasie strengen en de analyse van de representatie van de fluorescent gelabelde cellen in toonaangevende versus volgende posities.

Modellen van de tumorcel invasie in drie-dimensionale extracellulaire matrix beter aansluiten bij de<em&gt; In vivo</em&gt; Situatie dan twee-dimensionale beweeglijkheid testen. Met behulp van matrix invasie assays in combinatie met confocale beeldvorming van fluorescent gelabelde cellen, gedetailleerde informatie over de invasie modi en de verschillende bijdragen van toonaangevende versus volgende cellen kunnen worden verkregen.

Modeling and Imaging 3-Dimensionale Collectief Cell Invasion

Een bepalend kenmerk van kanker-maligniteit is invasie en metastase 1. Bij sommige vormen van kanker (bijv. glioom 2) vindt lokale invasie plaats in het omliggende gezonde ...

Dit experimentele systeem is bedoeld om de bijdrage van specifieke eiwitten aan het invasieproces te karakteriseren. Begin met de retrovirale transductie van cellen met het fluorescerende eiwit van belang. Maak daarnaast de 3D-matrix van matrigel-eiwit in transwell-inserts en bereid een celsuspensie voor in de juiste verdunning.Gebruik het Matrigel-transwell-systeem om de transmigratie-respons op het chemoattractant met testgeneesmiddelen of behandelingen te meten, en ga vervolgens over tot het visualiseren en analyseren van de celinvasie via confocale microscopie. Uiteindelijk kunnen de resultaten de omvang en de wijze van celinvasie in een driedimensionale eiwitmatrix bepalen. De kracht van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de traditionele Transwell-invasieassay, is het vermogen om zowel kwantitatieve als kwalitatieve gegevens te verkrijgen over de celinvasie in een driedimensionale eiwitmatrix.Mijn collega, Diane Creighton, zal nu de methode demonstreren: kweek retrovirale packagingcellen in DMEM met 10% FBS gedurende 48 uur. Transfecteer de cellen met retroviraal DNA volgens de instructies van de fabrikant. Incubeer gedurende 24 uur, spoel de wells twee keer met medium, voeg vervolgens 1,5 milliliters van 10% FBS-DMEM per well toe en incubeer gedurende 48 uur om het gepackagete retrovirus te verzamelen.Breng het weefselkweekmedium over naar microcentrifugebuisjes van twee milliliter, centrifugeer om eventuele cellen te pelletteren en oogst het supernatant in een schone buis. Bewaar deze retrovirusvoorraad bij min 80 graden Celsius. Om cellen nu retro-transduceert, wordt het medium uit een overnight-kweek verwijderd en één milliliter van de retrovirusvoorraad, aangevuld met polygreen, toegevoegd.Voeg na een incubatie van zes uur twee milliliter 10%F-B-S-D-M-E-M toe aan de well en plaats de platen in een incubator van 37 °C. Vernieuw de media gedurende de nacht en voeg na 24 uur het juiste selectieve medium toe; oogst de cellen zodra ze confluent zijn en sorteer ze op fluorescentie met niet-getransduceerde cellen als referentie. Verzamel de cellen met een fluorescentie die hoger is dan die van de niet-getransduceerde cellen en vries aliquots in bij -80 °C voor toekomstig gebruik.Deze methode is gebaseerd op de expressie van fluorescerende eiwitten voor visualisatie en maakt het mogelijk om inzicht te verkrijgen in de bijdragen van individuele cellen. Ontdooi complete Matrigel op ijs en verdun dit vervolgens één-op-één in ijskoud PBS. Plaats nu de ongecoate transwells in een 24-wells weefselkweekplaat.Pipetteer vervolgens voorzichtig 100 µL verdunde matri gel in de wells en laat dit stollen bij 37 °C. Bereid ondertussen de fluorescentielabelled cel-suspensies voor in hun normale groeimedium. Wanneer de matri gel is gestold, keren we de transwells om en pipetteert men 100 µL van de celsuspensie op de onderkant van het filter, aan de zijde die naar de output is gericht.Dek de transwells zorgvuldig af met de bodem van een 24-wells tissuekweekplaat, waarbij contact wordt gemaakt met elke druppel cellesuspensie. Incubeer de plaat in omgekeerde positie gedurende vier uur om celadhesie mogelijk te maken. Zet de platen vervolgens rechtop en was elke transwell door deze tweemaal in één milliliter serumvrij medium te dopen.Plaats vervolgens de transwell in een derde put die welke geneesmiddelen of behandelingsreagentia bevat. Pipetteer voorzichtig 100 µL medium met chemoattractant in de transwell, bovenop het gestolde matrigel-PBS-mengsel. Incubeer drie tot vijf dagen bij 37 °C met 5% CO2 om niet-fluorescerende cellen te visualiseren die het Matrigel binnendringen.Plaats de transwells in schone 24-wells platen en pipetteer 1 mL van een 4 µM calcium AM-oplossing bovenop elke Matrigel-plug, zodat de vloeistof over de zijkanten stroomt en zowel van boven als van onderen kleurt. Incubeer gedurende een uur bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2. Beeldvorm daarna via confocale microscopie.Deze eerste kleuringsmethode voor levensstijl maakt het mogelijk om invasiemodi te visualiseren. Overbreng elke transwell naar een nieuwe 24-wells plaat, voeg één milliliter 4% paraformaldehyde en 0,2% triton X 100 toe en incubeer gedurende een half uur bij kamertemperatuur. Na drie keer wassen met één milliliter PBS wordt RNAse A gedurende 30 minuten toegevoegd, gevolgd door twee keer wassen met PBS voor visualisatie bij 0,01 milligram per milliliter.Verdun propidiumjodide in PBS en laat dit 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker staan. Was drie keer met PBS. In dit stadium kunnen de transwells met propidiumjodide-kleuring gedurende ten minste één maand bij kamertemperatuur in het donker worden bewaard.De tweede celkleuringsmethode vereist fixatie, maar maakt een snellere kwantificering van de invasie mogelijk. Plaats de transwell met een kleine hoeveelheid resterende PBS op een grote dekglasplaat onder een geïnverteerde confocale microscoop met een niet-immersie 20x objectief en leg optische secties vast om de 10 tot 15 micron vanaf de onderkant van de matrigel-plug. Kwantificeer de mate van invasie met behulp van individuele optische plakjes. Constructeer daarnaast driedimensionale objecten met behulp van geschikte software, zoals Velocity, op basis van deze serie optische plakjes. De cellen werden gekleurd met calcium am.Zoals verwacht neemt het aantal cellen dat vanuit het filter naar boven invadeert af naarmate de afstand toeneemt. Deze invasie kan gekwantificeerd worden. Driedimensionale reconstructies van de celinvasie bieden een visuele weergave van de wijze van invasie.Als cellen zijn gelabeld door de expressie van fluorescerende eiwitten, dan kunnen de posities van elke gekleurde cel worden gevisualiseerd in driedimensionale reconstructies, zoals getoond in dit zijaanzicht. Daarnaast kunnen doorsneden door de reconstructie inzicht bieden in moleculaire mechanismen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u deze celinvasie-assay kunt gebruiken om meer informatie over het invasieproces te verkrijgen dan met de standaardmethoden mogelijk is.

modeling-and-imaging-3-dimensional-collective-cell-invasion

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Interstitiële vloeistof stroom wordt verhoogd in solide tumoren en kan moduleren tumorcel invasie. Hier beschrijven een techniek interstitiële fluïdumstroming toepassing cellen ingebed in een matrix en meet de gevolgen celinvasie. Deze techniek kan gemakkelijk worden aangepast aan andere te bestuderen.

Drie-dimensionale Cultuur van de Cel Model voor het meten van de effecten van het interstitiële vocht Flow op tumorcel invasie

Source: Guyon, J., et al. A 3D Spheroid Model for Glioblastoma. J. Vis. Exp. (2020)The video demonstrates the generation of a three-dimensional spheroid model of tumor cell invasion. Spheroids are formed from human brain tumor cells and embedded in a collagen matrix. The tumor cells at the spheroid periphery adopt an invasive phenotype, secreting proteases to degrade the collagen and advancing to invade the surrounding matrix.

Generation of a Three-Dimensional Spheroid Model of Tumor Cell Invasion

Dit artikel behandelt een methode om fluorescerend label collageen dat verder kan worden gebruikt voor zowel vaste en levende beeldvorming van 3D celculturen. Wij bieden ook een geoptimaliseerd protocol om endogene cytoskeleteiwitten van cellen gekweekt in 3D-omgevingen te visualiseren.

Het openbaren van de organisatie van het cytoskelet van invasieve kankercellen in 3D

Dit artikel geeft gedetailleerde methodologieën voor het gebruik van driedimensionale (3D) assays om borstkanker cel invasie kwantificeren. Concreet bespreken we het nodig om dergelijke assays procedures, kwantificering en gegevensanalyse, alsook werkwijzen voor het verlies van membraan integriteit die ontstaat wanneer cellen binnendringen onderzoeken.

Kwantificering van de Breast Cancer Cell Invasiviteit met een drie-dimensionale (3D) Model

Deze methode evalueert de invasie van kankercellen uit sferoïden in een omringende 3D-matrix.  Sferoïden worden gegenereerd via de hanging drop-kweekmethode en vervolgens ingebed in een matrix bestaande uit basement membraanmaterialen en type I collageen.  Invasie uit de sferoïden wordt vervolgens gemonitord.

Een Cancer Cell Sferoïde Assay om Invasion beoordelen in een 3D-instelling

Dit protocol beschrijft een omgekeerde verticale invasie-bepaling die kan worden gebruikt om het kwantificeren van de mogelijkheden voor migratie en invasie van cellen in een driedimensionale omgeving met behoud van de cel-communicatie. Deze test is geschikt voor zeldzame en/of gevoelige cellen.

Verplaatsen naar boven: Een eenvoudig en flexibel In Vitro driedimensionale invasie Assay Protocol

De processen die blaas kanker invasie vertegenwoordigen mogelijkheden voor biomerker en therapeutische ontwikkeling. Hier presenteren we een blaas kanker invasie model waarin 3D-cultuur tumor spheroïden, time-lapse beeldvorming en confocale microscopie. Deze techniek is handig voor het definiëren van de kenmerken van de invasieve proces en voor het screenen van therapeutische agenten.

3D-celcultuur voor het bestuderen van de invasie en evalueren van Therapeutics in blaaskanker

Het huidige protocol beschrijft een geïntegreerde methode onderzoek naar kanker cel migratie en invasie op één platform in real-time, het verstrekken van een gemakkelijk reproduceerbaar zijn en tijd-efficiënte optie te bestuderen van de cel mobiliteit en morfologie.

Een eenvoudige migratie/invasie Workflow met behulp van een geautomatiseerde Live-cel Imager

Tumor microenvironment is een essentieel onderdeel van kankergroei en invasie. Om kanker progressie na te bootsen, is een biologisch relevante menselijke matrix nodig. Dit protocol introduceert een verbetering voor de drie-dimensionale sferoïde invasie assay in vitro door het toepassen van een menselijke leiomyoma-gebaseerde matrix. Het protocol introduceert ook een computer-based cel invasie analyse.

Volledig menselijke tumor-gebaseerde matrijs in driedimensionele sferoïde invasie assay

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de fabricage van een sferoïde beeldvormingsapparaat. Dit apparaat maakt dynamische of longitudinale fluorescentiebeeldvorming van kankercelsferoïden mogelijk. Het protocol biedt ook een eenvoudige beeldverwerkingsprocedure voor de analyse van kankercelinvasie.

Time-Resolved Fluorescentie Beeldvorming en analyse van kankercelinvasie in het 3D Spheroid Model

Invasie is een belangrijk biologisch fenomeen bij de ontwikkeling en progressie van kanker. Dit proces wordt beïnvloed door niet-neoplastische cellen en componenten van de micro-omgeving van de tumor. Het doel van deze studie is het beschrijven van een alternatieve methode voor het analyseren van tumorcelinvasie in vitro met behulp van driedimensionale (3D) culturen.

Alternatieve strategie om in vitro celinvasie van 3D-culturen te analyseren

Leer hoe je 3D-matrixinvasieassays opzet voor kankeronderzoek met behulp van Matrigel en confocale microscopie. Deze methode biedt kwantitatieve en kwalitatieve inzichten in tumorcelinvasie die traditionele 2D-assays niet kunnen leveren.

Modeling and Imaging 3-Dimensionale Collectief Cell Invasion

Meer video's verkennen