Name: Expressie analyse van zoogdieren Linker-histon Subtypes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Leer hoe je H1 linker-histon subtypen kwantitatief analyseert met real-time PCR en HPLC. Deze methoden meten zowel mRNA- als eiwitexpressie in muizenweefsel en gekweekte cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door NIH-subsidie ​​GM085261 en Georgië Cancer Coalition Distinguished Scholar Award (tot YF).

<ol><li>Fan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H1+linker+histones+are+essential+for+mouse+development+and+affect+nucleosome+spacing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">H1 linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo.</a> Mol. Cell Biol. 23, 4559-4572 (2003).</li>
<li>Woodcock, C. L., Skoultchi, A. I., Fan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+linker+histone+in+chromatin+structure+and+function%3A+H1+stoichiometry+and+nucleosome+repeat+length%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Role of linker histone in chromatin structure and function: H1 stoichiometry and nucleosome repeat length.</a> Chromosome Res. 14, 17-25 (2006).</li>
<li>Shen, X., Gorovsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linker+histone+H1+regulates+specific+gene+expression+but+not+global+transcription+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Linker histone H1 regulates specific gene expression but not global transcription in vivo.</a> Cell. 86, 475-483 (1996).</li>
<li>Alami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+linker-histone+subtypes+differentially+affect+gene+expression+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mammalian linker-histone subtypes differentially affect gene expression in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 5920-5925 (2003).</li>
<li>Happel, N., Doenecke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H1+and+its+isoforms%3A+contribution+to+chromatin+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Histone H1 and its isoforms: contribution to chromatin structure and function.</a> Gene. 431, 1-12 (2009).</li>
<li>Clausell, J., Happel, N., Hale, T. K., Doenecke, D., Beato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H1+subtypes+differentially+modulate+chromatin+condensation+without+preventing+ATP-dependent+remodeling+by+SWI%2FSNF+or+NURF%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Histone H1 subtypes differentially modulate chromatin condensation without preventing ATP-dependent remodeling by SWI/SNF or NURF.</a> PLoS One. 4, 0007243-0007243 (2009).</li>
<li>Khadake, J. R., Rao, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-+chromatin-condensing+properties+of+rat+testes+H1a+and+H1t+compared+to+those+of+rat+liver+H1bdec%3B+H1t+is+a+poor+condenser+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA- chromatin-condensing properties of rat testes H1a and H1t compared to those of rat liver H1bdec; H1t is a poor condenser of chromatin.</a> Biochemistry. 34, 15792-15801 (1995).</li>
<li>Orrego, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+affinity+of+mammalian+histone+H1+somatic+subtypes+for+DNA+and+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential affinity of mammalian histone H1 somatic subtypes for DNA and chromatin.</a> BMC Biol. 5, 22-22 (2007).</li>
<li>Th'ng, J. P., Sung, R., Ye, M., Hendzel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H1+family+histones+in+the+nucleus.+Control+of+binding+and+localization+by+the+C-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">H1 family histones in the nucleus. Control of binding and localization by the C-terminal domain.</a> J. Biol. Chem. 280, 27809-27814 (2005).</li>
<li>Wang, Z. F., Sirotkin, A. M., Buchold, G. M., Skoultchi, A. I., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+histone+H1+genes%3A+gene+organization+and+differential+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The mouse histone H1 genes: gene organization and differential regulation.</a> J. Mol. Biol. 271, 124-138 (1997).</li>
<li>Brown, D. T., Sittman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+through+overexpression+and+tagging+of+the+variant+type+of+the+mouse+H1e+and+H1c+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification through overexpression and tagging of the variant type of the mouse H1e and H1c genes.</a> J. Biol. Chem. 268, 713-718 (1993).</li>
<li>Fan, Y., Sirotkin, A., Russell, R. G., Ayala, J., Skoultchi, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+somatic+H1+subtypes+are+dispensable+for+mouse+development+even+in+mice+lacking+the+H1%280%29+replacement+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Individual somatic H1 subtypes are dispensable for mouse development even in mice lacking the H1(0) replacement subtype.</a> Mol. Cell. Biol. 21, 7933-7943 (2001).</li>
<li>Fan, Y., Skoultchi, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+H1+linker+histone+subtypes+and+their+functions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of H1 linker histone subtypes and their functions in mice.</a> Methods Enzymol. 377, 85-107 (2004).</li>
<li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6, 986-994 (1996).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De set van testen die hier in staat stellen een uitgebreide analyse van de expressie niveaus van zoogdieren linker histon subtypes. Goed ontworpen qRT-PCR testen leveren zeer gevoelige en nauwkeurige metingen van RNA-boodschappen van alle zoogdieren histon H1 genen. De kritische deel van qRT-PCR assays voor linker histon-subtype genen is de voorbereiding van cDNA met behulp van willekeurige primer op basis reverse transcriptie. mRNA meeste histon genen waaronder de meeste H1 genen bevatten geen lange poly-A staart die i...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> RNase Zap </td><td> Applied Biosystems </td><td> AM9780 </td></tr><tr><td> Trizol Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> 15596-018 </td></tr><tr><td> SuperScriptIII </td><td> Invitrogen </td><td> 18080-051 </td></tr><tr><td> Absolute ethanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2818-4 </td></tr><tr><td> IQ SYBR Green </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-8880 </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> Deoxyribonuclease I </td><td> Sigma </td><td> AMP-D1 </td></tr><tr><td> Microseal 96-well PCR-plaat </td><td> Bio-Rad </td><td> MSP-9605 </td></tr><tr><td> Adhesive Seals microseal &#39;B&#39; </td><td> Bio-Rad </td><td> MSB-1001 </td&gt; </tr><tr><td> Sucrose </td><td> Agros Organics </td><td> AC40594 </td></tr><tr><td> Dibasisch heptahydraat (Na 2 HPO 4 · 7H 2 O) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP332 </td></tr><tr><td> Natriumchloride (NaCl) </td><td> Amerikaanse Bioanalytical </td><td> AB01915 </td></tr><tr><td> Natriumdiwaterstoffosfaat heptahydraat (NaH 2 PO 4 · 7H2O) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP-330 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP310 </td></tr><tr><td> Compleet Mini proteinase inhibitor cocktail tablet </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11836153001 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E-5134 </td></tr><tr><td> Phenylmethanesulfonyl (PMSF) </td><td> Amerikaanse Bioanalytical </td><td> AB01620 </td></tr><tr><td> Nonidet-40 (NP-40) </td&gt; <td> Amerikaanse Bioanalytical </td><td> AB01425 </td></tr><tr><td> Kaliumchloride (KCl) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP366 </td></tr><tr><td> Tris [hydroxymethyl aminomethaan] </td><td> Amerikaanse Bioanalytical </td><td> AB02000 </td></tr><tr><td> Magnesiumchloride (MgCl2) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP214 </td></tr><tr><td> Zwavelzuur (H2SO4) </td><td> VWR </td><td> VW3648-3 </td></tr><tr><td> Ammoniumhydroxide (NH4OH) </td><td> Agros Organics </td><td> AC42330 </td></tr><tr><td> Bradford Protein Assay </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0001 </td></tr><tr><td> Acetonitril </td><td> EMD </td><td> AX0145-1 </td></tr><tr><td> Trifluorazijnzuur (TFA) </td><td> JTBaker </td><td> 9470-01 </td></tr></tbody></table>

expressie analyse van zoogdieren linker-histon subtypes

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

Linker histon H1 bindt aan de nucleosoom kerndeeltje en linker DNA, het vergemakkelijken van het vouwen van chromatine in de hogere orde structuur. H1 is essentieel voor zoogdieren ontwikkeling 1 en regelt genexpressie in vivo 2-4. Onder de sterk geconserveerde histon-eiwitten, de familie van de H1 linker histonen is de meest heterogene groep. Er zijn 11 H1 subtypes in zoogdieren die differentieel gereguleerd gedurende de ontwikkeling en in verschillende celtypen. Deze H1 subtypen behoren 5 somatische H1S (H1a-e), de vervanging H1 0, 4 kiemcel specifieke H1 subtypes, en H1x 5. De aanwezigheid van meerdere H1 subtypes die verschillen in het DNA bindingsaffiniteit en chromatine verdichting mogelijkheid 6-9 biedt een extra niveau van de modulatie van chromatine functie. Zo kwantitatieve analyse van individuele uitdrukking H1 subtypen, beide van mRNA en eiwit, is noodzakelijk voor een beter begrip van de regulering van hogereOm chromatine structuur en functie. Hier beschrijven een aantal assays ontwikkeld voor het analyseren van de expressie van afzonderlijke subtypes H1 (figuur 1). opregulatie van verschillende H1 variant genen wordt gemeten door een aantal zeer gevoelige en kwantitatieve reverse transcriptie-PCR (qRT-PCR) assays, die sneller en nauwkeuriger en vereisen minder monsters opzichte van de alternatieve benadering van Northern blot analyse. In tegenstelling tot andere cellulaire mRNA berichten mRNAs meeste histoon genen waarvan de meerderheid van genen H1, ontbreekt een lange polyA staart, maar bevatten een stam-lusstructuur aan het 3 &#39;onvertaalde gebied (UTR) 10. Daarom worden cDNA&#39;s bereid uit totaal RNA door reverse transcriptie met random primers plaats van oligo-dT primers. Realtime PCR met primers specifiek voor elk H1 subtypes (Tabel 1) zijn uitgevoerd om zeer kwantitatieve meting van mRNA van de afzonderlijke H1 subtype verkrijgens. Expressie van housekeeping genen worden geanalyseerd als controle voor normalisatie. De relatieve overvloed aan eiwitten van elk subtype H1 en de kern histonen wordt verkregen door middel van omgekeerde fase hoge prestatie vloeistofchromatografie (RP-HPLC) analyse van het totaal histonen uit zoogdiercellen 11-13. De HPLC-methode en elutie voorwaarden die hier worden beschreven voor een optimale scheiding van de muis H1 subtypes. Door het kwantificeren van de HPLC-profiel berekenen we het relatieve aantal afzonderlijke H1 subtypes binnen H1 familie en het H1 nucleosoom verhouding in de cellen te bepalen.

We beschrijven een reeks testen om de expressie niveaus van H1 linker histonen te analyseren. mRNA van de individuele H1 genen worden kwantitatief gemeten door een willekeurige primer op basis reverse transcriptie gevolgd door real-time PCR, terwijl eiwit kwantificering van H1 histonen wordt bereikt met behulp van HPLC-analyse.

Expressie analyse van zoogdieren Linker-histon Subtypes

Linkerhiston H1 bindt aan het nucleosoomkernparticle en het linker-DNA, waardoor de vouwing van chromatine tot een hogere orde structuur wordt gefaciliteerd. H1 is essentieel ...

Het algemene doel van deze procedure is om de expressieniveaus van histon H1-subtypes te analyseren via zowel de analyse van H1-mRNA-niveaus als de meting van H1-proteïneniveaus. Om de mRNA-analyse uit te voeren, wordt eerst totaal RNA geëxtraheerd uit gekweekte cellen of muisweefsel. De tweede stap van de procedure is het uitvoeren van een reverse transcriptie van het totaal RNA met random primers, gevolgd door kwantitatieve real-time PCR-assays voor elk van de H1-subtypegenen. De analyse van het histon H1-proteïne begint met de preparatie van totale histon-extracten uit muisweefsels of gekweekte cellen.Vervolgens volgen fractionering en kwantificering van elk H1-subtype en het kernhiston H2B via reverse-phase HPLC-analyse. Uiteindelijk tonen kwantitatieve real-time PCR en reverse-phase HPLC-analyse de expressieniveaus van zowel mRNA als eiwitten aan voor elk H1-subtype.Wij zijn promovendi van het laboratorium van Dr. Yuhan aan de School of Biology van het Georgia Institute of Technology. Vandaag tonen wij u een reeks uitgebreide assays voor de analyse van de expressie van H1 in mammaliaanse H1-subtypes. Met behulp van deze assays kunt u een kwantitatieve meting verkrijgen van de

expression-analysis-of-mammalian-linker-histone-subtypes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Door de combinatie van inheemse en verknopen van chromatine immunoprecipitatie met een hoge-resolutie massaspectrometrie, ChroP benadering stelt aan de samengestelde proteomics architectuur van histonmodificaties, varianten en niet-histonic eiwitten synergizing op functioneel verschillende chromatinedomeinen ontleden.

De ChroP aanpak combineert chip en massaspectrometrie te ontleden Locus-specifieke Proteomic Landschappen van Chromatin

Dit protocol beschrijft een volledig geïntegreerde workflow voor het karakteriseren histon post-translationele modificaties met massaspectrometrie (MS). De workflow bevat histon zuivering uit celkweken of weefsels, histon derivatisering en de spijsvertering, MS analyse met behulp van nano-flow vloeistofchromatografie en instructies voor gegevensanalyse. Het protocol is ontworpen voor de voltooiing binnen 2-3 dagen.

Compleet Workflow voor Analyse van histon post-translationele modificaties Met behulp van Bottom-up Massaspectrometrie: Van Histon Extraction om Data Analysis

Dit protocol beschrijft de reconstructie van nucleosomen die differentieel-isotoop gemerkte zus histonen. Tegelijkertijd asymmetrisch post-translationeel gemodificeerde nucleosomen worden gegenereerd na het gebruik van een histon premodified kopie. Deze preparaten kunnen gemakkelijk worden gebruikt om wijzigingen crosstalk mechanismen bestuderen, gelijktijdig op beide zus histonen, met behulp van hoge-resolutie NMR-spectroscopie.

Reconstructie van Nucleosomen met Differentieel Isotopen-gelabelde Sister Histon

Dit manuscript beschrijft methodes voor het toepassen van peptide microarray technologie op specificiteit profilering van antilichamen die histonen herkennen en hun post-translationele modificaties.

Analyse van Histone Antilichaam Specificiteit Met Peptide Microarrays

Presenteren we een effectieve en reproduceerbare methode om te isoleren en cultuur van neurale voorlopercellen van embryonale en postnatale hersenweefsel voor chromatine immunoprecipitation (ChIP) van Histon 3 lysine 79 dimethylation (H3K79me2) - een Histon mark gelegen binnen de bolvormige domein van Histon 3.

Isolatie en teelt van neurale progenitoren gevolgd door chromatine-Immunoprecipitation van Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Remmers van histonacetyltransferases (HAT's, ook bekend als lysine acetyltransferasen), zoals CBP/p300, zijn potentiële therapieën voor de behandeling van kanker. Er zijn echter rigoureuze methoden nodig om deze remmers te valideren. Drie in vitro methoden voor validatie omvatten HAT-tests met recombinant acetyltransferases, immunoblotting voor histonacetylatie in de celcultuur en ChIP-qPCR.

Assays voor het valideren van Histon Acetyltransferase Inhibitors

DNA-gordijn, een high-throughput single-molecule beeldvormingstechniek, biedt een platform voor real-time visualisatie van diverse eiwit-DNA-interacties. Het huidige protocol maakt gebruik van de DNA-gordijntechniek om de biologische rol en het moleculaire mechanisme van Abo1 te onderzoeken, een Schizosaccharomyces pombe bromodomein-bevattend AAA+ ATPase.

Het ontcijferen van moleculair mechanisme van histonassemblage door DNA-gordijntechniek

Dit protocol schetst hoe een driedimensionaal celkweeksysteem kan worden gebruikt om chromatinemodificaties in een bijna fysiologische toestand te modelleren, behandelen en analyseren.

Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue

Een analytische workflow op basis van vloeistofchromatografie, mobiliteitsspectrometrie met ingesloten ionen en time-of-flight-massaspectrometrie (LC-TIMS-ToF MS/MS) voor een zeer betrouwbare en zeer reproduceerbare "bottom-up"-analyse van histonmodificaties en identificatie op basis van de belangrijkste parameters (retentietijd [RT], botsingsdoorsnede [CCS] en nauwkeurige massa-tot-lading [m/z]-verhouding).

Screening op histonmodificatie met behulp van vloeistofchromatografie, Trapped Ion Mobility Spectrometry en Time-Of-Flight Mass Spectrometry

Deze methode beschrijft een eenvoudige en snelle strategie voor de karakterisering en het onderzoek van histonproteoformen.

Onthulling van histon-proteovormen met behulp van 2D-TAU gelelektroforese

Leer hoe je H1 linker-histon subtypen kwantitatief analyseert met real-time PCR en HPLC. Deze methoden meten zowel mRNA- als eiwitexpressie in muizenweefsel en gekweekte cellen.

Expressie analyse van zoogdieren Linker-histon Subtypes

Meer video's verkennen