Name: Expressie analyse van zoogdieren Linker-histon Subtypes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Leer hoe je H1 linker-histon subtypen kwantitatief analyseert met real-time PCR en HPLC. Deze methoden meten zowel mRNA- als eiwitexpressie in muizenweefsel en gekweekte cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door NIH-subsidie ​​GM085261 en Georgië Cancer Coalition Distinguished Scholar Award (tot YF).

<ol><li>Fan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H1+linker+histones+are+essential+for+mouse+development+and+affect+nucleosome+spacing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">H1 linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo.</a> Mol. Cell Biol. 23, 4559-4572 (2003).</li>
<li>Woodcock, C. L., Skoultchi, A. I., Fan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+linker+histone+in+chromatin+structure+and+function%3A+H1+stoichiometry+and+nucleosome+repeat+length%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Role of linker histone in chromatin structure and function: H1 stoichiometry and nucleosome repeat length.</a> Chromosome Res. 14, 17-25 (2006).</li>
<li>Shen, X., Gorovsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linker+histone+H1+regulates+specific+gene+expression+but+not+global+transcription+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Linker histone H1 regulates specific gene expression but not global transcription in vivo.</a> Cell. 86, 475-483 (1996).</li>
<li>Alami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+linker-histone+subtypes+differentially+affect+gene+expression+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mammalian linker-histone subtypes differentially affect gene expression in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 5920-5925 (2003).</li>
<li>Happel, N., Doenecke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H1+and+its+isoforms%3A+contribution+to+chromatin+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Histone H1 and its isoforms: contribution to chromatin structure and function.</a> Gene. 431, 1-12 (2009).</li>
<li>Clausell, J., Happel, N., Hale, T. K., Doenecke, D., Beato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H1+subtypes+differentially+modulate+chromatin+condensation+without+preventing+ATP-dependent+remodeling+by+SWI%2FSNF+or+NURF%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Histone H1 subtypes differentially modulate chromatin condensation without preventing ATP-dependent remodeling by SWI/SNF or NURF.</a> PLoS One. 4, 0007243-0007243 (2009).</li>
<li>Khadake, J. R., Rao, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-+chromatin-condensing+properties+of+rat+testes+H1a+and+H1t+compared+to+those+of+rat+liver+H1bdec%3B+H1t+is+a+poor+condenser+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA- chromatin-condensing properties of rat testes H1a and H1t compared to those of rat liver H1bdec; H1t is a poor condenser of chromatin.</a> Biochemistry. 34, 15792-15801 (1995).</li>
<li>Orrego, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+affinity+of+mammalian+histone+H1+somatic+subtypes+for+DNA+and+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential affinity of mammalian histone H1 somatic subtypes for DNA and chromatin.</a> BMC Biol. 5, 22-22 (2007).</li>
<li>Th'ng, J. P., Sung, R., Ye, M., Hendzel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H1+family+histones+in+the+nucleus.+Control+of+binding+and+localization+by+the+C-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">H1 family histones in the nucleus. Control of binding and localization by the C-terminal domain.</a> J. Biol. Chem. 280, 27809-27814 (2005).</li>
<li>Wang, Z. F., Sirotkin, A. M., Buchold, G. M., Skoultchi, A. I., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+histone+H1+genes%3A+gene+organization+and+differential+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The mouse histone H1 genes: gene organization and differential regulation.</a> J. Mol. Biol. 271, 124-138 (1997).</li>
<li>Brown, D. T., Sittman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+through+overexpression+and+tagging+of+the+variant+type+of+the+mouse+H1e+and+H1c+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification through overexpression and tagging of the variant type of the mouse H1e and H1c genes.</a> J. Biol. Chem. 268, 713-718 (1993).</li>
<li>Fan, Y., Sirotkin, A., Russell, R. G., Ayala, J., Skoultchi, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+somatic+H1+subtypes+are+dispensable+for+mouse+development+even+in+mice+lacking+the+H1%280%29+replacement+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Individual somatic H1 subtypes are dispensable for mouse development even in mice lacking the H1(0) replacement subtype.</a> Mol. Cell. Biol. 21, 7933-7943 (2001).</li>
<li>Fan, Y., Skoultchi, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+H1+linker+histone+subtypes+and+their+functions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of H1 linker histone subtypes and their functions in mice.</a> Methods Enzymol. 377, 85-107 (2004).</li>
<li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6, 986-994 (1996).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De set van testen die hier in staat stellen een uitgebreide analyse van de expressie niveaus van zoogdieren linker histon subtypes. Goed ontworpen qRT-PCR testen leveren zeer gevoelige en nauwkeurige metingen van RNA-boodschappen van alle zoogdieren histon H1 genen. De kritische deel van qRT-PCR assays voor linker histon-subtype genen is de voorbereiding van cDNA met behulp van willekeurige primer op basis reverse transcriptie. mRNA meeste histon genen waaronder de meeste H1 genen bevatten geen lange poly-A staart die i...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> RNase Zap </td><td> Applied Biosystems </td><td> AM9780 </td></tr><tr><td> Trizol Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> 15596-018 </td></tr><tr><td> SuperScriptIII </td><td> Invitrogen </td><td> 18080-051 </td></tr><tr><td> Absolute ethanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2818-4 </td></tr><tr><td> IQ SYBR Green </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-8880 </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> Deoxyribonuclease I </td><td> Sigma </td><td> AMP-D1 </td></tr><tr><td> Microseal 96-well PCR-plaat </td><td> Bio-Rad </td><td> MSP-9605 </td></tr><tr><td> Adhesive Seals microseal &#39;B&#39; </td><td> Bio-Rad </td><td> MSB-1001 </td&gt; </tr><tr><td> Sucrose </td><td> Agros Organics </td><td> AC40594 </td></tr><tr><td> Dibasisch heptahydraat (Na 2 HPO 4 · 7H 2 O) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP332 </td></tr><tr><td> Natriumchloride (NaCl) </td><td> Amerikaanse Bioanalytical </td><td> AB01915 </td></tr><tr><td> Natriumdiwaterstoffosfaat heptahydraat (NaH 2 PO 4 · 7H2O) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP-330 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP310 </td></tr><tr><td> Compleet Mini proteinase inhibitor cocktail tablet </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11836153001 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E-5134 </td></tr><tr><td> Phenylmethanesulfonyl (PMSF) </td><td> Amerikaanse Bioanalytical </td><td> AB01620 </td></tr><tr><td> Nonidet-40 (NP-40) </td&gt; <td> Amerikaanse Bioanalytical </td><td> AB01425 </td></tr><tr><td> Kaliumchloride (KCl) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP366 </td></tr><tr><td> Tris [hydroxymethyl aminomethaan] </td><td> Amerikaanse Bioanalytical </td><td> AB02000 </td></tr><tr><td> Magnesiumchloride (MgCl2) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP214 </td></tr><tr><td> Zwavelzuur (H2SO4) </td><td> VWR </td><td> VW3648-3 </td></tr><tr><td> Ammoniumhydroxide (NH4OH) </td><td> Agros Organics </td><td> AC42330 </td></tr><tr><td> Bradford Protein Assay </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0001 </td></tr><tr><td> Acetonitril </td><td> EMD </td><td> AX0145-1 </td></tr><tr><td> Trifluorazijnzuur (TFA) </td><td> JTBaker </td><td> 9470-01 </td></tr></tbody></table>

expressie analyse van zoogdieren linker-histon subtypes

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

Linker histon H1 bindt aan de nucleosoom kerndeeltje en linker DNA, het vergemakkelijken van het vouwen van chromatine in de hogere orde structuur. H1 is essentieel voor zoogdieren ontwikkeling 1 en regelt genexpressie in vivo 2-4. Onder de sterk geconserveerde histon-eiwitten, de familie van de H1 linker histonen is de meest heterogene groep. Er zijn 11 H1 subtypes in zoogdieren die differentieel gereguleerd gedurende de ontwikkeling en in verschillende celtypen. Deze H1 subtypen behoren 5 somatische H1S (H1a-e), de vervanging H1 0, 4 kiemcel specifieke H1 subtypes, en H1x 5. De aanwezigheid van meerdere H1 subtypes die verschillen in het DNA bindingsaffiniteit en chromatine verdichting mogelijkheid 6-9 biedt een extra niveau van de modulatie van chromatine functie. Zo kwantitatieve analyse van individuele uitdrukking H1 subtypen, beide van mRNA en eiwit, is noodzakelijk voor een beter begrip van de regulering van hogereOm chromatine structuur en functie. Hier beschrijven een aantal assays ontwikkeld voor het analyseren van de expressie van afzonderlijke subtypes H1 (figuur 1). opregulatie van verschillende H1 variant genen wordt gemeten door een aantal zeer gevoelige en kwantitatieve reverse transcriptie-PCR (qRT-PCR) assays, die sneller en nauwkeuriger en vereisen minder monsters opzichte van de alternatieve benadering van Northern blot analyse. In tegenstelling tot andere cellulaire mRNA berichten mRNAs meeste histoon genen waarvan de meerderheid van genen H1, ontbreekt een lange polyA staart, maar bevatten een stam-lusstructuur aan het 3 &#39;onvertaalde gebied (UTR) 10. Daarom worden cDNA&#39;s bereid uit totaal RNA door reverse transcriptie met random primers plaats van oligo-dT primers. Realtime PCR met primers specifiek voor elk H1 subtypes (Tabel 1) zijn uitgevoerd om zeer kwantitatieve meting van mRNA van de afzonderlijke H1 subtype verkrijgens. Expressie van housekeeping genen worden geanalyseerd als controle voor normalisatie. De relatieve overvloed aan eiwitten van elk subtype H1 en de kern histonen wordt verkregen door middel van omgekeerde fase hoge prestatie vloeistofchromatografie (RP-HPLC) analyse van het totaal histonen uit zoogdiercellen 11-13. De HPLC-methode en elutie voorwaarden die hier worden beschreven voor een optimale scheiding van de muis H1 subtypes. Door het kwantificeren van de HPLC-profiel berekenen we het relatieve aantal afzonderlijke H1 subtypes binnen H1 familie en het H1 nucleosoom verhouding in de cellen te bepalen.

We beschrijven een reeks testen om de expressie niveaus van H1 linker histonen te analyseren. mRNA van de individuele H1 genen worden kwantitatief gemeten door een willekeurige primer op basis reverse transcriptie gevolgd door real-time PCR, terwijl eiwit kwantificering van H1 histonen wordt bereikt met behulp van HPLC-analyse.

Expressie analyse van zoogdieren Linker-histon Subtypes

Linkerhiston H1 bindt aan het nucleosoomkernparticle en het linker-DNA, waardoor de vouwing van chromatine tot een hogere orde structuur wordt gefaciliteerd. H1 is essentieel ...

Het algemene doel van deze procedure is om de expressieniveaus van histon H1-subtypes te analyseren via zowel de analyse van H1-mRNA-niveaus als de meting van H1-proteïneniveaus. Om de mRNA-analyse uit te voeren, wordt eerst totaal RNA geëxtraheerd uit gekweekte cellen of muisweefsel. De tweede stap van de procedure is het uitvoeren van een reverse transcriptie van het totaal RNA met random primers, gevolgd door kwantitatieve real-time PCR-assays voor elk van de H1-subtypegenen. De analyse van het histon H1-proteïne begint met de preparatie van totale histon-extracten uit muisweefsels of gekweekte cellen.Vervolgens volgen fractionering en kwantificering van elk H1-subtype en het kernhiston H2B via reverse-phase HPLC-analyse. Uiteindelijk tonen kwantitatieve real-time PCR en reverse-phase HPLC-analyse de expressieniveaus van zowel mRNA als eiwitten aan voor elk H1-subtype.Wij zijn promovendi van het laboratorium van Dr. Yuhan aan de School of Biology van het Georgia Institute of Technology. Vandaag tonen wij u een reeks uitgebreide assays voor de analyse van de expressie van H1 in mammaliaanse H1-subtypes. Met behulp van deze assays kunt u een kwantitatieve meting verkrijgen van de expressieniveaus van zowel mRNA als eiwit in verschillende H1-subtypes.Histon H1 is het belangrijkste chromosomale structurele eiwit dat de hogere chromatinevouwing faciliteert. Er bestaan meerdere histon H1-varianten die differentieel tot expressie komen tijdens cel-differentiatie en ontwikkeling. Expressieprofilering van deze H1-subtypen is noodzakelijk voor een beter begrip van de regulatie van de structuur en functie van hogere chromatinestructuren. Laten we beginnen.Voorafgaand aan de RNA-extractie moeten alle werkoppervlakken en pipetten worden afgeveegd met 70% ethanol en behandeld worden met een RNA-decontaminatie-oplossing. Deze praktijk vermindert de kans op RNA-contaminatie en RNA-degradatie. Daarnaast moeten er bij alle procedures handschoenen worden gedragen om te beginnen met de extractie van RNA uit een adherente celcultuur, het aspireren van het cultuurmedium en het spoelen van de cellen met PBS.Verwijder daarna de PBS uit de putjes. Er is voldoende triol-reagens nodig om RNA van hoge kwaliteit te verkrijgen. Gebruik één milliliter triol-reagens om RNA te extraheren uit één putje van een zesputjesplaat. Ga over tot het extraheren van RNA uit de cellen volgens de handleiding van de fabrikant voor het triol-reagens. Meet na de RNA-extractie de RNA-concentratie met de NanoDrop 1000.De typische opbrengst varieert van 5 tot 15 µg RNA per 1 × 10⁶ gekweekte cellen. Analyseer vóór de cDNA-synthese de RNA-kwaliteit via GE-elektroforese om potentiële contaminatie van het RNA met sporen van genomisch DNA uit te sluiten; behandel RNA-monsters met RNA-vrij DN volgens de instructies van de fabrikant voor reverse transcriptie van totaal RNA naar cDNA. Gebruik het superscript three first strand synthesis system volgens de instructies van de fabrikant. Aangezien het mRNA van de meeste H1-genen geen poly-A-staarten heeft, is het essentieel om random hexameren in plaats van oligo-dT als primers te gebruiken.Voor cDNA-synthese kan, na reverse transcriptie, cDNA-amplificatie worden bereikt via qRT-PCR, waarbij detectie plaatsvindt met SYBR Green-kleurstof voorafgaand aan de qRT-PCR-assay. Forward- en reverse-PCR-primers specifiek voor elk H1-gen en het interne referentiegen werden ontworpen, en de primerefficiëntie werd getest met de standaardcurvemethode zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Ga verder met het voorbereiden van elke PCR-reactie door de primers, cDNA en SYBR Green Super te mengen.Meng de reacties goed in een micros EAL 96-well PCR-plaat en gebruik micros EAL B-adhesieve verzegelingen om er zeker van te zijn dat de plaatdekking goed is afgesloten. Vortex vervolgens de verzegelde plaat en centrifugeer de reactiemengsels kort. Plaats de plaat in het My IQ single-color real-time PCR-detectiesysteem voor QPCR.Stel de QPCR-condities in en voer de run uit zoals beschreven in de tekst na de amplificatie. Beoordeel de amplificatiecurves op PCR-efficiëntie en drempelwaarde-cycli of CT-waarden. De drempellijn kan automatisch worden ingesteld door de IQ five optical system software versie 2.0.Omdat cyber green elk dubbelstrengs DNA detecteert, is het essentieel om na de QPCR een smeltcurve-analyse uit te voeren om te bevestigen dat het gewenste amplicon is versterkt en gedetecteerd, en niet primerdimeren of contaminanten. Voor het smeltcurve-analyseprogramma moet het QPCR-instrument de monsters verhitten van 55 °C naar 95 °C in stappen van 0,5 °C met bijbehorende gegevensverzameling. Aangezien de temperatuur of TM van dubbelstrengs DNA afhankelijk is van de lengte van het amplicon en het GC-gehalte, zullen verschillende amplicons verschillende TM's hebben.Onderzoek de afgeleide smeltcurves van de QPCR-producten om de specifieke smelttemperatuur van de gewenste amplicons te bevestigen, evenals de afwezigheid van ruis-ampliconpieken, zoals de hier getoonde smeltcurves van H one A PCR-amplicons met een TM van 86 °C. Analyseer vervolgens de QPCR-gegevens met de IQ five optical system-software. Normaliseer de expressiewaarden van de H one-isovormgenen ten opzichte van de expressie van housekeeping-genen om de relatieve expressieniveaus van H one-genen te verkrijgen.Nadat het betreffende orgaan uit een geëuthanaseerde muis is gedissekeerd, spoelt u dit af met ijskoud PBS. In deze demonstratie wordt de preparatie van totaal HIS uitgevoerd op de lever; na het wassen wordt het weefsel met een scheermesje in stukjes gesneden. Breng het gesneden weefsel over naar een homogenisator en voeg vervolgens sucrosebuffer toe aan de homogenisator met een volume van 10 milliliters per gram weefsel.Homogeniseer het weefsel met 10 tot 15 slagen. Na het overbrengen van de homogenaten naar een buis van 15 milliliter, worden de monsters gecentrifugeerd bij 500 RPM gedurende 30 seconden. Na centrifugatie wordt het supernatant voorzichtig overgebracht naar een nieuwe buis en gecentrifugeerd bij 2000 RPM gedurende vijf minuten.Om de cellen te pelleteren, resuspendeert u de celpellet in 10 milliliters sucrosebuffer, aangevuld met 0,5%NP 40. Breng het monster over naar een homogenisator en voer 10 slagen uit gedurende een incubatie van 20 minuten. Op dit punt zijn de kernen verkregen.Beoordeel de kwaliteit van de kernen onder een microscoop. Nadat de kernen door centrifugatie bij 2000 RPM gedurende vijf minuten zijn neergeslagen, kan het supernatant worden verwijderd. Resuspendeer vervolgens de pellet van de kernen in drie milliliter high salt buffer per gram weefsel.Breng de monster over naar een kleine Dounce-homogenisator en homogeniseer met vijf tot 10 slagen. Verdeel de suspensie over drie Eppendorf-buisjes. Incubeer de buisjes gedurende 20 minuten op ijs.Volg de incubatie met centrifugatie bij 14.000 RPM gedurende 10 minuten om het chromatine te pelletiseren. Na het verwijderen van het supernatant worden de totale histonen geëxtraheerd door 0,8 milliliter 0,2 normaal zwavelzuur aan elke chromatinepellet toe te voegen. Gebruik een eppendorfkolfstempel om de pellet goed te vermalen totdat deze volledig is gedissocieerd.Incubeer de monsters op een draaiplateau bij 4 °C gedurende de nacht. Breng na centrifugatie het supernatant over in twee EOR-buisjes. Voeg aan elk buisje 2,5 volumes ijskoud ethanol toe.Bewaar de monsters gedurende de nacht bij -20 °C. Centrifugeer de volgende dag 10 minuten bij 14.000 RPM om de totale histonen te pelletteren en verwijder het supernatant. Nadat de pellet drie keer is gewassen met 70% ethanol, laat u de open buisjes 20 tot 30 minuten op de bench aan de lucht drogen en gaat u over tot HPLC-analyse. Resuspendeer de histonepellet onmiddellijk in het aanbevolen volume dubbel gedestilleerd water, afhankelijk van de capaciteit van de reverse phase-kolom en het HPLC-instrument, en centrifugeer 5 minuten bij 14.000 RPM.Om onoplosbare residuen te verwijderen, worden 50 tot 100 micrograms totaal histoneproteïne geïnjecteerd op de reverse-phase kolom van het HPLC-systeem, zoals de GE ACTA purifier UPC 900. Bij het laden moet een overmaat aan proteïne worden vermeden om verstopping van de kolom te voorkomen. Fractie acht, de linkerhistonen en kernhistonen worden geëlueerd met een toenemende acetonitrilgradiënt zoals beschreven in het schriftelijke protocol; het effluent wordt gemonitord bij 214 nanometers en de HPLC-profielen worden geregistreerd en geanalyseerd. De proteïnefracties kunnen ook worden opgevangen met de GE FRAC nine 20 fractie-autocollector voor verdere analyse.Hier worden typische amplificatiecurven getoond van H1-qPCR-reacties met cDNA dat is voorbereid uit levercellen van muizen en embryonale stamcellen van muizen. Evaluatie van de amplificatieplot laat zien dat de triplaat qPCR-reacties van elk monster consistente signalen gaven met vrijwel identieke CT-waarden, wat wijst op een hoge reproduceerbaarheid. De afwezigheid van amplicon-opbouw in de RT-minus qPCR-reacties geeft aan dat genomische DNA-contaminatie niet aanwezig of minimaal was. Met behulp van de CT-waarden van H1-genen en housekeeping-genen werden de relatieve RNA-expressieniveaus van elk H1-gen berekend.De hier getoonde grafieken zijn voorbeelden van berekende resultaten voor de genen H one A en H one zero. De relatieve expressieniveaus van H one A mRNA zijn hoger in embryonale stamcellen van muizen vergeleken met de lever van muizen, terwijl de expressie van H one zero veel hoger is in de lever dan in de embryonale stamcellen. Het verschil in expressie van H one A of H one zero in embryonale stamcellen van muizen versus de lever van volwassen muizen is ook duidelijk zichtbaar in HPLC-profielen van histoneproteïnen.H10. Het differentiatiespecifieke H10 hoopt zich in grote hoeveelheden op in de lever van de volwassen muis. In contrast hiermee is het H10-eiwit vrijwel afwezig in ongedifferentieerde embryonale stamcellen van de muis.Aan de andere kant is H1A sterk tot expressie gebracht in embryonale stamcellen, maar komt het in lage hoeveelheden voor in de lever van volwassen muizen, zoals blijkt uit de kwantificering van H1-pieken. In het HPLC-profiel wordt de relatieve proportie van elk individueel H1-subtype binnen de H1-familie in de lever van volwassen muizen bepaald. Bovendien kunnen de waarden van elk individueel H1-subtype per nucleosoom worden berekend uit de verhouding van de genormaliseerde piekwaarde voor de absorptie bij 214 nanometer van de corresponderende H1-subtypes ten opzichte van de helft van de genormaliseerde waarde voor H2B. Deze waarde kan op soortgelijke wijze worden berekend voor het totale H1 per nucleosoom.Zodra de methode onder de knie is, kan de Q-R-T-P-C-R-analyse van H1-subtypen in één dag worden voltooid, en kunnen histonextractie en HPRC-analyse in drie dagen worden uitgevoerd mits dit correct gebeurt. Bij het uitvoeren van de Q-R-T-P-C-R-analyse van histon H1-genen is het essentieel om RNA-degradatie te voorkomen, genomische DNA-contaminatie te elimineren en, bovenal, random primers toe te voegen aan de reverse transcriptiereactie. Tijdens de histonextractie en HPOC-analyse is het belangrijk om proteaseremmers vers aan de extractiebuffer toe te voegen om proteïnedegradatie te voorkomen; daarnaast moet er aandacht worden besteed aan het volledig disaggregeren van chromatine om een volledige histonextractie te faciliteren.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u de expressie van subtypes van mammaliaanse histo H1 uitgebreid kunt analyseren op zowel mRNA- als proteineniveau.

expression-analysis-of-mammalian-linker-histone-subtypes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Door de combinatie van inheemse en verknopen van chromatine immunoprecipitatie met een hoge-resolutie massaspectrometrie, ChroP benadering stelt aan de samengestelde proteomics architectuur van histonmodificaties, varianten en niet-histonic eiwitten synergizing op functioneel verschillende chromatinedomeinen ontleden.

De ChroP aanpak combineert chip en massaspectrometrie te ontleden Locus-specifieke Proteomic Landschappen van Chromatin

Dit protocol beschrijft een volledig geïntegreerde workflow voor het karakteriseren histon post-translationele modificaties met massaspectrometrie (MS). De workflow bevat histon zuivering uit celkweken of weefsels, histon derivatisering en de spijsvertering, MS analyse met behulp van nano-flow vloeistofchromatografie en instructies voor gegevensanalyse. Het protocol is ontworpen voor de voltooiing binnen 2-3 dagen.

Compleet Workflow voor Analyse van histon post-translationele modificaties Met behulp van Bottom-up Massaspectrometrie: Van Histon Extraction om Data Analysis

Dit protocol beschrijft de reconstructie van nucleosomen die differentieel-isotoop gemerkte zus histonen. Tegelijkertijd asymmetrisch post-translationeel gemodificeerde nucleosomen worden gegenereerd na het gebruik van een histon premodified kopie. Deze preparaten kunnen gemakkelijk worden gebruikt om wijzigingen crosstalk mechanismen bestuderen, gelijktijdig op beide zus histonen, met behulp van hoge-resolutie NMR-spectroscopie.

Reconstructie van Nucleosomen met Differentieel Isotopen-gelabelde Sister Histon

Dit manuscript beschrijft methodes voor het toepassen van peptide microarray technologie op specificiteit profilering van antilichamen die histonen herkennen en hun post-translationele modificaties.

Analyse van Histone Antilichaam Specificiteit Met Peptide Microarrays

Presenteren we een effectieve en reproduceerbare methode om te isoleren en cultuur van neurale voorlopercellen van embryonale en postnatale hersenweefsel voor chromatine immunoprecipitation (ChIP) van Histon 3 lysine 79 dimethylation (H3K79me2) - een Histon mark gelegen binnen de bolvormige domein van Histon 3.

Isolatie en teelt van neurale progenitoren gevolgd door chromatine-Immunoprecipitation van Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Remmers van histonacetyltransferases (HAT's, ook bekend als lysine acetyltransferasen), zoals CBP/p300, zijn potentiële therapieën voor de behandeling van kanker. Er zijn echter rigoureuze methoden nodig om deze remmers te valideren. Drie in vitro methoden voor validatie omvatten HAT-tests met recombinant acetyltransferases, immunoblotting voor histonacetylatie in de celcultuur en ChIP-qPCR.

Assays voor het valideren van Histon Acetyltransferase Inhibitors

DNA-gordijn, een high-throughput single-molecule beeldvormingstechniek, biedt een platform voor real-time visualisatie van diverse eiwit-DNA-interacties. Het huidige protocol maakt gebruik van de DNA-gordijntechniek om de biologische rol en het moleculaire mechanisme van Abo1 te onderzoeken, een Schizosaccharomyces pombe bromodomein-bevattend AAA+ ATPase.

Het ontcijferen van moleculair mechanisme van histonassemblage door DNA-gordijntechniek

Dit protocol schetst hoe een driedimensionaal celkweeksysteem kan worden gebruikt om chromatinemodificaties in een bijna fysiologische toestand te modelleren, behandelen en analyseren.

Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue

Een analytische workflow op basis van vloeistofchromatografie, mobiliteitsspectrometrie met ingesloten ionen en time-of-flight-massaspectrometrie (LC-TIMS-ToF MS/MS) voor een zeer betrouwbare en zeer reproduceerbare "bottom-up"-analyse van histonmodificaties en identificatie op basis van de belangrijkste parameters (retentietijd [RT], botsingsdoorsnede [CCS] en nauwkeurige massa-tot-lading [m/z]-verhouding).

Screening op histonmodificatie met behulp van vloeistofchromatografie, Trapped Ion Mobility Spectrometry en Time-Of-Flight Mass Spectrometry

Deze methode beschrijft een eenvoudige en snelle strategie voor de karakterisering en het onderzoek van histonproteoformen.

Onthulling van histon-proteovormen met behulp van 2D-TAU gelelektroforese

Leer hoe je H1 linker-histon subtypen kwantitatief analyseert met real-time PCR en HPLC. Deze methoden meten zowel mRNA- als eiwitexpressie in muizenweefsel en gekweekte cellen.

Expressie analyse van zoogdieren Linker-histon Subtypes

Meer video's verkennen