Grootschalige Opname van Neuronen door Movable Silicon Probes in Behaving Knaagdieren

Hoi Shane, ik ben Monty van het Bija Lab. Vandaag ga ik je laten zien hoe je siliciumsondes gebruikt voor hoge-densiteit elektrofysiologische registraties van unit-activiteit en lokale veldpotentialen in de wakkere, behandelde rat. Ik laat je zien hoe je een kleine micro-drive maakt, een siliciumsonde hieraan bevestigt en de sonde vervolgens in de hersenen implanteert voor chronische registraties.

Dit proces is vrij eenvoudig, maar omvat wel een aantal stappen. Laten we beginnen. Hier is een kleine collectie micro-drives voor ratten en muizen, bestaande uit systemen voor het bewegen van meerdere enkelvoudige draden, tetroden en siliciumprobes, die we in de loop der jaren hebben ontworpen en gefabriceerd.

Siliciumsondes kunnen worden bevestigd aan starre printplaten of flexibele polyamidekabels. We laten u hier zien hoe u deze sonde met vier schachten aan een micro-drive bevestigt. Om een drive voor te bereiden, hebben we een messing plaat, boorbiten met maat 55 en 65, een tappeerboor, een pinheader met één rij, een 0 0 90 schroef en de bijbehorende moer, een boorhouder en een schroevendraaier nodig.

De eerste stap is het afbreken van een stuk van drie pinnen van de header. Trek voorzichtig de middelste pin eruit en vergroot het gat door ermet een boor van maat 65 doorheen te boren. Snijd vervolgens een schroefdraad met de tap.

Snijd twee stukken uit de messingplaat. Vijl de randen van de plaat met een Dremel-boor en boor in het midden van beide stukken een gat met een boor van maat 55. De aandrijving wordt tijdelijk gemonteerd zodat de messingplaten de pinnen raken; draai de schroeven voorzichtig aan zodat de assemblage stabiel wordt.

De pinnen worden naar buiten gestoken en vervolgens aan de messing platen gesoldeerd. De micro-aandrijving is bijna klaar. Vijl het uitstekende uiteinde van de schroef af en soldeer deze aan de schroef. Nu hebben we een superlichte micro-aandrijving.

Met with de klok mee draaien wordt de plastic brug omhooggetild. De siliciumsonde kan met twee componenten aan de aandrijving worden bevestigd. Silk guard elastomeer gewicht.

Meng de componenten in een verhouding van 10 op 1. Breng deze beschermlaag met een geslepen wattenstaafje aan op het uiteinde van de probe. Laat dit gedurende ten minste twee uur drogen in een voorverwarmde oven op 60 °C.

Om er zeker van te zijn dat de opnameplaatsen vrij zijn van vuil, moeten de tips worden gereinigd. Bereid een viervoudige verdunning van contra-detergent voor. Laat de probe minimaal twee uur weken in het detergent bij 63 °C.

Het detergent moet worden weggespoeld door de probe herhaaldelijk in gedestilleerd water te dppen voordat de probe aan de drive wordt bevestigd. De impedantie van elke registratieplaats moet worden gecontroleerd met een scheermesje. Snijd met twee micromanipulatoren meerdere groeven in de brug om een ruw oppervlak te creëren.

De probe wordt tegenover de brug van de drive geplaatst. De probe wordt vervolgens vóór de operatie met gripcement aan de brug bevestigd. De referentie- en groundingelektroden worden voorbereid.

Soldeer één uiteinde van een geïsoleerde koperdraad voor ongeveer één millimeter. Schraap met een naald de kop van een 0 0 90 roestvrijstalen schroef en soldeer de koperdraad hieraan. Voorkom zorgvuldig dat er soldeer in de groef van de schroef loopt.

Snijd trapeziumvormige stukken uit kopergaas. Deze stukken worden geassembleerd om de headstage te beschermen. Het chirurgisch instrumentarium en de voorbereiding zijn gelijk aan die welke bij veel operaties aan kleine dieren worden gebruikt.

Houd er rekening mee dat de chirurgische ingreep in deze video uitsluitend bedoeld is voor demonstratiedoeleinden, om een passende zichtbaarheid en filming te garanderen. Verschillende voorbereidende stappen, chirurgische voorzorgsmaatregelen en postoperatieve procedures worden hier niet getoond. Raadpleeg de relevante richtlijnen voor chirurgie bij knaagdieren.

De volledige operatie wordt uitgevoerd onder gasnarcose en anesthesie onder aseptische omstandigheden. Na een midline huidincisie worden de huid en het periosteum verwijderd en wordt de schedel gereinigd en gedroogd. De locatie en afstand tussen bregma en lambda worden gemeten, zodat de X- en Y-coördinaten van de positie kunnen worden bepaald en gemarkeerd voordat de schedel wordt geopend.

Voor het implanteren van de probe worden verschillende schroeven half in het bot gedraaid, zowel aan de bovenkant als aan de zijkant van de gaten; er worden ook gaten boven hen voorbereid om de elektroden in te brengen. Meerdere schroeven zijn essentieel voor het vastzetten van de head stage aan de schedel bij langdurige chronische experimenten. Breng met een klein penseeltje meta upon dentin activator aan over het gehele oppervlak van de schedel.

Spoel het vervolgens af met zoutoplossing. Breng daarna voorzichtig een laag tandcement aan die een kettinggang bedekt. De vier koperen flappen worden vervolgens met gripcement aan deze schedel bevestigd.

We zijn nu gekomen bij het meest kritieke deel van de operatie: de preparatie van de implantatieplaats van de probe met behulp van een ronde boorkop. Het boren gebeurt in meerdere fasen en het bot wordt regelmatig geïrrigeerd met saline.

De botlap wordt voorzichtig verwijderd en het oppervlak wordt gespoeld om debris te verwijderen. Hiervoor zijn twee instrumenten nodig. De haak, vervaardigd uit een insectennaald, en een scherp scalpellamesje worden gebruikt om de lap op te tillen en door te snijden. Lichte bloedingen kunnen worden verholpen door spoeling met zoutoplossing.

Indien er sprake is van ernstige bloedingen of als de neocortex op welke wijze dan ook is aangetast, moet men overwegen de operatie te beëindigen en een ander dier voor te bereiden. We implanteren nu de siliciumsonde. De sonde moet worden ingebracht in een vaatvrij gebied, terwijl een wattenstaafje wordt gebruikt om kleine bloedingen te stelpen.

De probe wordt ongeveer één millimeter boven het beoogde doel geplaatst. De opening wordt afgesloten door een warm, gesmolten mengsel van paraffine en minerale olie aan te brengen. De onderzijde van de drive wordt in de schedel van de Cortes vastgezet met gripcement.

Het verbindingsstuk van de probe wordt op soortgelijke wijze aan de schedel gefixeerd. De laatste en kritieke fase van de operatie is het assembleren van kopergaasflappen tot een beschermende cilinder rondom de probe en de aandrijving. De cilinder dient tevens als elektrisch schild tegen omgevingsruis en de langzame golf-artefacten die worden veroorzaakt door de geladen snorharen.

Bij het levende dier kan de hoogte worden aangepast door overtollig materiaal weg te snijden. De draden van de referentie- en aardingscontacten worden gesoldeerd aan de overeenkomstige pinnen van de connector. De aarding wordt tevens gesoldeerd aan het koperen gaas.

De koperen mesh-flappen worden verbonden door middel van solderen en versterkt met cement. De beweging van de aandrijfschroef wordt aan het einde van de operatie opnieuw getest, waarbij de bovenkant van de headstage wordt afgedekt met een stukje van een rubberen handschoen na passende postoperatieve zorg. Het is een gezond en coöperatief dier dat de volgende dag goed is.

Om het dier vrij te laten bewegen, raden wij het gebruik van ultralichte, ultraflexibele multi-trend draden aan. De dunne kabel vereist een minimale tegenbalans en maakt ongebeperde beweging mogelijk. De opnamekwaliteit wordt dagelijks in de thuiskooi gecontroleerd.

De positie van de registratieplaats wordt geschat aan de hand van zowel de vuurpatronen van de units als de vorm van de lokale veldpotentialen. Onze video laat de implantatie van een enkele siliconenprobe zien, maar registraties op meerdere plaatsen met behulp van meerdere probes en drives kunnen na enige oefening gemakkelijk worden uitgevoerd. We gebruiken ook vergelijkbare, maar kleinere drives om siliconenprobes in de hersenen van muizen te implanteren.

Ten slotte kunnen opnames met silicium-elektroden effectief worden gecombineerd met lokale lichtstimulatie van neuraal weefsel in optogenetische experimenten. Bedankt voor het kijken.