Het creëren van Vast Gestabiliseerde Fracturen voor het beoordelen van intramembraneuze ossificatie, Distraction Osteogenesis of genezing van Critical Sized Gebreken

Het algemene doel van deze procedure is het creëren van een extern gefixeerde tibia die kan worden gebruikt voor analyse van gestabiliseerde fractuurgenezingsprocessen, distractie, osteogenese en de genezing van een segmentaal gatdefect. Eerst worden de ringen van de fixateur gepositioneerd en op hun plaats gehouden door steriele insectspelden in het proximale en distale deel van de tibia in te brengen, waarna de ringen aan de steriele insectspelden worden bevestigd. Vervolgens wordt er een fractuur of osteotomie gecreëerd in de middendiafyse van de tibia. In de laatste stap van de procedure wordt de derde schroefdraadstang ingevoegd om de proximale en distale ringen volledig te stabiliseren.

Uiteindelijk kunnen er resultaten worden behaald die mechanismen van fractuurgenezing, distractie, osteogenese en bottransplantatie aantonen via röntgenologische, histologische en moleculaire analyses. De procedure wordt gedemonstreerd door senior onderzoekers Dr. Diane, Y Yuu en postdoctoral fellow Dr. Chelsea Baney van de University of California San Francisco, San Francisco General Hospital, Orthopedic Trauma Institutes laboratory for skeletal regeneration. Begin met het assembleren van het op maat ontworpen externe fixatieapparaat.

De fixatieframes bestaan uit twee aluminium ringen die worden gestabiliseerd door driedraadstangen van roestvrij staal, acht zeshoekige moeren en 17 bijbehorende bouten. Per fractuur zijn twee aluminium ringen nodig; draai voor de proximale ring vier zeshoekige moeren en bijbehorende bouten losjes in de juiste gaten. Draai voor de distale ring opnieuw vier moeren en bouten in zonder deze volledig aan te trekken, plaats vervolgens twee van de lange draadstangen die de fixateur stabiliseren in de gaten op 12 en 6 uur van de distale ring, en bevestig deze met twee zeshoekige moeren.

Anestheseer een muis van de gewenste leeftijd en geslacht via een intraperitoneale injectie van ketamine en xylazine. Bevestig de volledige anesthesie met een knijptest in de teen. Verwijder het haar, was de huid met een antisepticum en breng vervolgens ooglubricant aan; plaats de muis daarna voor de rest van de procedure op een warmtemat.

Plaats de proximale ring om het been met de moeren naar distaal gericht en schuif de ring boven het kniegewricht. Fixeer de proximale en distale metafyse van de linker tibia met vier steriele insectenspeldjes van 0,25 millimeter door de speldjes aan een boor te bevestigen en deze door het bot te boren. Orienteer de speldjes loodrecht op de lange as van de tibia en in een hoek van 90 graden ten opzichte van elkaar, waarbij een afstand van ten minste 10 millimeter tussen de proximale en distale speldjes wordt aangehouden.

Bevestig de pinnen aan de proximale ring, waarbij de tibia centraal in de aluminium ring wordt gehouden. Positioneer de tweede ring onder de distale pinnen. Bevestig de twee staven aan de proximale ring en zet vervolgens de pinnen aan de ring vast met de zeskantige moeren.

Creëer, zoals voorheen, de transversale fractuur door middel van driepuntsbuiging met een geschikt apparaat. Plaats het posterolaterale oppervlak van de tibia over de blokken. Til het gewicht naar een vooraf bepaalde hoogte langs de valarm en laat het gewicht vallen zodat het contact maakt met het anterolaterale aspect van de tibia.

Om de botbreuk te produceren, dient de fractuur via röntgenonderzoek te worden bevestigd. Bevestig vervolgens de laatste roestvrijstalendraadstang aan de ringen, beginnend bij het distale uiteinde. Voeg de stang in en draai een moer op de distale ring om de stang te fixeren.

Plaats vervolgens een andere moer op de stang, zodat de proximale ring bovenop is gepositioneerd. Zorg ervoor dat de twee ringen op gelijke afstand worden gehouden en dat de pinnen niet worden belast. Bevestig de proximale ring aan de stangen met een derde moer.

Voeg aamaz toe om de anesthesie om te keren en buprenorfine voor analgesie, en monitor de dieren totdat ze reageren en weer kunnen lopen. Dien vervolgens subcutane injecties buprenorfine toe voor analgesie, en herhaal dit vier uur later voor standaard distractie-osteogenese. Plaats bij dit model de fixateurs op de tibia, creëer een fractuur en laat deze gedurende een latentieperiode van vijf dagen ongemoeid.

Voer na vijf dagen de distractie-osteogenese uit door de moeren op de stabilisatiestangen te draaien. Draai deze zeven dagen lang elke dag een kwartslag. De dieren worden postoperatief nauwgezet gemonitord op de behoefte aan aanvullende analgesie.

Botbrugvorming wordt waargenomen binnen 10 dagen, en volledige consolidatie wordt waargenomen binnen 27 dagen na voltooiing van de distractie. Na het toedienen van anesthesie, het verwijderen van haar met een depilatiemiddel en het reinigen van de huid met een antisepticum, worden de fixateurs aangebracht zoals eerder beschreven. Plaats de muis onder de dissectiemicroscoop om de mediale tibia te visualiseren en maak vervolgens een incisie van vijf tot zeven millimeter met een scalpelmes nr. 10.

Snijd de spier voorzichtig door en scheid deze om de midden-diafyse van de tibia bloot te leggen. Knip met de punt van een schaar langzaam een segment van drie millimeter uit de tibia, waarbij u er nauwkeurig op let het bot niet met een grote mechanische kracht te verschuiven. Verwijder vervolgens eventuele resterende botfragmenten met een pincet.

Nadat de operatieve plek op botfragmenten is onderzocht, wordt het spierweefsel rond de afgestompelde uiteinden van de tibia teruggeplaatst. Sluit de huidincisie met twee tot drie hechtingen van 6.0 poly monofilament en voeg vervolgens de derde staaf toe om de externe fixateur te stabiliseren. Keer, zoals eerder aangetoond, de anesthesie om, dien pijnstillers toe en blijf de dieren monitoren op pijn.

Zoals eerder beschreven, bieden externe fixateurs, wanneer ze correct worden toegepast, een zeer rigide stabiliteit van de gesloten tibiale fractuur met een uitstekende reductie, zoals te zien is op deze röntgenfoto genomen na de fractuur, waarbij de goed uitgelijnde botsegmenten door de pijlpunten worden aangegeven. Fracturen die met deze methode zijn gestabiliseerd, genezen primair via intramembraneuze ossificatie; hier getoond met trichroomkleuring vertoont de gestabiliseerde fractuur wat nieuw bot op de fractuurplaats. In contrast hiermee wordt, wanneer de fractuur niet wordt gestabiliseerd, een grote kraakbenige callus gevormd in de fractuurspleet, die na ontwikkeling door het proces van endochondrale ossificatie wordt vervangen door bot. Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers in het vakgebied van de orthopedie om mechanismen van stabiele fractuurgenezing bij muizen te onderzoeken.