Skeletspieren Geslacht dimorfisme van Proteomics

Het algemene doel van deze procedure is om de genderspecifiteit van verschillen in de proteoomprofielen van skeletspieren te bepalen. Dit wordt bereikt door eerst biceps brachyi-oogweefsels van mannelijke en vrouwelijke muizen te versnipperen en grondig te homogeniseren om de meeste eiwitten te extraheren. Vervolgens wordt het monster op een IEF-gelstrip aangebracht, waarbij eiwitten worden gescheiden op basis van hun isoelektrisch punt, gevolgd door een SDS-PAGE voor scheiding in de tweede dimensie op basis van grootte. Na het kleuren en afbeelden van de gels worden de proteoomprofielen van de mannelijke en vrouwelijke spiermonsters vergeleken en worden spots met significante verschillen in abundantie tussen de twee genders uitgesneden.

Ten slotte worden de eiwitten in de gelplugs verteerd met trypsine. De resulterende peptiden worden uit de gel geëxtraheerd en onderworpen aan nano vloeistofchromatografie en massaspectrometrie-analyse voor identificatie. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een differentiële expressie van eiwitten in twee of meer experimentele condities aantonen via tweedimensionale gelelektroforese en proteomics op basis van massaspectrometrie.

Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de geslachts-specifieke eigenschappen van spieren, kan ze ook worden toegepast op andere cellen, weefsels, organen of vloeistoffen in verschillende fysiologische toestanden. De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Kalina Diva, technisch directeur van het Smith College Center for Proteomics. Na het isoleren, reinigen en fijnsnijden van skeletspierweefsel van muis met 45 µL extractiebuffer per gram weefsel (raadpleeg het schriftelijke protocol voor dit en alle andere bufferrecepten), homogeniseer het weefsel zeven keer gedurende telkens 15 seconden bij 4 °C met een gemotoriseerde stamper, met tussen elke homogenisatie twee minuten koeling op ijs.

Centrifugeer de monsters bij 15.800 Gs gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Bewaar het supernatant en meet het volume. Verwijder de pellet om de eiwitten te precipiteren met drie volumes ijs.

Koude aceton van reagenskwaliteit per volume supernatant. Vortex de buisjes 15 seconden en centrifugeer vervolgens bij 15.800 Gs gedurende 10 seconden om pellets te vormen. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellets en extractiebuffer met de gemotoriseerde stamper en polypropyleen roerstaafjes; precipiteer de eiwitten een tweede maal door drie extra volumes aceton toe te voegen.

Bepaal na het resuspenderen van het pellet in extractiebuffer de proteïneconcentratie en/of bewaar de monsters bij -20 °C. Om isoelektrische focussering van de proteïnen uit te voeren, haal je een kant-en-klare IPG-strip uit de vriezer van -20 °C en laat je deze 10 tot 15 minuten acclimatiseren bij kamertemperatuur. Vortex het monster en pipetteer 600 tot 800 µg proteïne in een rechte lijn langs de achterrand van een kanaal in de monsterrehydratatieschaal, waarbij aan beide uiteinden ongeveer één centimeter vrij blijft.

Verwijder met een pincet de plastic folie van de IPG-strip, waarbij u er op let dat u alleen de uiteinden van de strip aanraakt en elk contact met de gel vermijdt. Noteer welk uiteinde van de strip als positief is gemarkeerd en positioneer dit aan de linkerzijde van de tray. Plaats de IPG-strip met de gelzijde naar beneden op het monster.

Voorkom dat er luchtbellen onderaan vast komen te zitten. Laat het één uur rehydrateren. Bedek de strip met 2,5 milliliters minerale olie.

Dek de tray af met een deksel en laat deze een nacht rehydrateren. Plaats de volgende dag bij kamertemperatuur een papieren lont aan beide uiteinden van het focuskanaal van de tray en bevochtig deze elk met 10 µL millipore-water. Verwijder de IPG-strip en houd deze ongeveer 10 seconden verticaal.

Dep de plastic achterkant met een Kim wipe om de olie te verwijderen. Plaats de IPG-strip met de gelzijde naar beneden en het basisuiteinde naar links. Bedek de strip in de focusbak met 2,5 milliliters minerale olie.

Plaats de tray in de protean IEF-cel en programmeer een protocol van drie stappen bij een standaardceltemperatuur van 20 °C, een maximale stroomsterkte van 50 µA per strip en zonder rehydratatietijd. Nadat het programma is voltooid, brengt u de strip met de gelzijde naar boven over naar een equilibratietray van 11 cm. Voeg vier ml reductiebuffer toe aan het kanaal en equilibreer de strip gedurende 10 minuten met voorzichtig schudden.

Verwijder de reductiebuffer, voeg vier milliliter alkylatiebuffer toe aan het kanaal en laat de strip nog 10 minuten equilibreren onder schudden. Spoel de IPG-strip door deze kort in één XSDS-runbuffer te dippen. Leg de strip vervolgens met de gelzijde naar boven op de achterplaat van een criterion van 11 centimeter.

Giet een 10,5 tot 14% tris H-C-L-S-D-S polyacrylamidegel voor en druk deze voorzichtig aan zodat er volledig contact is met de SDS-gel. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen tussen de twee geloppervlakken gevangen zitten. Bedek de IPG-strip met één milliliter gesmolten agarose-oplossing en laat dit vijf minuten stollen.

Laad vervolgens vijf µL proteïnemarker in de enkele put. Laat de gel lopen in SDS-buffer bij 200 volt bij kamertemperatuur, of bij vier °C. Wanneer het kleurfront de onderkant van de gel bereikt, verwijder deze dan uit de plastic mal en kleur deze gedurende de nacht door de gel voorzichtig te schudden in Coomassie Brilliant Blue.

Schud de gel twee keer gedurende drie uur in ontkleuringsoplossing één en daarna overnight in ontkleuringsoplossing twee. Bewaar de gel in 7% azijnzuur voor analyse. Na het beeldvormen van de gel wordt een vergelijkende analyse van de vlekkenpatronen tussen de gels uitgevoerd en worden de vlekken van belang uitgesneden. Voeg 200 µL ontkleuringsoplossing toe aan de gelpluggen, vortex deze en incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur onder schudding.

Verwijder vervolgens voorzichtig de oplossing, gooi deze weg en herhaal dit proces. Voeg 30 µL vers bereide reducerende buffer toe aan de buisjes met de gelpluggen en incubeer deze 10 minuten bij 60 °C. Laat de monsters afkoelen.

Verwijder vervolgens de buffer en gooi deze weg. Voeg 30 µL Alkylation buffer toe en incubeer de monsters een uur lang in het donker bij kamertemperatuur. Verwijder de alkylatiebuffer en gooi deze weg. Was de gelplugs door 200 µL ontkleuringsoplossing aan elke buis toe te voegen en incubeer de monsters 15 minuten bij 37 °C.

Verwijder en gooi de denatureeroplossing weg en herhaal de wasstap. Voeg vervolgens 50 µL acetonitril toe aan de gelplugs en laat deze 10 minuten bij kamertemperatuur incuberen zodat ze kunnen indrogen. Verwijder daarna voorzichtig het acetonitril en herhaal de stappen voor de gelstukjes.

Deze moeten er wit en klein uitzien. Laat de gelstukjes 10 minuten drogen in een concentrator. Laat de gelstukjes zwellen door 10 µL geactiveerde trypsine-oplossing toe te voegen.

Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 25 µL digestiebuffer toe aan de buisjes. Incubeer de monsters gedurende de nacht bij kamertemperatuur onder shaking, soniceer de monsters gedurende 10 minuten en centrifugeer ze kort voordat u het supernatant overbrengt naar een nieuw buisje.

Om peptiden verder te extraheren, voegt u 10 µL 0,1% mierenzuur toe aan de plugs en incubeert u deze vijf minuten bij kamertemperatuur onder schudden; sonicate de monsters gedurende 10 minuten. Verzamel het supernatant en voeg dit samen met het eerder bewaarde supernatant. De eiwitten kunnen vervolgens worden ontzout en worden voorbereid voor HPLC-gekoppelde massaspectrometrie; niet-getraind skeletspierweefsel van mannelijke en vrouwelijke proefdieren werd geëxtraheerd en gescheiden in een tweedimensionale kaart.

Nadat het eerste niveau van het vergelijkende spierproteoom werd gevisualiseerd met digitale beeldvorming in hoge resolutie, werden er in elk ongeveer 800 eiwitspots gedetecteerd, zoals hier te zien is. Met de proteoomkaart van het mannetje als uitgangspunt is duidelijk dat er talrijke spots zijn waarvan de abundantie verandert in de proteoomspots van het vrouwtje; spots die in vrouwtjes twee keer zoveel of meer toenamen zijn rood omcirkeld, en spots die twee keer zoveel of meer afnamen zijn blauw omcirkeld. De identiteiten van de eiwitspots die meer dan tweevoudig toenamen of afnamen en statistisch significant zijn met een N van vijf muizen, worden bepaald door aminozuursequentieanalyse middels vloeistofchromatografie-gekoppelde massaspectrometrie.

In deze grafiek stelt de x-as de vrouwelijke muizen vóór de lichaamsbeweging voor, en de y-as stelt een groep voor op één enkel tijdstip nul uur. De resultaten laten zien dat vrouwelijke muizen een aanzienlijke afname vertonen in het suikerenergiemetabolisme, enzymen en in creatinekinase-enzymisoformen, wat wijst op een ander energievoorzieningssysteem in de spieren. Zowel mensen als dieren vertonen bij rust en na lichaamsbeweging hogere serum-CK-gehaltes bij mannetjes, maar serum-CK-gehaltes correleren niet noodzakelijkerwijs met de hoeveelheid myofibrillen.

Dit genderdimorfisme in de cellulaire abundantie van CK in de m. biceps brachii van mieren is een nieuwe ontdekking en kan een verklaring bieden voor de fysiologisch verschillende CK-spiegels in het serum. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals kwantitatieve immunoblots, worden uitgevoerd om de resultaten te verifiëren. Na het bekijken van deze video zouden we een goed begrip moeten hebben van hoe monsters moeten worden voorbereid en gescheiden voor differentiële proteoomprofilering.