Modeling and Imaging 3-Dimensionale Collectief Cell Invasion

Dit experimentele systeem is bedoeld om de bijdrage van specifieke eiwitten aan het invasieproces te karakteriseren. Begin met de retrovirale transductie van cellen met het fluorescerende eiwit van belang. Maak daarnaast de 3D-matrix van matrigel-eiwit in transwell-inserts en bereid een celsuspensie voor in de juiste verdunning.

Gebruik het Matrigel-transwell-systeem om de transmigratie-respons op het chemoattractant met testgeneesmiddelen of behandelingen te meten, en ga vervolgens over tot het visualiseren en analyseren van de celinvasie via confocale microscopie. Uiteindelijk kunnen de resultaten de omvang en de wijze van celinvasie in een driedimensionale eiwitmatrix bepalen. De kracht van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de traditionele Transwell-invasieassay, is het vermogen om zowel kwantitatieve als kwalitatieve gegevens te verkrijgen over de celinvasie in een driedimensionale eiwitmatrix.

Mijn collega, Diane Creighton, zal nu de methode demonstreren: kweek retrovirale packagingcellen in DMEM met 10% FBS gedurende 48 uur. Transfecteer de cellen met retroviraal DNA volgens de instructies van de fabrikant. Incubeer gedurende 24 uur, spoel de wells twee keer met medium, voeg vervolgens 1,5 milliliters van 10% FBS-DMEM per well toe en incubeer gedurende 48 uur om het gepackagete retrovirus te verzamelen.

Breng het weefselkweekmedium over naar microcentrifugebuisjes van twee milliliter, centrifugeer om eventuele cellen te pelletteren en oogst het supernatant in een schone buis. Bewaar deze retrovirusvoorraad bij min 80 graden Celsius. Om cellen nu retro-transduceert, wordt het medium uit een overnight-kweek verwijderd en één milliliter van de retrovirusvoorraad, aangevuld met polygreen, toegevoegd.

Voeg na een incubatie van zes uur twee milliliter 10%F-B-S-D-M-E-M toe aan de well en plaats de platen in een incubator van 37 °C. Vernieuw de media gedurende de nacht en voeg na 24 uur het juiste selectieve medium toe; oogst de cellen zodra ze confluent zijn en sorteer ze op fluorescentie met niet-getransduceerde cellen als referentie. Verzamel de cellen met een fluorescentie die hoger is dan die van de niet-getransduceerde cellen en vries aliquots in bij -80 °C voor toekomstig gebruik.

Deze methode is gebaseerd op de expressie van fluorescerende eiwitten voor visualisatie en maakt het mogelijk om inzicht te verkrijgen in de bijdragen van individuele cellen. Ontdooi complete Matrigel op ijs en verdun dit vervolgens één-op-één in ijskoud PBS. Plaats nu de ongecoate transwells in een 24-wells weefselkweekplaat.

Pipetteer vervolgens voorzichtig 100 µL verdunde matri gel in de wells en laat dit stollen bij 37 °C. Bereid ondertussen de fluorescentielabelled cel-suspensies voor in hun normale groeimedium. Wanneer de matri gel is gestold, keren we de transwells om en pipetteert men 100 µL van de celsuspensie op de onderkant van het filter, aan de zijde die naar de output is gericht.

Dek de transwells zorgvuldig af met de bodem van een 24-wells tissuekweekplaat, waarbij contact wordt gemaakt met elke druppel cellesuspensie. Incubeer de plaat in omgekeerde positie gedurende vier uur om celadhesie mogelijk te maken. Zet de platen vervolgens rechtop en was elke transwell door deze tweemaal in één milliliter serumvrij medium te dopen.

Plaats vervolgens de transwell in een derde put die welke geneesmiddelen of behandelingsreagentia bevat. Pipetteer voorzichtig 100 µL medium met chemoattractant in de transwell, bovenop het gestolde matrigel-PBS-mengsel. Incubeer drie tot vijf dagen bij 37 °C met 5% CO2 om niet-fluorescerende cellen te visualiseren die het Matrigel binnendringen.

Plaats de transwells in schone 24-wells platen en pipetteer 1 mL van een 4 µM calcium AM-oplossing bovenop elke Matrigel-plug, zodat de vloeistof over de zijkanten stroomt en zowel van boven als van onderen kleurt. Incubeer gedurende een uur bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2. Beeldvorm daarna via confocale microscopie.

Deze eerste kleuringsmethode voor levensstijl maakt het mogelijk om invasiemodi te visualiseren. Overbreng elke transwell naar een nieuwe 24-wells plaat, voeg één milliliter 4% paraformaldehyde en 0,2% triton X 100 toe en incubeer gedurende een half uur bij kamertemperatuur. Na drie keer wassen met één milliliter PBS wordt RNAse A gedurende 30 minuten toegevoegd, gevolgd door twee keer wassen met PBS voor visualisatie bij 0,01 milligram per milliliter.

Verdun propidiumjodide in PBS en laat dit 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker staan. Was drie keer met PBS. In dit stadium kunnen de transwells met propidiumjodide-kleuring gedurende ten minste één maand bij kamertemperatuur in het donker worden bewaard.

De tweede celkleuringsmethode vereist fixatie, maar maakt een snellere kwantificering van de invasie mogelijk. Plaats de transwell met een kleine hoeveelheid resterende PBS op een grote dekglasplaat onder een geïnverteerde confocale microscoop met een niet-immersie 20x objectief en leg optische secties vast om de 10 tot 15 micron vanaf de onderkant van de matrigel-plug. Kwantificeer de mate van invasie met behulp van individuele optische plakjes. Constructeer daarnaast driedimensionale objecten met behulp van geschikte software, zoals Velocity, op basis van deze serie optische plakjes. De cellen werden gekleurd met calcium am.

Zoals verwacht neemt het aantal cellen dat vanuit het filter naar boven invadeert af naarmate de afstand toeneemt. Deze invasie kan gekwantificeerd worden. Driedimensionale reconstructies van de celinvasie bieden een visuele weergave van de wijze van invasie.

Als cellen zijn gelabeld door de expressie van fluorescerende eiwitten, dan kunnen de posities van elke gekleurde cel worden gevisualiseerd in driedimensionale reconstructies, zoals getoond in dit zijaanzicht. Daarnaast kunnen doorsneden door de reconstructie inzicht bieden in moleculaire mechanismen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u deze celinvasie-assay kunt gebruiken om meer informatie over het invasieproces te verkrijgen dan met de standaardmethoden mogelijk is.