Name: Skeletspieren Geslacht dimorfisme van Proteomics (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Leer hoe je geslachtsspecifieke proteoomprofielen in skeletspier analyseert met tweedimensionale gelelektroforese en massaspectrometrie. Deze methode identificeert ongeveer 800 eiwitspots uit 10 mg weefsel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Yutian Gan voor het gebruik van figuur 3. Dit werk werd ondersteund door National Science Foundation 0420971, het Smith College Blakeslee, Wilens en Holmes fondsen, en de Howard Hughes Medical Institute.

1. Monstervoorbereiding <ol><li> Gebruik verse, bevroren of flash-RNAlater behandelde weefsel van muizen als uitgangsmateriaal. Blot weg overtollige conserveermiddel met een Kimwipe voordat u verder gaat. </li><li> Verwijder alle pezen en fascia rond de spier en gehakt van het weefsel met enkele scherpe scheermesjes voor 2 min op gekoeld glas platen in een koude kamer (4 ° C) totdat het weefsel is goed gehakt of poedervormige. Verzamel het monster in een vooraf gewogen microfugebuis en bepalen het gewicht van het weefsel. Gebruik niet meer dan 10 mg van het weefsel als uitgangsmateriaal. </li><li> Voeg 45 ul extractiebuffer (8 M ureum, 50 mM DTT, 4% CHAPS, 0,2% drager amfolyten 5 / 8, 0,0002% broomfenolblauw) per 1 mg gehakt weefsel, bij kamertemperatuur. Als het volume groter is dan 350 pL, 350 pL in eerste instantie toe te voegen en gehomogeniseerd (stap 1.4), voeg dan de rest van de buffer om spatten te minimaliseren. </li><li> Homogeniseren het weefsel zeven keer met een gemotoriseerde stamper (Kontes Corp) gedurende 15 seconden bij4 ° C, met twee minuten afkoelen op ijs tussen elke homogenisering. </li><li> Centrifugeer de monsters bij 15.600 xg gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Bewaar het supernatant en meet het volume. De cel puin pellet wordt weggegooid. </li><li> Neerslaan van de eiwitten in het supernatant met ijskoude reagens-grade aceton (3 keer v: v-verhouding). Vortex de buizen gedurende 15 seconden. Centrifuge voor 15.600 xg gedurende 10 seconden tot pellets vormen, en resuspendeer in extractie-buffer met de Kontes motor en polypropyleen roerstaafjes (BioSpec Prod) </li><li> Herhaal stap 1.6. </li><li> Ofwel door te gaan met eiwitconcentratie schatting van de monsters of bewaar ze bij -20 ° C. </li></ol> 2. Eiwitconcentratie schatting Gebruik maken van de Lowry assay 7 of de BCA assay 8 (Pierce), streven naar ongeveer 4,5 mg ml -1. 3. Iso-elektrische focussering <ol><li> Verwijder een ReadyStrip IPG strip (11 cm, pH 5-8, Bio-Rad)van -20 ° C en laat het bij kamertemperatuur equilibreren voor 10-15 minuten. </li><li> Vortex het monster en pipet 600-800 microgram (totaal volume 200 pi) eiwit monster in een rechte lijn aan de achterkant van een kanaal in de steekproef rehydratie lade, waardoor ongeveer 1 cm aan elke kant. </li><li> Met behulp van een tang, trek het plastic deksel van de IPG strip - zorg ervoor dat alleen de uiteinden van de strip handvat en elk contact met de gel te voorkomen. Let op de basic einde van de strip en plaats deze aan de linkerkant van de lade. Plaats de IPG strip gel-kant naar beneden op de top van het monster, te voorkomen vangen bubbels eronder. Laat het hydrateren voor een uur. </li><li> Overlay met 2,5 ml minerale olie (BioRad). Bedek de lade met het deksel, en laat een nacht hydrateren bij kamertemperatuur. </li><li> Plaats een papieren lont aan beide uiteinden van de focus lade kanaal en nat elk met 10 pi Millipore water. </li><li> Haal IPG strip en houd verticaal gedurende ongeveer 10 seconden de afvoer van de olie. Blot de plastic backing met een Kimwipe. </li><li> Plaats de IPG strip gel naar beneden en met basis einde aan de links in de aandacht geplaatst. Bedek de strip met 2,5 mL minerale olie. </li><li> Plaats de lade in de proteïsche IEF cel (Bio-Rad) en het programma een drie-stappen-protocol (tabel 1) bij gebreke cel temperatuur van 20 ° C, een maximale stroom van 50 uA / strip, en geen rehydratatie tijd. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Spanning </td><td> Tijd </td><td> Volt-Hrs </td><td> Helling </td></tr><tr><td> Stap 1 </td><td> 250 </td><td> 20 min </td><td></td><td> Lineair </td></tr><tr><td> Stap 2 </td><td> 8000 </td><td> 2,5 uur </td><td></td><td> Lineair </td></tr><tr><td> Stap 3 </td><td> 8000 </td><td></td><td> 40000 </td><td> Snel </td></tr><tr><td> Totaal </td><td></td><td> 6,5 uur </td><td> 40000 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 1. Drie-stappen-protocol van Protean IEF cel voor 11 cm IPG strips. </li><li> Neem de IPG-strips uit de IEF cel met behulp van een tang. Blot de kunststof achterplaat met een Kimwipe en plaats de IPG strip gel kant naar boven in een schone rehydratatie lade. U kunt de dekking van de rehydratatie lade en wikkel het af met plasticfolie en bewaar bij - 80 ° C of door te gaan. </li></ol> 4. SDS-polyacrylamide gel elektroforese <ol><li> Breng de strip (gel kant naar boven) in een 11 cm equilibratie lade. </li><li> Voeg 4 mL van vermindering buffer (6 M ureum, 2% SDS, 0,05 M Tris / HCl pH 8,8, 20% glycerol, 2% DTT) om het kanaal en equilibreren de strip gedurende 10 minuten met milde schudden. </li><li> Verwijder de vermindering buffer, voeg 4 mL van alkylering buffer (6 M ureum, 2% SDS, 0,05 M Tris / HCl pH 8,8, 20% glycerol, 2,5% joodacetamide) en equilibreren de strip gedurende 10 minuten met milde schudden. </li><li> Spoel de IPG strip door dompelen de strip kort in 1 X SDS lopen buffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 0,1% SDS, pH 8,2). </li><li> Leg de strip gel kant naar boven op de achterplaat van de 11 cm Criterium pre-cast 10,5% -14% Tris-HCl SDS-polyacrylamide gel (Bio-Rad) en voorzichtig in, zodat duw dat zij volledig op contact met de SDS gel maakt; zorg ervoor dat er geen luchtbellen gevangen zitten tussen de twee gel oppervlakken. </li><li> Overlay van de IPG strip met 1 ml van gesmolten agarose-oplossing (0,5% agarose, 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0,1% SDS, broomfenolblauw) en laat de agarose stollen gedurende 5 minuten. </li><li> Belasting 5 pi van eiwit marker 10-225 kDa (USB, P / N: 76740) in de bedrijfstoeslagregeling en moleculair gewicht normen. </li><li> Voer de gel in SDS buffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 0,1% SDS, pH 8,2) bij 200 V bij kamertemperatuur of in een koude ruimte (4 ° C) met de broomfenol blauwe kleurstof voor migratie naar de elektroforese monitor. </li><li> Haal de gel uit de plastic cast en vlekken 's nachts door schudden zachtjes in Coomassie Brilliant BlueR-250 vlek (45,5% methanol, 45,5% dH2O, 9,0% azijnzuur, 0,25% Coomassie Brilliant Blue R-250). </li><li> Schud de gel in Destain een oplossing (45,5% methanol, 45,5% dH 2 O, 9,0% azijnzuur) twee keer voor elk 3 uur en in Destain 2 (5% methanol, 90% dH 2 O, 5% azijnzuur) 's nachts. Bewaar de gel in 7% azijnzuur voor analyse. </li></ol> 5. Gel beeldvorming en analyse <ol><li> Maak foto's van de gels met behulp van de hoeveelheid een software programma dat het VersaDoc imaging-systeem (BioRad) werkt. Gelijkmatig de afbeelding bijsnijden gebieden voor alle gels in uw experiment. </li><li> Laad de bijgesneden beelden op de PDQuest 8.0-software-programma om een ​​experiment te creëren. Volg het Experiment Setup Wizard om de parameters voor spot detectie en spot matching over de gels te definiëren. Inspecteer en verfijnen ter plaatse overeenkomende resultaten handmatig indien nodig. </li><li> Uit te voeren kwantitatieve en statistische analyse van de gels aan aangepast eiwit plekken te detecteren met two-voudige of hoger statistisch significante verschillen in expressie tussen de twee gel groepen. Maak een analyse van deze plekken van belang en knip ze uit met behulp van een EXQuest plek snijder (BioRad) voor trypsine spijsvertering en LC-MS-eiwitten identificatie. </li></ol> 6. In-gel tryptische spijsvertering Voor deze stap een aangepaste Pierce In-Gel Tryptische Digest Kit (# 89871X, Pierce) protocol wordt gebruikt. <ol><li> Voeg 200 ul van ontkleuroplossing (25 mM ammoniumbicarbonaat, 50% acetonitril) om de gel pluggen. Vortex en incubeer de monsters bij 37 ° C gedurende 30 minuten met schudden. Verwijder voorzichtig en gooi de oplossing. </li><li> Herhaal stap 6.1. </li><li> Voeg 30 ul van vers bereide verminderen buffer (50 mM Tris [2-carboxyethyl] fosfine, 22,5 mM ammonium bicarbonaat) aan de buizen die de gel stekkers en incubeer bij 60 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Laat monsters afkoelen en verwijder en gooi het verminderen van buffer.</li><li> Voeg 30 ul van alkylering buffer (100 mM joodacetamide, 20 mM ammoniumbicarbonaat, onmiddellijk bereid door vóór gebruik in folie gewikkelde buizen. Incubeer de monsters in het donker bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. </li><li> Verwijder de alkylering buffer. Was de gel pluggen door het toevoegen van 200 pi van ontkleuroplossing aan elke buis. Incubeer de monsters bij 37 ° C gedurende 15 minuten. </li><li> Verwijder de ontkleuroplossing en herhaal de wassen. </li><li> Voeg 50 ul van acetonitril om de gel te pluggen en incubeer ze gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om hen in staat te krimpen drogen, verwijder dan zorgvuldig de acetonitril. </li><li> Herhaal stap 6.8 nog een keer. Gel stukken moeten kijken wit en klein. </li><li> Laat gel stukken te drogen in een Centrivap Concentrator (Labconco, Model EX1245) voor 10 minuten. </li><li> Swell de gel stukken door het toevoegen van 10 pi van geactiveerde trypsine oplossing (10 ng / ul trypsine, 25 mM ammonium bicarbonaat). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. </li><li> Voeg 25 ul spijsvertering-buffer (25 mM ammoniumbicarbonaat) aan de buizen. Incubeer de monsters overnacht bij kamertemperatuur onder schudden. </li><li> Sonificeer de monsters gedurende 10 minuten (Branson, bad ultrasoonapparaat model 2510) en spin ze neer voor het verwijderen van het supernatant naar een nieuwe buis. Sla het supernatant. </li><li> Om verder te extraheren peptiden, voeg 10 pi van 0,1% mierenzuur en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur onder schudden. Sonificeer de monsters gedurende 10 minuten, verzamel de bovenstaande vloeistof en combineren met opgeslagen supernatant in stap 6.13. </li></ol> 7. Microschaal ontzouten van peptide extracten <ol><li> Verwijder ammoniumbicarbonaat en andere zouten in het peptide extracten met de hulp van PepClean C-18 Spin Columns (ThermoFisher) volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Elueer peptiden tweemaal met 20 pi 70% acetonitril, verdampen de monsters droog door centrifugeren in de Centrivap Concentrator voor 1 uur en resuspendeerde peptiden in 10 pi 0,1% mierenzuur voor MS-analyse. </li></ol> 8. Eiwit identificatie met behulp van HPLC-gekoppelde massaspectrometrie <ol><li> Afzonderlijke 5 pi van het peptide mengsel op een high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) meer dan 40 minuten, met behulp van een lineaire 20-50% acetonitril verloop met 0,2% mierenzuur op een Pepswift monolithische PS-DVB-kolom (Dionex) gekoppeld aan een nanospray I bron op een ion trap massaspectrometer (LCQ Deca XP Max, Thermo Fisher Scientific) bij een debiet van 400 nL / min aan het uiteinde. </li><li> Detecteren peptide MS1 signalen tussen 400 - 1400 m / z en laat voor de drie meest intense ion pieken worden geïsoleerd voor MS2 sequentiebepaling door CID met dynamische uitsluiting. </li><li> Voor eiwit identificatie, het analyseren van de resultaten via een peptide Sequest muis referentie-database zoeken (BioWorks software, Thermo Fisher Scientific-) met een statische gealkyleerde cysteïne modificatie en dynamische wijzigingen voor de fosforylering (serine, threonine, tyrosine), methylaVerordening (histidine), oxidatie (methionine), ADP-ribosylering (arginine), en N-terminale acetylering. Van toepassing zijn conservatieve matching criteria (bv., peptide tolerantie ingesteld op 2 AMU en 1,00 fragment tolerantie, eiwitten bevatten tenminste twee peptiden het passeren van een Xcorr vs Charge Staat filter [z = 1 / x = 1,5, z = 2 / x = 2.00, z = 3 / x = 2.50, z = 4 / x = 3.00] en een kans van p &lt;0,05) 5 en handmatig controleren van de MS-spectra voor vertrouwen eiwit identificatie. </li></ol> 9. Representatieve resultaten: Mannelijke en vrouwelijke niet-uitgeoefende, was murine skeletspieren (biceps brachii) geëxtraheerd en gescheiden in een twee-dimensionale kaart 5, het eerste niveau van de spier vergelijkende proteoom (figuur 2). Zodra gevisualiseerd met behulp van hoge-resolutie digitale imaging; ongeveer 800 eiwitten plekken werden gedetecteerd in elk. Met behulp van de mannelijke proteoom kaart als een baseline, is het duidelijk dat er tal van plekken die in overvloed verandering in de vrouwelijke proteoom. De plek intensiteiten zijn maatregelen van de verandering in het eiwit bedragen (figuur 3). De identiteit van het eiwit plekken die verandering meer dan twee-voudige (omhoog of omlaag) en zijn statistisch significant (p &lt;0,05) met een n = 5 muizen, worden bepaald door aminozuur sequentie analyse met behulp van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie gekoppeld. Deze resultaten tonen aan dat vrouwen een overvloed afname van suiker energie-metabolisme enzymen en in creatine kinase (CK) isovormen, een ander systeem voor energievoorziening in de spieren aan te tonen. Zowel mensen als dieren weer meer voor bij mannen serum CK-spiegels in rust en na de uitoefening 9,10, maar serum CK-waarden niet noodzakelijk correleren met het bedrag van de myofibrillar verstoring 11,12. Dit geslacht dimorfisme in de cellulaire overvloed van CK in muriene biceps brachii spier is een nieuw finding5 en kan antwoord geven op de fysiologisch serum CK verschillende niveaus. Cijfers: g1.jpg "/&gt; Figuur 1. Een algemeen schema van het protocol voor vergelijkende proteomics. Het protocol is onderverdeeld in drie groepen: de monstervoorbereiding, monsteranalyse en, eiwit identificatie. De uiteinden van elk van deze drie groepen van de protocollen zijn ook redelijk pauzeren plaatsen, hoewel de beste resultaten worden vergaard als de totale protocol wordt uitgevoerd zonder te stoppen. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3536/3536fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Vergelijking van de vrouwelijke muizen biceps brachii eiwit plekken ten opzichte van de identieke plekken in mannelijke biceps brachii (groene cirkels o). Spots dat een toename van groter dan of gelijk aan twee keer bij vrouwen zijn omcirkeld rood (o) en degenen die minder dan of gelijk aan twee-maal verlaagde zijn omcirkeld blauw (o). <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3536/3536fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3 Gel Spot Intensiteit Analyse:. X-as, vrouwelijkepre-oefening (controle, n = 5), Y-as, vrouwelijke single bout 0 uur tijdstip groep (n = 5). Regressielijn: correlatiecoëfficiënt = 0,919; helling = 0,976; onderscheppen = -0,0293. Spots boven de rode lijn en onder de blauwe lijn te veranderen meer dan + / - twee-voudige.

<ol><li>Fehrenbach, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFehrenbach%2C+E+%22Molecular+and+Cellular+Exercise+Physiology%22">Molecular and Cellular Exercise Physiology</a>. Mooren, F. C., Völker, K. , Human Kinetics. New York. 199-217 (2005).</li>
<li>Mooren, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Exercise+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Cell.</a> Molecular and Cellular Exercise Physiology. Mooren, F. C., Völker, K. , Human Kinetics. New York. 3-18 (2005).</li>
<li>Thompson, H. S., Clarkson, P. M., Scordilis, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+repeated+bout+effect+and+heat+shock+proteins%3A+intra-muscular+HSP27+and+HSP70+expression+following+two+bouts+of+eccentric+exercise+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Physiol.+Scand%22%5BJournal%5D)">The repeated bout effect and heat shock proteins: intra-muscular HSP27 and HSP70 expression following two bouts of eccentric exercise in humans.</a> Acta. Physiol. Scand. 174, 47-56 (2002).</li>
<li>McHugh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+understanding+of+the+repeated+bout+effect%3A+the+protective+effect+against+muscle+damage+from+a+single+bout+of+eccentric+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Med.+Sci.+Sports%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the understanding of the repeated bout effect: the protective effect against muscle damage from a single bout of eccentric exercise.</a> Scand. J. Med. Sci. Sports. 13, 88-97 (2003).</li>
<li>Metskas, L. A., Kulp, M., Scordilis, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+Dimorphism+in+the+Exercise-Na%C3%AFve+Murine+Skeletal+Muscle+Proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Molec.+Biol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Gender Dimorphism in the Exercise-Naïve Murine Skeletal Muscle Proteome.</a> Cell Molec. Biol. Lett. 15, 507-516 (2010).</li>
<li>Lopez, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+electrophoresis+in+proteome+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional electrophoresis in proteome expression analysis.</a> J. Chromatogr. B. 849, 190-202 (2007).</li>
<li>Lowry, O. H., Rosenburg, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951).</li>
<li>Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, M. D., Fujimoto, E. K., Goeke, N. M., Olson, B. J., Klenk, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Protein+Using+Bicinchoninic+Acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Norton, J. P., Clarkson, P. M., Graves, J. E., Litchfield, P. L., Kirwan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+creatine+kinase+activity+and+body+composition+in+males+and+females%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Biol%22%5BJournal%5D)">Serum creatine kinase activity and body composition in males and females.</a> Hum. Biol. 57, 591-598 (1985).</li>
<li>Amelink, G. J., Kamp, H. H., Bär, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creatine+kinase+isoenzyme+profiles+after+exercise+in+the+rat%3A+sex-linked+differences+in+leakage+of+CK-MM%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers.+Arch%22%5BJournal%5D)">Creatine kinase isoenzyme profiles after exercise in the rat: sex-linked differences in leakage of CK-MM.</a> Pflügers. Arch. 412, 417-421 (1988).</li>
<li>Kendall, B., Eston, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-induced+muscle+damage+and+the+potential+protective+role+of+estrogen%5BTitle%5D)+AND+%22Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Exercise-induced muscle damage and the potential protective role of estrogen.</a> Sports Med. 32 (2), 103-123 (2002).</li>
<li>Tiidus, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+oestrogen+influence+skeletal+muscle+damage%2C+inflammation%2C+and+repair%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Can oestrogen influence skeletal muscle damage, inflammation, and repair?</a> Br. J. Sports Med. 39, 251-253 (2005).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De LC / MS methode proteomics hier wordt gepresenteerd is een zeer betrouwbare en reproduceerbare protocol voor een snelle analyse van het eerste niveau van de skeletspieren proteoom. Het zorgt voor een redelijk doelmatige vergelijking van geslacht specificiteit. Lage abundantie eiwitten zou een fractionering van de spier monster om zo veel van de contractiele eiwitten als mogelijk te verwijderen, waardoor de lage abundantie eiwitten. Het afstemmen van de proteoom profiel kan worden bereikt met verschillende pH-waarde IPG-strips en de plaatsvervangende stijgingspercentage gels indien gewenst. Meer gevoelige fluorescerende vlekken bestaan, maar wij raden dat elk laboratorium de lineariteit van deze vlekken in uw systeem te bepalen. Voor een meer grondige analyse van eiwitexpressie de DIGE systeem (twee-dimensionale In-gel-elektroforese-systeem, GE Healthcare Life Sciences) kunnen gebruikt worden, maar dit is toe te voegen een niveau van complexiteit om de methodologie. Verder kan het protocol hierin beschreven worden gebruikt met de meeste animal weefsels waarvoor een genoom is gesequenced, evenals de novo sequencing van een eiwit van elke bron, zo lang als het kan worden opgelost op een twee-dimensionale gel, omdat overlappende enzymatische fragmenten kunnen worden gegenereerd met behulp van een hoge zuiverheid enzymen in aanvulling naar trypsine. Monsters van ander weefsel bronnen kan enige wijzigingen in de winning methodologie, zeker als op zoek naar membraan en hydrofobe eiwitten, echter, hebben we goede resultaten met dit protocol met hart-, lever-, nier-en hersenweefsel. Andere post-translationele modificaties kunnen worden gedetecteerd door aanpassing van de massa-spectrum-database zoekcriteria. In totaal hebben we ons een redelijk gedetailleerde initiële protocol voor proteomics analyse.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het reagens </th><th> Type </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> PepClean C-18 Spin Columns </td><td> Verbruiksartikelen </td><td> ThermoFisher Wetenschappelijk </td><td> PI-89870 </td><td></td></tr><tr><td> Pepswift monolithische kolom (100um x 5 cm) </td><td> Verbruiksartikelen </td><td> Dionex </td><td> 162348 </td><td></td></tr><tr><td> Criterium pre-cast 10,5% -14% Tris-HCl SDS polyacrylamidegels </td><td> Verbruiksartikelen </td><td> BioRad </td><td> 345-0106 </td><td></td></tr><tr><td> Readystrip IPG-strips </td><td> Verbruiksartikelen </td><td> BioRad </td><td> Verschillende pH varieert </td><td></td></tr><tr><td> Azijnzuur </td><td> Reagens </td><td> Fisher Scientific </td><td> A465-1 </td><td></td></tr><tr><td> Aceton </td><td> Reagens </td><td> Pharmco </td><td> 329000 </td><td></td></tr><tr><td> Acetonitril </td><td> Reagens </td><td> Fisher Scientific </td><td> A955 </td><td></td></tr><tr><td> Eengarose </td><td> Reagens </td><td> BioRad </td><td> 163-2111 </td><td> Bedekking oplossing </td></tr><tr><td> Ammoniumbicarbonaat </td><td> Reagens </td><td> Fluka </td><td> 40867 </td><td></td></tr><tr><td> Broomfenolblauw </td><td> Reagens </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP114 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Lyte amfolyten </td><td> Reagens </td><td> BioRad </td><td></td><td> Verschillende pH varieert </td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> Reagens </td><td> USB </td><td> 13361 </td><td></td></tr><tr><td> Commassie blauw R-250 </td><td> Reagens </td><td> ThermoFisher Wetenschappelijk </td><td> 20278 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) </td><td> Reagens </td><td> USB </td><td> 15395 </td><td></td></tr><tr><td> Mierenzuur </td><td> Reagens </td><td> ThermoFisher Wetenschappelijk </td><td> 28905 </td><td></td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Reagens </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G6279 </td><td></td></tr><tr><td> Glycine </td><td> Reagens </td><td> USB </td><td> 16407 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Joodacetamide </td><td> Reagens </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6125 </td><td></td></tr><tr><td> Methanol </td><td> Reagens </td><td> Fisher Scientific </td><td> A452 </td><td></td></tr><tr><td> Minerale olie </td><td> Reagens </td><td> BioRad </td><td> 163-2129 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfaat </td><td> Reagens </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L6026 </td><td></td></tr><tr><td> Tris basis </td><td> Reagens </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 93349 </td><td></td></tr><tr><td> Tris [2-carboexyethyl] fosfine </td><td> Reagens </td><td> ThermoFisher Wetenschappelijk </td><td> 77720 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine endoproteïnase, TPCK behandeld, MS kwaliteit </td><td> Reagens </td><td> Doorboren </td><td> 90055 </td><td> gewijzigd </td></tr><tr><td> Ureum </td><td> Reagens </td><td> USB </td><td> 75826 </td><td></td></tr><tr><td> Water </td><td> Reagens </td><td> Burdick &amp; Jackson </td><td> 365 </td><td></td></tr><tr><td> Centrivap Concentrator </td><td> TOOL </td><td> Labconco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Exquest spot snijder </td><td> Gereedschap </td><td> BioRad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LCQ Deca XP Max ion trap massaspectrometer </td><td> Gereedschap </td><td> ThermoFisher Wetenschappelijk </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gemotoriseerde stamper </td><td> Gereedschap </td><td> Kontes Corp </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Polypropyleen roeren </td><td> Gereedschap </td><td> BioSpec Prod </td><td></td><td></td></tr><tr><td> staven </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Protean IEF cel </td><td> Gereedschap </td><td> BioRad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ultrasoonapparaat </td><td> Gereedschap </td><td> Branson </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Surveyor Plus HPLC systeem </td><td> Gereedschap </td><td> ThermoFisher Wetenschappelijk </td><td></td><td></td></tr><tr><td> VersaDoc imaging systeem </td><td> Gereedschap </td><td> BioRad </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

skeletspieren geslacht dimorfisme van proteomics

Skeletal Muscle Gender Dimorphism from Proteomics

Bruto krimp in de skeletspier wordt vooral bepaald door een relatief klein aantal contractiele eiwitten, maar dit weefsel is ook opmerkelijk aan te passen aan omgevingsfactoren, zoals een hypertrofie door de weerstand uit te oefenen en atrofie door onbruik. Het daarbij vertoont verbouwing en aanpassingen aan stressoren (warmte, ischemie, zware metalen, enz..) 2,3. Schade kan optreden aan de spieren door een spier kracht uit te oefenen, terwijl verlenging, de zogenaamde excentrische contractie 4. De contractiele eiwitten kunnen worden beschadigd in zulke inspanningen en moeten worden gerepareerd, afgebroken en / of resynthesized; deze functies maken geen deel uit van de contractiele eiwitten, maar van de andere veel minder overvloedig eiwitten in de cel. Om te bepalen welke subset van eiwitten is betrokken bij de verbetering van dit soort schade, moet een mondiale proteoom voorafgaand worden opgericht om 5 uit te oefenen en daarna volgde naar aanleiding van de oefening om het differentieel te bepaleneiwitexpressie en daardoor benadrukken de kandidaat-eiwitten in de aanpassingen aan de schade en de reparatie. Verder hebben de meeste studies van de skeletspieren verricht naar het mannetje van de soort en daarom wellicht niet representatief voor vrouwelijke spieren. In dit artikel presenteren we een methode voor de extractie van eiwitten reproduceerbaar uit mannelijke en vrouwelijke spieren, en gescheiden door twee-dimensionale gel elektroforese gevolgd door een hoge resolutie digitale imaging 6. Dit zorgt voor een protocol voor plekken (en vervolgens geïdentificeerde eiwitten), die aantonen dat een statistisch significant (p &lt;0,05) twee-voudige verhoging of verlaging, verschijnen of verdwijnen van de controle staat. Deze worden vervolgens uitgesneden, gedigereerd met trypsine en gescheiden door een hoge-druk vloeistofchromatografie gekoppeld aan een massaspectrometer (LC / MS) voor identificatie van eiwitten (LC / MS / MS) 5. Deze methodologie (Figuur 1) kan gebruikt worden op een groot aantal weefsels met weinig tot geen modificatie (lever, hersenen, hoort etc.).

Een straight-forward set van methoden te isoleren en bepalen de identiteit van de meest voorkomende eiwitten die worden uitgedrukt in de skeletspieren. Ongeveer 800 plekken zijn onderscheiden op een twee-dimensionale gel van 10 mg spieren, dit maakt voor de bepaling van gender-specifieke eiwitexpressie. Deze methoden geven gelijkwaardige resultaten in de meeste weefsels.

Skeletspieren Geslacht dimorfisme van Proteomics

De globale contractie in skeletspierweefsel wordt primair bepaald door een relatief klein aantal contractiele eiwitten, maar dit weefsel is tevens opmerkelijk ...

Het algemene doel van deze procedure is om de genderspecifiteit van verschillen in de proteoomprofielen van skeletspieren te bepalen. Dit wordt bereikt door eerst biceps brachyi-oogweefsels van mannelijke en vrouwelijke muizen te versnipperen en grondig te homogeniseren om de meeste eiwitten te extraheren. Vervolgens wordt het monster op een IEF-gelstrip aangebracht, waarbij eiwitten worden gescheiden op basis van hun isoelektrisch punt, gevolgd door een SDS-PAGE voor scheiding in de tweede dimensie op basis van grootte. Na het kleuren en afbeelden van de gels worden de proteoomprofielen van de mannelijke en vrouwelijke spiermonsters vergeleken en worden spots met significante verschillen in abundantie tussen de twee genders uitgesneden.Ten slotte worden de eiwitten in de gelplugs verteerd met trypsine. De resulterende peptiden worden uit de gel geëxtraheerd en onderworpen aan nano vloeistofchromatografie en massaspectrometrie-analyse voor identificatie. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een differentiële expressie van eiwitten in twee of meer experimentele condities aantonen via tweedimensionale gelelektroforese en proteomics op basis van massaspectrometrie.Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de geslachts-specifieke eigenschappen van spieren, kan ze ook worden toegepast op andere cellen, weefsels, organen of vloeistoffen in verschillende fysiologische toestanden. De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Kalina Diva, technisch directeur van het Smith College Center for Proteomics. Na het isoleren, reinigen en fijnsnijden van skeletspierweefsel van muis met 45 µL extractiebuffer per gram weefsel (raadpleeg het schriftelijke protocol voor dit en alle andere bufferrecepten), homogeniseer het weefsel zeven keer gedurende telkens 15 seconden bij 4 °C met een gemotoriseerde stamper, met tussen elke homogenisatie twee minuten koeling op ijs.Centrifugeer de monsters bij 15.800 Gs gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Bewaar het supernatant en meet het volume. Verwijder de pellet om de eiwitten te precipiteren met drie volumes ijs.Koude aceton van reagenskwaliteit per volume supernatant. Vortex de buisjes 15 seconden en centrifugeer vervolgens bij 15.800 Gs gedurende 10 seconden om pellets te vormen. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellets en extractiebuffer met de gemotoriseerde stamper en polypropyleen roerstaafjes; precipiteer de eiwitten een tweede maal door drie extra volumes aceton toe te voegen.Bepaal na het resuspenderen van het pellet in extractiebuffer de proteïneconcentratie en/of bewaar de monsters bij -20 °C. Om isoelektrische focussering van de proteïnen uit te voeren, haal je een kant-en-klare IPG-strip uit de vriezer van -20 °C en laat je deze 10 tot 15 minuten acclimatiseren bij kamertemperatuur. Vortex het monster en pipetteer 600 tot 800 µg proteïne in een rechte lijn langs de achterrand van een kanaal in de monsterrehydratatieschaal, waarbij aan beide uiteinden ongeveer één centimeter vrij blijft.Verwijder met een pincet de plastic folie van de IPG-strip, waarbij u er op let dat u alleen de uiteinden van de strip aanraakt en elk contact met de gel vermijdt. Noteer welk uiteinde van de strip als positief is gemarkeerd en positioneer dit aan de linkerzijde van de tray. Plaats de IPG-strip met de gelzijde naar beneden op het monster.Voorkom dat er luchtbellen onderaan vast komen te zitten. Laat het één uur rehydrateren. Bedek de strip met 2,5 milliliters minerale olie.Dek de tray af met een deksel en laat deze een nacht rehydrateren. Plaats de volgende dag bij kamertemperatuur een papieren lont aan beide uiteinden van het focuskanaal van de tray en bevochtig deze elk met 10 µL millipore-water. Verwijder de IPG-strip en houd deze ongeveer 10 seconden verticaal.Dep de plastic achterkant met een Kim wipe om de olie te verwijderen. Plaats de IPG-strip met de gelzijde naar beneden en het basisuiteinde naar links. Bedek de strip in de focusbak met 2,5 milliliters minerale olie.Plaats de tray in de protean IEF-cel en programmeer een protocol van drie stappen bij een standaardceltemperatuur van 20 °C, een maximale stroomsterkte van 50 µA per strip en zonder rehydratatietijd. Nadat het programma is voltooid, brengt u de strip met de gelzijde naar boven over naar een equilibratietray van 11 cm. Voeg vier ml reductiebuffer toe aan het kanaal en equilibreer de strip gedurende 10 minuten met voorzichtig schudden.Verwijder de reductiebuffer, voeg vier milliliter alkylatiebuffer toe aan het kanaal en laat de strip nog 10 minuten equilibreren onder schudden. Spoel de IPG-strip door deze kort in één XSDS-runbuffer te dippen. Leg de strip vervolgens met de gelzijde naar boven op de achterplaat van een criterion van 11 centimeter.Giet een 10,5 tot 14% tris H-C-L-S-D-S polyacrylamidegel voor en druk deze voorzichtig aan zodat er volledig contact is met de SDS-gel. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen tussen de twee geloppervlakken gevangen zitten. Bedek de IPG-strip met één milliliter gesmolten agarose-oplossing en laat dit vijf minuten stollen.Laad vervolgens vijf µL proteïnemarker in de enkele put. Laat de gel lopen in SDS-buffer bij 200 volt bij kamertemperatuur, of bij vier °C. Wanneer het kleurfront de onderkant van de gel bereikt, verwijder deze dan uit de plastic mal en kleur deze gedurende de nacht door de gel voorzichtig te schudden in Coomassie Brilliant Blue.Schud de gel twee keer gedurende drie uur in ontkleuringsoplossing één en daarna overnight in ontkleuringsoplossing twee. Bewaar de gel in 7% azijnzuur voor analyse. Na het beeldvormen van de gel wordt een vergelijkende analyse van de vlekkenpatronen tussen de gels uitgevoerd en worden de vlekken van belang uitgesneden. Voeg 200 µL ontkleuringsoplossing toe aan de gelpluggen, vortex deze en incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur onder schudding.Verwijder vervolgens voorzichtig de oplossing, gooi deze weg en herhaal dit proces. Voeg 30 µL vers bereide reducerende buffer toe aan de buisjes met de gelpluggen en incubeer deze 10 minuten bij 60 °C. Laat de monsters afkoelen.Verwijder vervolgens de buffer en gooi deze weg. Voeg 30 µL Alkylation buffer toe en incubeer de monsters een uur lang in het donker bij kamertemperatuur. Verwijder de alkylatiebuffer en gooi deze weg. Was de gelplugs door 200 µL ontkleuringsoplossing aan elke buis toe te voegen en incubeer de monsters 15 minuten bij 37 °C.Verwijder en gooi de denatureeroplossing weg en herhaal de wasstap. Voeg vervolgens 50 µL acetonitril toe aan de gelplugs en laat deze 10 minuten bij kamertemperatuur incuberen zodat ze kunnen indrogen. Verwijder daarna voorzichtig het acetonitril en herhaal de stappen voor de gelstukjes.Deze moeten er wit en klein uitzien. Laat de gelstukjes 10 minuten drogen in een concentrator. Laat de gelstukjes zwellen door 10 µL geactiveerde trypsine-oplossing toe te voegen.Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 25 µL digestiebuffer toe aan de buisjes. Incubeer de monsters gedurende de nacht bij kamertemperatuur onder shaking, soniceer de monsters gedurende 10 minuten en centrifugeer ze kort voordat u het supernatant overbrengt naar een nieuw buisje.Om peptiden verder te extraheren, voegt u 10 µL 0,1% mierenzuur toe aan de plugs en incubeert u deze vijf minuten bij kamertemperatuur onder schudden; sonicate de monsters gedurende 10 minuten. Verzamel het supernatant en voeg dit samen met het eerder bewaarde supernatant. De eiwitten kunnen vervolgens worden ontzout en worden voorbereid voor HPLC-gekoppelde massaspectrometrie; niet-getraind skeletspierweefsel van mannelijke en vrouwelijke proefdieren werd geëxtraheerd en gescheiden in een tweedimensionale kaart.Nadat het eerste niveau van het vergelijkende spierproteoom werd gevisualiseerd met digitale beeldvorming in hoge resolutie, werden er in elk ongeveer 800 eiwitspots gedetecteerd, zoals hier te zien is. Met de proteoomkaart van het mannetje als uitgangspunt is duidelijk dat er talrijke spots zijn waarvan de abundantie verandert in de proteoomspots van het vrouwtje; spots die in vrouwtjes twee keer zoveel of meer toenamen zijn rood omcirkeld, en spots die twee keer zoveel of meer afnamen zijn blauw omcirkeld. De identiteiten van de eiwitspots die meer dan tweevoudig toenamen of afnamen en statistisch significant zijn met een N van vijf muizen, worden bepaald door aminozuursequentieanalyse middels vloeistofchromatografie-gekoppelde massaspectrometrie.In deze grafiek stelt de x-as de vrouwelijke muizen vóór de lichaamsbeweging voor, en de y-as stelt een groep voor op één enkel tijdstip nul uur. De resultaten laten zien dat vrouwelijke muizen een aanzienlijke afname vertonen in het suikerenergiemetabolisme, enzymen en in creatinekinase-enzymisoformen, wat wijst op een ander energievoorzieningssysteem in de spieren. Zowel mensen als dieren vertonen bij rust en na lichaamsbeweging hogere serum-CK-gehaltes bij mannetjes, maar serum-CK-gehaltes correleren niet noodzakelijkerwijs met de hoeveelheid myofibrillen.Dit genderdimorfisme in de cellulaire abundantie van CK in de m. biceps brachii van mieren is een nieuwe ontdekking en kan een verklaring bieden voor de fysiologisch verschillende CK-spiegels in het serum. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals kwantitatieve immunoblots, worden uitgevoerd om de resultaten te verifiëren. Na het bekijken van deze video zouden we een goed begrip moeten hebben van hoe monsters moeten worden voorbereid en gescheiden voor differentiële proteoomprofilering.

skeletal-muscle-gender-dimorphism-from-proteomics

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

De micro-ontleed explantaten techniek is een robuuste en betrouwbare methode voor het isoleren van proliferatieve skeletspieren cellen van jonge, volwassen of embryonale spieren als bron van skeletspieren stamcellen. Uniek, zijn deze cellen zijn klonaal ontleend aan de skeletspieren stamcellijnen gebruikt voor in vivo transplantatie te produceren.

Volwassen en embryonale skeletspier Microexplant Cultuur en isolatie van de skeletspieren Stem Cells

Deze video toont de techniek van percutane spierbiopsie van de menselijke vastus lateralis met behulp van de Weil-Blakesley conchotome.

menselijk<em&gt; Vastus lateralis</em&gt; Skeletal spierbiopsie Met behulp van de Weil-Blakesley Conchotome

MyoD is een myogene transcriptiefactor met een sterk vermogen om myogene transdifferentiatie van vele volledig gedifferentieerde niet-spiercellijnen te induceren. De epigenetische mechanismen die bij deze transdifferentiatie betrokken zijn, zijn grotendeels onbekend. Hier beschrijven we een methode voor dubbele affiniteitszuivering, gevolgd door massaspectrometrie, om MyoD-partners uitputtend te karakteriseren.

Identificatie van MyoD Interactoomanalyse gebruik van Tandem Affinity Purification Gekoppeld aan massaspectrometrie

Hier presenteren we een protocol voor snelle spiervezels analyses, welke verbeterde kleuring kwaliteit en daardoor automatisch ophalen en kwantificering van vezelpopulaties door de vrij beschikbare software ImageJ mogelijk maakt.

Een Rapid Automated Protocol voor Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Dwarsdoorsneden Met behulp van zware keten van myosine Immunohistochemie

Immunohistochemische kleuring van myosin zware ketting isoforms heeft ontpopt als de state-of-the-art-discriminator van skeletale spiervezel-type (d.w.z., typ ik typ IIA, typ IIX, type IIB). Hier presenteren we een kleuring protocol samen met een nieuwe semi-automatische algoritme, dat vergemakkelijkt de snelle beoordeling van de morfologie van het type vezel en vezels.

Semi-geautomatiseerde analyse van muis skeletspieren morfologie en vezel-achtige samenstelling

Drosophila Flight Muscle is een krachtig model om transcriptionele regulering, alternatieve splicing, metabolisme en mechanobiologie te bestuderen. We presenteren een protocol voor dissectie van TL-gelabelde Flight muscle van Live poppen voor het genereren van zeer verrijkte monsters ideaal voor proteomica en Deep-sequencing. Deze monsters kunnen belangrijke mechanistische inzichten bieden in diverse aspecten van spierontwikkeling.

Dissectie van vlucht spieren van Drosophila melanogaster voor omics-benaderingen

Toenemend bewijs geeft aan dat overmatige infiltratie van lipiden in de skeletspieren resulteert in lipotoxiciteit en diabetes. Hier presenteren we een compleet protocol, inclusief weefselverwerking, kleuring met Bodipy, beeldacquisitie en analyse, om de grootte, dichtheid en subcellulaire verdeling van lipidedruppels op een vezeltypespecifieke manier te kwantificeren.

Vezeltype en subcellulair-specifieke analyse van lipidedruppelgehalte in skeletspieren

Drosophila is een gerenommeerd model voor het bestuderen van sleutelmoleculen die myogenese reguleren. De huidige methoden zijn echter onvoldoende om de mRNA-transcriptiedynamiek en ruimtelijke verdeling binnen syncytie te bepalen. Om deze beperking aan te pakken, optimaliseerden we een RNA-fluorescentie in situ hybridisatiemethode die de detectie en kwantificering van mRNA's op een schaal van één molecuul mogelijk maakt.

Studie van spiertranscriptionele dynamica op enkelvoudige molecuulschalen in Drosophila

Dit protocol demonstreert isolatie van één vezel uit gevriesdroogde menselijke skeletspier- en vezeltypeclassificatie volgens Myosin heavy chain (MHC) isovorm met behulp van de dot blotting-techniek. Geïdentificeerde MHC I- en II-vezelmonsters kunnen vervolgens verder worden geanalyseerd op vezeltype-specifieke verschillen in eiwitexpressie met behulp van western blotting.

Vezeltype-identificatie van menselijke skeletspieren

We beschrijven een protocol om enzymatisch gedissocieerde vezels van verschillende lengtes en typen te verkrijgen uit zes spieren van volwassen muizen: drie daarvan zijn al beschreven (flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) en drie van hen zijn voor het eerst met succes gedissocieerd (extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

Intacte korte, tussenliggende en lange skeletspiervezels verkregen door enzymatische dissociatie van zes achterpootspieren van muizen: voorbij flexor digitorum brevis

Dit protocol maakt gebruik van microcomputertomografie om de kosteneffectieve kwantificering van vetvrije massa mogelijk te maken, inclusief skeletspieren en visceraal weefsel, vetweefsel en skeletweefsel bij kleine dieren. Het maakt onderscheid tussen mager en vetweefsel, wat aanzienlijke voordelen biedt voor biomedisch onderzoek, met name bij translationeel onderzoek bij kleine dieren.

Niet-invasieve kwantificering van skeletspieren bij kleine dieren met behulp van microcomputertomografie

Leer hoe je geslachtsspecifieke proteoomprofielen in skeletspier analyseert met tweedimensionale gelelektroforese en massaspectrometrie. Deze methode identificeert ongeveer 800 eiwitspots uit 10 mg weefsel.

Skeletspieren Geslacht dimorfisme van Proteomics

Meer video's verkennen