Live-cell imaging van het migreren van cellen die fluorescent-gemerkte eiwitten in een drie-dimensionale Matrix

Deze demonstratie heeft tot doel fluorescent gelabelde eiwitten in levende cellen binnen een 3D-matrix te beelden. Genereer eerst stabiele cellijnen die fluorescent gelabelde eiwitten tot expressie brengen. Zaai deze cellen uit in een 3D-collageenmatrix en maak vervolgens time-lapsebeelden van migrerende cellen met behulp van een confocale microscoop.

Uiteindelijk werpen de resultaten licht op de lokalisatie en dynamiek van eiwitten binnen migrerende cellen via time-lapse imaging en FP-analyse, waarbij de dynamiek en lokalisatie van eiwitten in 3D en in real-time worden waargenomen. Dit biedt een methode om fundamentele vragen over celmigratie te beantwoorden. Bijvoorbeeld: hoe worden adhesiecontacten gereguleerd door cytoplasmatische eiwitten?

En daarna hoe deze contacten worden verstoord door specifieke inhibitoren. Kweek cellen in een P 35-schaal tot een confluentie van 80 tot 90% en transfecteer de cellen met het plasmide van belang met behulp van Lipo 2000 volgens de instructies van de fabrikant. Plaats de cellen vervolgens in een incubator.

Splits de volgende dag de cellen over twee P one 50 Petri-schalen en incubeer deze een nacht. Vul het medium aan met 50 µg/mL G four 18. Zet de kweek gedurende twee weken voort onder antibiotische selectie.

Inspecteer de kweek op G four 18-resistente kolonies. Identificeer en markeer vervolgens de GFP-positieve kolonies met behulp van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop.

Was de cellen tweemaal met PBS. Laat na de tweede wasbeurt een dunne laag vloeistof achter bij elke gemarkeerde kolonie om te voorkomen dat de cellen uitdrogen. Veeg zo dicht mogelijk rond de rand met een gesteriliseerd wattenstaafje en pipetteer 10 µL trypsine op de kolonie.

Herhaal dit snel voor elke kolonie. Incubeer de plaat vervolgens bij 37 °C voor het loslaten van de cellen. Verifieer het ronde uiterlijk onder een microscoop.

Voeg 10 µL trypsine toe aan elke kolonie en pipetteer deze om de cellen volledig van de plaat los te maken. Draag vervolgens elke celkolonie over naar een afzonderlijke put van een 24-well kweekplaat om stabiele kolonies te amplificeren. Evalueer daarna de eiwitexpressie van de kolonies middels een standaard western blot en immunofluorescentie.

Breid de geselecteerde cellijnen uit; voer de oppervlaktemodificatie van het glas uit. Een bodemschaaltje biedt een optimale collagenbinding. Pipetteer 300 µL silaniseringsoplossing op het glazen gedeelte van elke P 35 schaal met een opening van 10 mm.

Incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur. Zuig de oplossing af en was drie keer met gefilterd water gedurende telkens 10 minuten. Verwijder het water en plaats de schalen gedurende 1,5 uur op een warmteplaat van 50 °C.

Plaats de deksels iets verschoven op de schaaltjes om droging mogelijk te maken. Nadat de droge schaaltjes zijn afgekoeld, pipetteert u 300 µL van een 2% glutaraldehyde-oplossing op het glazen gedeelte van elk schaaltje. Incubeer gedurende één uur en was vervolgens 3 keer met PBS gedurende telkens 10 minuten.

Steriliseer de schaaltjes door ze gedurende één uur bloot te stellen aan UV-licht. Centrifugeer vervolgens 100 µL fluorescente tracer-deeltjes om een pellet te vormen. Verwijder het supernatant en resuspendeer de deeltjes in 500 µL medium.

Voer vijf wasbeurten uit en resuspendeer de partikels vervolgens in 30 µL medium. Oogst daarna de GFP-expresserende cellen met trypsine en bereid een suspensie van 2 miljoen cellen per milliliter in een eppendorfbuisje. Pipetteer 240 µL groeimedium. Voeg 12,6 µL van één molaire HEPES, 20 µL gefilterd water, 50 µL celoplossing en 10 µL van de fluorescerende partikels toe.

Voeg tot slot 167 µL runderdermiscollageen toe en meng de oplossing grondig. Breng nu 80 µL over naar het glazen gedeelte van de voorbehandelde gesilicatiseerde schaal. Incubeer 50 minuten bij 37 °C zodat de gel kan polymeriseren.

Voeg vervolgens voorzichtig twee milliliter groeimedium toe. Laat de microscoopkamer equilibreren naar een stabiele temperatuur van 37 °C en vul het celmedium aan. Om een neutrale pH te behouden voor DIC-imaging, vervangt u de bovenkant van de schaal door een glazen bodem met een dunne strip parafilm.

Dek de zijkant van de schaal af om verdamping te voorkomen voor een olie-immersie-objectief. Plaats één druppel immersievloeistof op de positie van het objectief. Plaats de schaal met de collageengel op de objecttafel van de microscoop, zodat de schaal in contact komt met de immersievloeistof.

Stel het monster scherp en zoek naar de cellen van belang die u wilt afbeelden om drift van de tafel te minimaliseren. Laat het schaaltje ongeveer 45 minuten rusten. Specificeer vóór het starten van een lange opnameserie de parameters voor de beeldacquisitie voor experimenten met de toevoeging van inhibitoren.

Bereid gesupplementeerd medium voor met het geneesmiddel in de gewenste werkconcentratie. Vul het celmedium aan om een neutrale pH te handhaven, maar verzegel dit niet met perfil. Breng het monster over naar de microscoop en start met de beeldvorming op het moment van de behandeling met het geneesmiddel.

Pauzeer het beeld, pak de bovenkant van de schaal vast en verwijder deze voorzichtig zonder de schaal te verstoren. Aspireer het medium en pipetteer het medium met het geneesmiddel in de schaal. Plaats vervolgens de bovenkant van de schaal voorzichtig terug.

De opstelling voor top FRAP varieert per systeem. Raadpleeg daarom de instructies van de fabrikant. Stel eerst de parameters in voor live-cell imaging.

Voor fotobleken. Test deze parameters op oefencellen om voldoende laservermogen te verkrijgen om het fluorescentiesignaal te fotobleken zonder de cel te beschadigen. Start vervolgens de beeldopname van het monster en verzamel ten minste vijf frames.

Bleek vervolgens het interessegebied door fotobleken. Ga door met het vastleggen van beelden gedurende de hersteltijd. Meet de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van het gefotobleekte gebied vóór en na het fotobleken in de loop van de tijd, met behulp van software voor statistische analyse.

Pas de herstelcurve aan op de exponentiële vergelijking. Bepaal de parameters voor de halveringstijd en de uiteindelijke intensiteit op basis van de exponentiële fitcurve. Bereken vervolgens de mobiele fractie door de verhouding tussen de uiteindelijke en de initiële fluorescentie-intensiteiten te bepalen.

Deze 3D-beelden van levende cellen tonen gezonde epitheelcellen die GFP-actine tot expressie brengen. Na vier dagen cultuur vormden deze cellen een cyste in een 3D-collageenmatrix. Sommige cellen migreerden over het oppervlak van de cyste, terwijl andere migreerden binnenin de cyste.

Matrixdeformatie als gevolg van de tractiekrachten die worden uitgeoefend door migrerende cellen, wordt geanalyseerd via de verplaatsing van tracerdeeltjes die in de omringende matrix zijn ingebed. Het effect van RO-kinase-inhibitie op de tractiekracht wordt hier getoond. De bewegingen van de tracerdeeltjes worden weergegeven als een maximumprojectiebeeld van verschillende tijdspunten, waarbij elk tijdspunt is voorzien van een pseudokleur.

Als alternatief worden de beelden van een individueel tracerdeeltje weergegeven als een montage om de beweging van het tracerdeeltje te tonen. In de loop van de tijd bewoog dit tracerdeeltje zich respectievelijk naar en weg van de achterzijde van de migrerende cel vóór en na de toevoeging van Y 2 7 6 3 2. De FRAP-analyse volgt cellen die GFP-actine tot expressie brengen terwijl ze migreren in een driedimensionale matrix, wat een typisch fluorescentieherstel aangeeft. Na een fotoblekingexperiment met geoptimaliseerde laserinstellingen is de fluorescentie-intensiteit van het gebied van interesse zichtbaar afgenomen vergeleken met het achtergrondniveau, terwijl de cellen gezond en onbeschadigd blijven.

Deze grafiek toont de passing van de herstelcurve met een exponentiële functie. Zodra de techniek onder de knie is, kan het zaaien van de cellen in de matrix een uur duren. Vergeet niet dat werken met drie amino propyl trimethyl extreem gevaarlijk kan zijn.

Neem daarom voorzorgsmaatregelen, zoals het werken in de zuurkast. Denk er daarnaast aan om steriele omstandigheden te handhaven bij het werken met cellen in een 3D-matrix.