Name: Live-cell imaging van het migreren van cellen die fluorescent-gemerkte eiwitten in een drie-dimensionale Matrix (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Leer live-cell imaging van fluorescerend-gemerkte eiwitten in migrerende cellen binnen een 3D-collageenmatrix. Deze methode onthult eiwitdynamica en lokalisatie in real-time voor celmigratieonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken dr. Grant Sumida voor de kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door een Beckman Young Investigator Award (SY), een Hellman Family New Faculty Award (SY), een NIH EUREKA, de University of California Cancer Research Coordinating Committee.

1. Het genereren van een stabiele cellijn (bijv. MDCK cellen) <ol><li> Plaat cellen op 80-90% confluentie in een p35 schotel. Laat geen cellen vormen 100% confluent monolaag, die transfectie-efficiëntie zal verminderen. </li><li> Transfecteren de cellen met het plasmide van belang met behulp van Lipofectamine 2000. Optimaliseren transfectie omstandigheden met behulp van de fabrikant protocol. </li><li> De volgende dag, passage van de cellen in twee P150 petrischaaltjes. De grote schaal wordt aanbevolen om voldoende afstand tussen de stal kolonies mogelijk te maken. </li><li> De volgende dag, wijzigt u de media en voeg 500 ug / ml G418 aan elk gerecht. De G418 concentratie moet worden geoptimaliseerd voor de individuele cellijnen. </li><li> Wijzig de media om de andere dag gedurende ongeveer 2 weken. Na 2 weken, moet G418-resistente kolonies beginnen te vormen, en zijn zichtbaar met het blote oog. </li><li> Met behulp van een omgekeerde fluorescentie microscoop te identificeren GFP positieve kolonies. Markeer deze kolonies op de plaat met behulp van een Sharpie pen. </li><li> Naar selectief trypsinize de koloniën van de weefselkweek plaat, zuigen uit de media, en twee keer was de cellen met PBS of trypsine oplossing. Op de tweede wassen, niet zuigen alles uit de oplossing. Laat een dun laagje vloeistof op de bodem van de plaat om cellen te voorkomen drogen. </li><li> Voor elk gemarkeerd kolonie: gebruik een gesteriliseerd wattenstaafje om zo dicht mogelijk veeg rond de rand van de kolonie. Dit zal leiden tot een eiland van nat gebied met de cel kolonie. Pipetteer 10 ul van trypsine op de kolonie. Herhaal dit voor elke kolonie, en ga snel om uitdrogen te voorkomen. Een ervaren onderzoeker kan meestal kiezen ~ 12 kolonies per plaat P150. </li><li> Incubeer plaat bij 37 ° C gedurende 5-10 minuten tot de cellen los te maken van de plaat en verschijnen rond. </li><li> Voor elke kolonie: Pipetteer 10 ul van trypsine op de kolonie, en op en neer een paar keer pipet om cellen van de plaat los te maken. Dan pipet alle cellen van de kolonie in een goed in een 24 goed gerecht. </li> &lt;li&gt; Na een stabiele kolonies zijn gegroeid, eiwit expressie van elke kolonie wordt geanalyseerd met behulp van standaard western blot en immunofluorescentie. Vouw deze cellijnen voor verdere analyse. </li></ol> 2. Oppervlakte modificatie van glazen bodem schaal voor optimale collageen binding (optioneel) <ol><li> Om silaniseren het glas, pipet 300 ul van 2% 3-aminopropyltrimethoxysilaan oplossing op het glazen gedeelte van elk p35 schotel met een 10 mm opening. Zie figuur 1 voor de silanisatie en cross-linking schema. 3-aminopropyltrimethoxysilaan wordt verdund in gefilterd water. </li><li> Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Aspireren van de 3-aminopropyltrimethoxysilaan oplossing en wassen met gefilterd water drie keer voor 10 minuten elk. </li><li> Aspireren uit het water en zet gerechten op hete plaat ingesteld op 50 ° C gedurende 1,5 uur. Plaats toppen van de gerechten een beetje uit de schotel, zodat vocht in de schotel kan ontsnappen. </li><li> Verwijder de gerechten van het vuur en laat cool. </li><li> Pipetteer 300 ul van 2% glutaaraldehyde-oplossing op de glazen gedeelte van elk gerecht. De glutaraldehyde wordt verdund in PBS. </li><li> Incubeer gedurende 1 uur. </li><li> Aspireren de glutaaraldehyde oplossing en afwassen met PBS drie keer voor 10 minuten elk. </li><li> Steriliseren gerechten door blootstelling aan UV-licht gedurende 1 uur. De gesilaniseerd gerechten worden bewaard bij kamertemperatuur. </li></ol> 3. De voorbereiding van 3D collageen gel met tracer deeltjes <ol><li> Was fluorescerende tracer deeltjes door te stoppen met draaien 100 ul op voorraad tracer deeltjes (10 10 deeltjes / ml) in een centrifuge bij 15.000 rpm gedurende 5 minuten, aspiratie uit vloeibaar, en voeg 500 ul van de media. Herhaal dit vijf keer. Na de laatste wasbeurt, opnieuw in suspensie deeltjes in 30 pi van media. </li><li> Trypsinize GFP tot expressie brengen zoals gewoonlijk. </li><li> Resuspendeer celpellet tot ongeveer 2 x 10 6 cellen / ml. </li><li> Pipetteer 240 ul van de groei media in een eppendorfbuisje. </li><li> Voeg 12,6 ul van 1 M Hepes, 20 ul van gefilterd water, 50 ul van cel-oplossing, dan is 10 ul van fluorescerende deeltjes. </li><li> Voeg ten slotte 167 pl van runderen dermis Collageen I-oplossing (een werkend concentratie van 1 mg / ml te verkrijgen). </li><li> Grondig te mengen oplossing, dan pipet 80 ul van de oplossing op het glazen gedeelte van de gesilaniseerd glazen bodem schaal. </li><li> Plaats schotel in de couveuse en laat de gel polymeriseren bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Zie figuur 1A voor typische collageen gel in een p35 glazen bodem schaal. </li><li> Zorgvuldig Voeg 2 ml van de groei media bij elk gerecht. </li></ol> 4. Procedure voor time-lapse beeldacquisitie <ol><li> Zet de temperatuur van de microscoop behuizing en laat de mogelijkheden kamer evenwicht tot een steady-state temperatuur tot 37 ° C. Zie figuur 2 voor een voorbeeld van live-cell imaging systeem. </li><li> Verander media naar de nieuwe media aangevuld met 25 mM Hepes tot een neutrale pH-waarde te behouden. VoorDIC imaging, wisselen de bovenkant van de schotel met een dat een glazen blad heeft. Met behulp van een dunne strook van parafilm, bedek de zijkant van de schotel naar media verdamping te voorkomen. </li><li> Voor een olie-immersie objectief, plaats een druppel immersie vloeistof op de doelstelling. </li><li> Zet de collageen-gel met schotel op microscoop het podium, en zorg ervoor dat de schotel contact maakt met de onderdompeling vloeistof. </li><li> Focus van het monster en zoeken naar cellen van belang om de afbeelding. Te minimaliseren stadium drift, laat schotel om voor ongeveer 45 minuten rusten vóór het begin van een lang vast te leggen. </li><li> Specificeer de parameters van het beeld acquisitie. Een minimum te beperken laserbelichting, waardoor schade aan de cellen, door het moduleren van het laservermogen, belichtingstijd, frequentie en duur van de tijd vast te leggen. De werkelijke parameters zal variëren met de microscoop systeem en celtype. </li><li> Tijdens de time-lapse acquisitie, een remmer worden toegevoegd. Voor de inhibitor toevoeging experiment, niet afdichting de schotel met parafilm. <ol><li> Prepzijn Hepes media met drugs aangevuld met een gewenste werkende concentratie. </li><li> Als u klaar bent om drugsgebruik toe te voegen aan media, pauzeren het beeld vast te leggen, en zorgvuldig de schotel boven te verwijderen zonder de schotel. </li><li> Aspireren van de media in de schotel, en het pipet het geneesmiddel bevattende media in de schaal. Vervolgens vervang voorzichtig de schotel top. </li><li> Het monster kan out-of-focus als gevolg van de toevoeging van nieuwe media, stel de focus. </li><li> Start de capture, dan is toezicht op de vast te leggen voor de volgende 30 minuten, en stel de focus indien nodig. Zie afbeelding 4 voor een voorbeeld van drugsverslaving experiment. </li></ol></li></ol> 5. FRAP procedure en analyse <ol><li> De FRAP setup varieert tussen systemen, volg dan de fabrikant instructies. </li><li> Parameters instellen voor live-cell imaging. </li><li> Parameters instellen voor fotobleken. Gebruik voldoende laservermogen de fluorescerende signaal photobleach zonder beschadiging van de cel. Test deze parameters op de praktijk cellen. </li><li> Start beeld vast te leggen, en laat minstens 5 frames van het beeld vast te leggen voordat fotobleken de regio van belang. </li><li> Verder vast te leggen, en herstel de tijd moet voldoende zijn om de volledige fluorescentie herstel vast te leggen. Zie figuur 5 voor een voorbeeld van FRAP experiment. </li><li> Analyseer de fluorescentie herstel door het meten van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de photobleached gebied (voor en na fotobleken) in de tijd. Met behulp van een statistische analyse software (bijv. Excel), past het herstel curve om de exponentiële vergelijking: I = I f (1-e-kt), waar ik is de intensiteit, I f is de uiteindelijke intensiteit, t is tijd, en τ ½ is de tijd die nodig is om de intensiteit te bereiken de helft van de uiteindelijke waarde: τ ½ = ln (2) / k. De half-time is een maat voor de snelheid van de mobiliteit van het eiwit. </li><li> Het verkrijgen van de parameters, half-time en de uiteindelijke intensiteit van de exponentiële curve-fit. Bereken ee mobiele fractie door het nemen van de verhouding van de finale om de eerste fluorescentie-intensiteiten. </li></ol> 6. Representatieve resultaten Een voorbeeld van de live-cell imaging van gezonde epitheelcellen binnen de matrix is ​​weergegeven in figuur 3. Gezonde cellen vertonen een soepele, ononderbroken membraan, en duidelijke kern, terwijl de ongezonde cellen hebben vaak een verstoord membraan, en een te groot aantal vacuolen. In een 3D-matrix, een epitheliale cellen migreren 1, en ​​in de loop van enkele dagen, epitheelcellen vormen drie-dimensionale, bolvormige, multi-cellulaire cysten in de matrix 2. De cellen zijn ook zeer dynamisch, en migreren binnen de cyste (figuur 3). De matrix vervorming als gevolg van de trekkrachten uitgeoefend door migrerende cellen wordt geanalyseerd door de verplaatsing van de tracer deeltjes ingebed in de omringende matrix (figuur 4). De tracer deeltje bewegingen worden weergegeven als een maximale projectie beeld van de verschillenlende tijdstippen, en elk tijdstip is pseudo-gekleurd om aan te geven van de tijd (Figuur 4B). Als alternatief worden de beelden van een individuele tracer deeltje weergegeven als een montage van de beweging van de tracer deeltje in de tijd (figuur 4C) te tonen. Alle beeldanalyse werd gedaan met behulp van ImageJ. Deze kwalitatieve beoordeling van de matrix vervorming, en dus de krachten uitgeoefend door migrerende cellen, zijn nuttige eerste aanpassing van de trekkracht distributie. De kwantitatieve schatting van de trekkrachten uitgeoefend door migrerende cellen in 3D valt buiten het bestek van dit protocol en wordt elders 3,4 beschreven. Een typische fluorescentie herstel na fotobleken experiment is weergegeven in figuur 5. De regio van de rente moet worden photobleached met behulp van laser geoptimaliseerde instellingen, zodat de fluorescentie-intensiteit zichtbaar is verminderd ten opzichte van achtergrondniveaus (om signaal-ruisverhouding te maximaliseren), met behoud van gezonde cellen en onbeschadigd. De optimale instelling moet be empirisch bepaald als elke FRAP setup is anders (bijvoorbeeld FRAP met behulp van laser-scanning confocale systeem). De belichting en de time-interval van de post-FRAP beeldacquisitie moeten zorgvuldig worden gecontroleerd op de achtergrond fotobleken te voorkomen. Het gebruik van lagere laservermogen, korte belichtingstijd, en het gebruik van gevoelige camera en een hoge efficiënte optieken zijn essentieel voor een hoge kwaliteit FRAP beeldvorming. Als de fluorescentie bleken tijdens de afbeelding overname groot is, moet deze achtergrond vervagen worden gekwantificeerd en genormaliseerd uit de waargenomen fluorescentie-intensiteit herstel. Vanwege de aard van de 3D-omgeving, kan de z-component van de fluorescentie-intensiteit het herstel significant worden. Daarom is het belangrijk om een ​​photobleached volume te definiëren door het nemen van pre-en post 3D-stapel beelden van photobleached regio. Verdere analyse en modellering van fluorescentie herstel wordt elders 5,6 besproken. De unieke combinatie van live-cell imaging techniques: GFP aan de dynamiek van cytoskeleteiwitten, rode fluorescentie tracer deeltjes volgen om de matrix vervorming, en de toevoeging van remmers monitor, tegelijkertijd kan worden gebruikt voor de analyse van eiwit dynamiek, trekkracht en moleculaire pathways. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig1.jpg" /> Figuur 1. Voorbereiding van de collageen-gel. A) gepolymeriseerd collageen matrix op een glazen bodem schaal. De roze kleur van de gel is te wijten aan embedded fluorescerende deeltjes. B) Procedure om de glazen bodem gerechten te trakteren op het collageen gel verknopen met het glasoppervlak. Eerst wordt de glazen bodem schaal behandeld worden met 3-aminopropyltrimethoxysilaan oplossing, dan glutaaraldehyde oplossing die de collageen matrix verknopingen op het glas. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig2.jpg" /> Figuur 2. Schema&#39;s van de confocale / FRAP microscoop setup. De confocalemicroscoop is gebaseerd op een Zeiss AxioObserver met een CoolSNAP HQ II CCD-camera en volledig geautomatiseerd door Slidebook software (Intelligent Imaging Innovations). De confocale unit is op maat ontworpen en op basis van Yokogawa draaiende schijf unit CSU10 en twee solid-state lasers (488 nm met 50 mW en 561 nm met 40 mW) met acousto-optische Tunable Filter (AOTF) om milliseconden schakelen tussen twee lasers mogelijk te maken. De emissie filters zijn 525/50 nm en 620 / 60 nm (# 118661 en # 118085, Chroma Technology) en dichroïde spiegel is 488-568 BrightLine Dual band (Semrock). De doelstellingen zijn een lange werkafstand 40x C-Apochromat objectief met NA 1.1 en werkafstand van 0,62 mm, en een 63x Plan-Apochromat objectief met NA 1.4 en een werkafstand van 0,19 mm. De microscoop bevat ook een FRAP photoablation systeem dat bestaat uit een vezel optisch gepompte kleurstof laser, een computergestuurde straal positie en intensiteit, en een diffractie beperkte spotgrootte. Verder is de microscoop uitgerust met eeneen XY-gemotoriseerde stadium dat 0,1 micron lineaire encoders op elke as omvat. Tijdens de time-lapse imaging, is de omgevingstemperatuur onderhouden door een op maat ontworpen microscoop kamer en een verwarming met een terugkoppeling temperatuurregeling. Te isoleren geen lawaai en trillingen, het hele microscoop systeem is op een trillingsvrij tafel. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig3.jpg" /> Figuur 3. Live cell imaging van epitheliale cellen die GFP-actine. Deze cellen vormen een cyste na 4 dagen van de cultuur in een 3D-collageen matrix. Sommige cellen bewegen langs het oppervlak van de cyste (gele pijlpunt), terwijl anderen migreren in het interieur van de cyste (rode pijlpunt). Schaalbalk 10 micrometer, de tijd in uren. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig4.jpg" /> Figuur 4. Het effect van Rho-kinase remming op trekkracht. A) DIC beeld van een migrerende cel te drukken MDCK GFP getagd nucleaire marker. Het beeld werd direct voor de behandeling van Rho-kinase remmer Y-27632. Schaalbalk 10 urn. B) Particle verplaatsing als gevolg van de toevoeging van Y-27632. Het deeltje posities op verschillende tijdstippen (0 - 52 min.) waren pseudo-gekleurd volgens de intensiteit schaal, vervolgens geprojecteerd op een enkel beeld. De witte regio is de GFP-positieve kern in de migrerende cellen. Schaalbalk 10 urn. De tijd in minuten. C) Het deeltje beweging aan de achterrand van de cel (zie pijl in B). Asterisk duidt op de laatste frame gevangen voor de Y-27632 toevoeging. De tracer deeltje verplaatst naar en uit de buurt van de achterrand van de migrerende cellen voor en na de toevoeging van Y-27.632, respectievelijk. Schaalbalk 1 micrometer. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig5.jpg" /> Figuur 5. FRAP analyse van de GFP-actine-expressie cel migreren in een drie-dimensionale matrix. A) Time-lapse beelden van de GFP-actine uitdrukken cel van voor en na de fotobleken. Een klein deel van de GFP-actine opgebouwd op de mobiele achterzijde was photobleached (rode pijl) op tijdpunt 0. Tijd in seconden, schaalbalk 5 micrometer. B) De gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de photobleached regio (vaste lijn), en de exponentiële fit van de fluorescentie herstel (cirkels) uitgezet in de tijd. De fluorescentie-intensiteit werd genormaliseerd tot de initiële waarde vóór fotobleken.

<ol><li>Shih, W., Yamada, S., Myosin, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dependent+retrograde+flow+drives+3D+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">A dependent retrograde flow drives 3D cell migration.</a> Biophys. J. 98 (8), L29-L31 (2010).</li>
<li>O'Brien, L. E., Yu, W., Tang, K., Jou, T. S., Zegers, M. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+biochemical+analysis+of+Rac1+in+three-dimensional+epithelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Morphological and biochemical analysis of Rac1 in three-dimensional epithelial cell cultures.</a> Methods Enzymol. 406, 676-691 (2006).</li>
<li>Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+in+three-dimensional+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices.</a> Nat. Methods. 7 (12), 969-971 (2010).</li>
<li>Del Alamo, J. C., Meili, R., Alonso-Latorre, B., Rodriguez-Rodriguez, J., Aliseda, A., Firtel, R. A., Lasheras, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+analysis+of+eurkaryotic+cell+motility+by+improved+force+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal analysis of eurkaryotic cell motility by improved force cytometry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (33), 13343-13348 (2007).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).</li>
<li>Phair, R. D., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+modeling+approaches+to+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetic modeling approaches to in vivo imaging.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (12), 898-907 (2001).</li>
<li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312 (5771), 217-224 (2006).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Hier beschrijven we een methode voor het gebruik van live-cell imaging om de mechanismen van de cel migratie onderzoek in een drie-dimensionale matrix. Het succes van deze techniek is afhankelijk van het verkrijgen van &quot;goede&quot; klonen stabiel uiten van GFP-gelabelde eiwitten. Het lage niveau van GFP eiwitten vergt een teveel excitatie blootstelling die cel gezondheid van compromissen, terwijl een te hoge GFP niveau hebben ongewenste neveneffecten op de cel. Zo is de vector keuze om genen in cellen te transfecte...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Collageen, runderen, Type I </td><td> BD Biosciences </td><td> 354231 </td><td> Voorraad is ongeveer 3 mg / ml </td></tr><tr><td> 3-aminopropyltrimethoxysilaan </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 281778 </td><td> Verdunnen in water </td></tr><tr><td> glutaraldehyde </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 340855 </td><td> Verdund in PBS </td></tr><tr><td> 1M Hepes </td><td> Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> Fluospheres polystyreen microsferen een micrometer, rode fluorescentie (580/605) </td><td> Invitrogen </td><td> F13083 </td><td></td></tr><tr><td> Geneticine (G418) </td><td> Invitrogen </td><td> 11811-031 </td><td></td></tr&gt; <tr><td colspan="4"> Cultuur media componenten: </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31600-034 </td><td></td></tr><tr><td> Foetaal Bovine Serum </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S115500 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilline / streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Kanamycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15160-054 </td><td></td></tr></tbody></table>

live-cell imaging van het migreren van cellen die fluorescent-gemerkte eiwitten in een drie-dimensionale matrix

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditioneel is celmigratie onderzocht op twee-dimensionale, stijve kunststof oppervlakken. Echter, tijdens belangrijke biologische processen zoals wondgenezing, weefselregeneratie en kanker metastase, moeten cellen navigeren door complexe, driedimensionale extracellulaire weefsel. Om beter te begrijpen van de mechanismen achter deze biologische processen, is het belangrijk te onderzoeken of het rollen van de eiwitten die verantwoordelijk zijn voor het rijden celmigratie. Hier schetsen we een protocol om de mechanismen van celmigratie het gebruik van de epitheel cellijn (MDCK) te bestuderen, en een drie-dimensionale, vezelig, self-polymeriseren matrix als een modelsysteem. Dit optisch heldere extracellulaire matrix is ​​lastig om live-cell imaging studies en een betere bootst de fysiologische, weke delen omgeving. Dit rapport toont een techniek voor het direct visualiseren eiwit lokalisatie en dynamiek, en de vervorming van de omringende drie-dimensionale matrix. Tentamenzoek van eiwit lokalisatie en dynamiek tijdens de cellulaire processen biedt belangrijke inzicht in de eiwit-functies. Genetisch gecodeerd fluorescerende labels bieden een unieke methode voor de waarneming eiwit lokalisatie en dynamiek. Met deze techniek kunnen we de subcellulaire accumulatie van de belangrijkste te analyseren, kracht-genererende cytoskelet componenten in real-time als de cel manoeuvres door de matrix. Daarnaast is het gebruik van meerdere fluorescerende labels met verschillende golflengten, kunnen we de lokalisatie van meerdere eiwitten tegelijk, waardoor we, test bijvoorbeeld of verschillende eiwitten gelijkaardige of uiteenlopende rollen. Bovendien kan de dynamiek van fluorescent gelabelde eiwitten worden gekwantificeerd aan de hand Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analyse. Deze meting assays het eiwit mobiliteit en hoe stabiel de eiwitten gebonden zijn aan het cytoskelet-netwerk. Door de combinatie van live-cell imaging met de behandeling van eiwit functie-remmers,kunnen we nagaan in real-time de veranderingen in de verdeling van eiwitten en de morfologie van migrerende cellen. Verder hebben we ook combineren live-cell imaging met het gebruik van fluorescerende tracer deeltjes ingebed in de matrix van de matrix vervorming te visualiseren tijdens de celmigratie. Zo kunnen we visualiseren hoe een migrerende cel kracht-genererende eiwitten verdeelt, en waar de trekkrachten worden uitgeoefend met de omringende matrix. Door middel van deze technieken, kunnen we waardevol inzicht te krijgen in de rol van specifieke eiwitten en hun bijdragen aan de mechanismen van de cel migratie.

Cellulaire processen zoals celmigratie van oudsher bestudeerd op twee-dimensionale, stijve kunststof oppervlakken. Dit rapport beschrijft een techniek voor het direct visualiseren eiwit lokalisatie en het analyseren van eiwitten dynamiek in cellen migreren in een meer fysiologisch relevante, drie-dimensionale matrix.

Live-cell imaging van het migreren van cellen die fluorescent-gemerkte eiwitten in een drie-dimensionale Matrix

Traditioneel is celmigratie bestudeerd op tweedimensionale, stijve plastic oppervlakken. Echter, tijdens belangrijke biologische processen zoals wond...

Deze demonstratie heeft tot doel fluorescent gelabelde eiwitten in levende cellen binnen een 3D-matrix te beelden. Genereer eerst stabiele cellijnen die fluorescent gelabelde eiwitten tot expressie brengen. Zaai deze cellen uit in een 3D-collageenmatrix en maak vervolgens time-lapsebeelden van migrerende cellen met behulp van een confocale microscoop.Uiteindelijk werpen de resultaten licht op de lokalisatie en dynamiek van eiwitten binnen migrerende cellen via time-lapse imaging en FP-analyse, waarbij de dynamiek en lokalisatie van eiwitten in 3D en in real-time worden waargenomen. Dit biedt een methode om fundamentele vragen over celmigratie te beantwoorden. Bijvoorbeeld: hoe worden adhesiecontacten gereguleerd door cytoplasmatische eiwitten?En daarna hoe deze contacten worden verstoord door specifieke inhibitoren. Kweek cellen in een P 35-schaal tot een confluentie van 80 tot 90% en transfecteer de cellen met het plasmide van belang met behulp van Lipo 2000 volgens de instructies van de fabrikant. Plaats de cellen vervolgens in een incubator.Splits de volgende dag de cellen over twee P one 50 Petri-schalen en incubeer deze een nacht. Vul het medium aan met 50 µg/mL G four 18. Zet

live-cell-imaging-migrating-cells-expressing-fluorescently-tagged

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Modellen van de tumorcel invasie in drie-dimensionale extracellulaire matrix beter aansluiten bij...

Modeling and Imaging 3-Dimensionale Collectief Cell Invasion

Werkwijze voor de montage van lijm en oplosbaar gradiënten in een kamer microscopie voor levende celmigratie studies beschreven. De kunstmatige omgeving combineert aangroeiwerende oppervlakken en lijm tracks met oplossing hellingen en daarom maakt het mogelijk om te bepalen van het relatieve belang van begeleiding cues.

Het maken van lijm en Oplosbare verlopen for Imaging Cell Migration met fluorescentie microscopie

Dit artikel behandelt een methode om fluorescerend label collageen dat verder kan worden gebruikt voor zowel vaste en levende beeldvorming van 3D celculturen. Wij bieden ook een geoptimaliseerd protocol om endogene cytoskeleteiwitten van cellen gekweekt in 3D-omgevingen te visualiseren.

Het openbaren van de organisatie van het cytoskelet van invasieve kankercellen in 3D

Combinatorische 5 fluorescerende eiwitten markering van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen maakt in vivo klonale volgen via confocale en twee-foton microscopie, het verstrekken van inzicht in het beenmerg hematopoietische architectuur tijdens de regeneratie. Deze methode maakt het mogelijk niet-invasieve lot in kaart brengen van spectraal-gecodeerde HSPCs-afgeleide cellen in intacte weefsels voor langere perioden na de transplantatie.

In vivo Klonale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen Gekenmerkt door Five fluorescerende eiwitten met behulp van confocale microscopie en Multiphoton

Celmigratie is een biologisch verschijnsel dat betrokken is bij een overvloed aan fysiologische, zoals wondgenezing en immuunreacties en pathofysiologische processen, zoals kanker. De 3D-matrix van collageen migratie assay is een veelzijdig instrument om de trekkende eigenschappen van verschillende celtypes te analyseren binnen in een 3D-fysiologische-achtige omgeving.

Analyse van cel-migratie binnen Driedimensionale Collagen Matrix

De mechanische eigenschappen en de microstructuur van de extracellulaire matrix sterk beïnvloeden 3D migratie van cellen. Een in vitro werkwijze om de tijdruimtelijk celmigratie gedrag biofysisch variabele omgevingen zowel bevolking en afzonderlijke cel niveaus, gaande beschreven.

Concentrische Gel Systeem om de biofysische rol van matrix Microenvironment op 3D-Cell Migratie Bestudeer

Door celtransplantatie, cytoskelettenlabeling en verlies/winst van functiebenaderingen te combineren, beschrijft dit protocol hoe de migrererende zebravis prospectieve prechordale plaat kan worden gebruikt om de functie van een kandidaatgen in in vivo celmigratie te analyseren.

analyseren<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Migratie behulp Cell Transplantaties en Time-lapse Imaging in zebravis embryo&#39;s

Hier presenteren we een protocol om te visualiseren van immune cellen die zijn ingesloten in een matrix van de driedimensionale (3D) collageen met behulp van licht vel microscopie. Dit protocol wordt ook ingegaan hoe bijhouden van cel migratie in 3D. Dit protocol kan worden gebruikt voor andere soorten schorsing cellen in de 3D-matrix.

Licht vel microscopie voor driedimensionale visualisatie van menselijke Immune cellen

Het huidige protocol beschrijft een geïntegreerde methode onderzoek naar kanker cel migratie en invasie op één platform in real-time, het verstrekken van een gemakkelijk reproduceerbaar zijn en tijd-efficiënte optie te bestuderen van de cel mobiliteit en morfologie.

Een eenvoudige migratie/invasie Workflow met behulp van een geautomatiseerde Live-cel Imager

Deze studie presenteert een protocol van live-3D-cel immunocytochemie toegepast op een pediatrische diffuse midline glioom cellijnlijn, nuttig om in real-time de expressie van eiwitten op het plasmamembraan te bestuderen tijdens dynamische processen zoals 3D-celinvasie en migratie.

Live-3D-cel immunocytochemie Assays van pediatrische diffuse middellijn glioom

We beschrijven confocale beeldvormings- en volgpijplijnen toegepast op twee rapportagestrategieën: mozaïekorganoïden voor het oplossen van individueel celgedrag en lotsreporterorganoïden voor het monitoren van celtypeovergangen in menselijke en muis-intestinale organoïden.

Levende-cel beeldvorming en single-cel tracking om klonale dynamiek en lotsovergangen in menselijke en muisachtige intestinale organoïden te monitoren

Leer live-cell imaging van fluorescerend-gemerkte eiwitten in migrerende cellen binnen een 3D-collageenmatrix. Deze methode onthult eiwitdynamica en lokalisatie in real-time voor celmigratieonderzoek.

Live-cell imaging van het migreren van cellen die fluorescent-gemerkte eiwitten in een drie-dimensionale Matrix

Meer video's verkennen