Name: Amide waterstof / deuterium Exchange en MALDI-TOF-massaspectrometrie Analyse van de Pak2 Activering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Leer waterstof/deuterium-uitwisseling bij Pak2-activering met MALDI-TOF-massaspectrometrie. Deze methode onthult structurele dynamiek en conformatieveranderingen van eiwitkinasen voor therapeutisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund in een deel van de National Institutes of Health Grant GM-26738 (tot JAT).

1. Pak2 Activering <ol><li> Voeg de juiste vooraf geteste hoeveelheid van caspase 3 tot 20 pl van 12 mg / ml Pak2 in buffer A (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM DTT en bij pH 7,5) en incubeer bij 34 ° C gedurende 30 min volledig te splitsen en te activeren Pak2. </li><li> Analyseer de splitsing producten door SDS-PAGE (10%) en Coommassie blauwe vlekken. </li><li> Voeg de gesplitste Pak2 om de activering buffer B (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 15 mM MgCl2, 10 mM ATP) bij pH 7,5, in 20 ul tot een uiteindelijke concentratie van 10 mg / ml Pak2, en incuberen bij 34 ° C gedurende 30 minuten volledig te activeren Pak2 door autofosforylatie op 8 locaties. </li><li> Bevestigen volledige splitsing van Pak2 door migratie van de p34 en p27 fragmenten, zoals bepaald door SDS-PAGE 10. Een degelijke controle van de autofosforylatie voorwaarden wordt via autoradiografie in een apart experiment met behulp van (32 P) ATP of massa spectrometrie aan fosfopeptiden op te sporen. </li></ol> 2. Identificatievan Pepsine-bundel Pak2 Fragments <ol><li> Voeg 1 ml van 0,1% Trifluroacetic Acid (TFA) bij pH 2,5 tot de agarose parels wassen twee keer voorafgaand aan gebruik. Dan, centrifuge de monsters gedurende 15 sec bij 2000 xg om de kralen te verwijderen. </li><li> Voeg Pak2 (20 pg in 2 ui 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl en 2 mM DTT bij pH 7,5) tot 100 pi van 0,1% TFA, en incubeer het monster gedurende 5 min met 30 pi van pepsine-geconjugeerde agarose parels . </li><li> Equilibreren een omgekeerde fase HPLC C18 kolom met een primair oplosmiddel systeem van 0,1% TFA bij pH 2,5. De pepsine te verteren (50 ul) is geëlueerd met een lineaire 100-min gradiënt van 0 - 80% acetonitril met 0,1% TFA bij een debiet van 0,2 ml / min. Fracties worden verzameld om de 2 minuten. </li><li> Droog de HPLC-fracties met een snelheid-Vac (3 uur) en resuspendeer de monsters in een oplossing van acetonitril (5 pl) en 0,1% TFA (5 pi) bij pH 2,5. </li><li> In eerste instantie wordt elke fractie gescreend op peptiden met behulp van de MALDI-TOF PerSeptive Biosystems Voyager DE STR (PE Biosystems, Foster City, CA, USA). </li><li> De 16 fracties die peptiden worden onderworpen aan tandem massaspectrometrie met behulp van een Q-TOF massaspectrometer en een QStar XL oMALDI MS / MS om de fragmenten te identificeren. </li><li> De volgorde van elk peptide wordt gecontroleerd door het product ionen gegenereerd door de tandem massaspectrometrie met de theoretische m / z ratio&#39;s gebaseerd op de primaire sequentie van Pak2 het gebruik van de Protein Prospector website ( <a href="http://prospector.ucsf.edu/">http://prospector.ucsf.edu/</a> ) 11. </li></ol> 3. Meting van Amide H / D Exchange <ol><li> Houd alle oplossingen en reagentia die nodig zijn voor H / D wisselen bij 25 ° C in een waterbad. ATP is opgelost in water en de pH wordt aangepast tot 7,0 voorafgaand aan gebruik. De extra 4mm ATP in de D 2 O buffer is om ATP te voorkomen dat los te zien van Pak2 na verdunning. </li><li> Initiëren H / D uitwisseling door toevoeging van 18 ul van gebufferde D 2 O (50 mM MOPS pH 6,98, 125 mM NaCl) tot en met 2 pl (20 pg) Van Pak2 in een buffer die 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) en 2 mM DTT, wat resulteert in een Pak2 niveau van 10 mg / ml en een pH van 7,0 bij 0 ° C. </li><li> Incubeer de monsters in drievoud in de H / D ruilen voor 0, 0,5, 1, 3, 5 en 10 minuten, of 24 uur </li><li> Quench de H / D wisselen proces door toevoeging van 180 ul ijskoude 0,1% TFA bij pH 2,2, die de pH brengt 2,5 in een eindvolume van 200 ul. Voor de monsters met ATP, 180 ul ijskoude 0,11% TFA bij pH 2.2 is gebruikt om de pH op 2,5 in de gedoofd conditie te houden. </li><li> Voeg een hoeveelheid (100 pi) van elk uitgeblust monster 30 pi van geactiveerde pepsine-geconjugeerd agarose parels. De pepsine spijsvertering mag gaan op ijs gedurende vijf minuten en de monsters zijn gevortexed elke 30 sec. </li><li> Beëindig de vertering door middel van centrifugeren van het monster gedurende 15 sec bij 5000 xg bij 4 ° C om de pepsine te verwijderen. </li><li> Snel bevriezen de monsters in vloeibare N 2 en bewaar bij -80 ° C voor niet meer dan 2dagen voorafgaand aan de MALDI-TOF-analyse. </li><li> De matrix voor de MALDI is 5 mg / ml van de α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) opgelost in een oplossing (01:01:01) acetonitril, ethanol en 0,1% TFA bij pH 2,5 en gehouden op 0 ° C. </li><li> Gedeeltelijk snel ontdooien elk monster en meng 1 pi van elk monster met 1 pi matrix en vlek op een 4 ° C MALDI richtplaat. </li><li> Breng een matig vacuüm om de plaat aan de vlekken in 30 sec droog voorafgaand aan de MALDI-TOF-analyse. De tijd tussen het ontdooien van het monster en spectrum ophalen is ongeveer 3 minuten. </li><li> Acquire MALDI-TOF massa spectra met een PerSeptive Biosystems Voyager DE STR. Te verwerven gegevens op een 2-GHz sampling rate op 100000 data kanalen, met een 20.000-V versnellen voltage, en een 65% netspanning met behulp van vertraagde extractie met een 180-ns puls vertraging. Honderd scans zijn gemiddeld in 2 minuten. De MALDI-TOF instrument is niet beperkt tot een merk of een bepaalde software. </li><li> Gebruik maken van de Data Explorer 4.0-computer programma om calculat de deuteration van elk fragment. </li><li> Bereken de rug uitwisseling op basis van de verhouding van de werkelijke opgenomen deuteron aantal op 24 uur van de H / D wisselen, gedeeld door alle mogelijke verwisselbare sites, die de ruggengraat amiden, behalve de N-terminale amide (figuur 1). </li></ol> 4. Representatieve resultaten: Het caspase decollete en autofosforylatie worden gecontroleerd door SDS-PAGE Commassie vlekken. Inactief Pak2 is een enkele band van 58 kDa. Caspase splitsing van Pak2 is voltooid, en produceert twee fragmenten, p27 en p34 die apart migreren. De migratie van autophosphorylated p27 en p34 toont een overlap op de gel als gevolg van de vertraagde migratie van de volledig gefosforyleerd p27 fragment (figuur 2). H / D uitwisseling experimenten worden uitgevoerd meerdere malen tussen de 0 en 10 min (figuur 3). Als voorbeeld, het tijdsverloop van deuterium opname in de m / ZPEAK 1697,85 van inactieve Pak2 bestaat uit meerdere isotopen pieken zoals blijkt uit de verschuiving van de massa envelop in de tijd. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig1.jpg" /> Figuur 1. Vergelijking voor de berekening van deuteration. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig2.jpg" /> Figuur 2. Autofosforylatie en caspase splitsing van Pak2. Caspase-gesplitst Pak2 (linkerbaan), intact inactief Pak2 (middelste rijbaan) en caspase-gesplitst autophosphorylated Pak2 (rechter rijbaan) werden geanalyseerd door SDS-PAGE en Coommassie blauwe vlekken. Aangepast van Hsu, YH et al. 2. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig3.jpg" /> Figuur 3. Massa spectrum van een tijdsverloop van deuterium incorporatie voor inactieve Pak2. Inactieve Pak2 werd onderworpen aan H / D exchaNSE voor 0-10 min en geanalyseerd door MALDI-TOF. Een voorbeeld van de uitgebreide isotopische verdeling van de MALDI-TOF van de peak m / z 1697,85 in het tijdsverloop van de H / D uitwisseling wordt getoond. De rode stippellijn geeft het gemiddelde van de massa-enveloppe en de verschuiving van de massa envelop toont de deuteration van een peptide.

<ol><li>Anand, G. S., Hughes, C. A., Jones, J. M., Taylor, S. S., Komives, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amide+H%2F2H+exchange+reveals+communication+between+the+cAMP+and+catalytic+subunit-binding+sites+in+the+R%28I%29alpha+subunit+of+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22A.+J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Amide H/2H exchange reveals communication between the cAMP and catalytic subunit-binding sites in the R(I)alpha subunit of protein kinase.</a> A. J. Mol. Biol. 323, 377-386 (2002).</li>
<li>Hsu, Y. H., Johnson, D. A., Traugh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+conformational+changes+during+activation+of+protein+kinase+Pak2+by+amide+hydrogen%2Fdeuterium+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of conformational changes during activation of protein kinase Pak2 by amide hydrogen/deuterium exchange.</a> J. Biol. Chem. 283, 36397-36405 (2008).</li>
<li>Englander, S. W., Kallenbach, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+exchange+and+structural+dynamics+of+proteins+and+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Q.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Hydrogen exchange and structural dynamics of proteins and nucleic acids.</a> Q. Rev. Biophys. 16, 521-655 (1983).</li>
<li>Katta, V., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+in+proteins+probed+by+hydrogen-exchange+electrospray-ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass. Spectrom. 5, 214-217 (1991).</li>
<li>Dennis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localizing+the+membrane+binding+region+of+Group+VIA+Ca2%2B-independent+phospholipase+A2+using+peptide+amide+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Localizing the membrane binding region of Group VIA Ca2+-independent phospholipase A2 using peptide amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> J. Biol. Chem. 284, 23652-23661 (2009).</li>
<li>Hsu, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+binding+rigidifies+the+C2+domain+and+the+intradomain+interaction+of+GIVA+phospholipase+A2+as+revealed+by+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Calcium binding rigidifies the C2 domain and the intradomain interaction of GIVA phospholipase A2 as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> J. Biol. Chem. 283, 9820-9827 (2008).</li>
<li>Lee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+hPAK65+by+caspase+cleavage+induces+some+of+the+morphological+and+biochemical+changes+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Activation of hPAK65 by caspase cleavage induces some of the morphological and biochemical changes of apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 13642-13647 (1997).</li>
<li>Rudel, T., Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+and+morphological+changes+in+apoptotic+cells+regulated+by+caspase-mediated+activation+of+PAK2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Membrane and morphological changes in apoptotic cells regulated by caspase-mediated activation of PAK2.</a> Science. 276, 1571-1574 (1997).</li>
<li>Roig, J., Traugh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytostatic+p21+G+protein-activated+protein+kinase+gamma-PAK%5BTitle%5D)+AND+%22Vitam.+Horm%22%5BJournal%5D)">Cytostatic p21 G protein-activated protein kinase gamma-PAK.</a> Vitam. Horm. 62, 167-198 (2001).</li>
<li>Walter, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+and+activation+of+p21-activated+protein+kinase+gamma-PAK+by+CPP32+%28caspase+3%29.+Effects+of+autophosphorylation+on+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cleavage and activation of p21-activated protein kinase gamma-PAK by CPP32 (caspase 3). Effects of autophosphorylation on activity.</a> J. Biol. Chem. 273, 28733-28739 (1998).</li>
<li>Clauser, K. R., Baker, P., Burlingame, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+accurate+mass+measurement+%28%2B%2F-+10+ppm%29+in+protein+identification+strategies+employing+MS+or+MS%2FMS+and+database+searching%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Role of accurate mass measurement (+/- 10 ppm) in protein identification strategies employing MS or MS/MS and database searching.</a> Anal. Chem. 71, 2871-2882 (1999).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Identificatie van de pepsine-bundel Fragments is een belangrijke stap van de H / D wisselen experiment. Onjuiste identificatie van de peptide kan leiden tot een verkeerde conclusie. Pepsine-verteerd Pak2 is geëlueerd door middel van een omgekeerde fase HPLC C18 kolom aan een schone achtergrond te verkrijgen. In onze experimenten, werden in totaal 40 fracties verzameld en onderworpen aan MALDI-TOF. Meerdere peptiden konden worden geïdentificeerd in elk van de fracties. De peptiden werden onderworpen aan tandem massaspectrometrie (Q-TOF-MS / MS en oMALDI MS / MS) om hun sequenties te identificeren. De MS / MS spectra van een peptide moeten ten minste drie product-ionen tot de identificatie van de peptide te bevestigen. De Data Explorer 4.0 computerprogramma (Applied Biosystems) voert de initiële uitgangswaarde correctie en ruis filtratie. Elk spectrum moet worden gekalibreerd op basis van twee opeenvolgende pieken. We kalibreren onze spectrum door de theoretische massa van de undeuterated m / z die 923,45 en 1697,84. Thij nauwkeurigheid van massa&#39;s na de kalibratie kan oplopen tot 10 ppm. Bij deuteration, kan de mono-isotoop verschuiving naar een grotere massa. Unitaire stap neemt toe tot deze m / z-verhoudingen leverde de verbeterde massa&#39;s verbonden met deuteration. De piek intensiteiten van de massa envelop heeft geen invloed op de deuteration niveau. Echter, de piek intensiteiten van de isotopische pieken in een bepaalde massa envelop zijn van cruciaal belang voor de berekening van de gemiddelde massa. De eerste stap van de berekening van de opgenomen deuteron is het aftrekken van de peptide massa van de niet-gedeutereerde monster uit de gedeutereerde monster. Drie andere factoren, de D 2 O verdunning, de resterende deuteronen in de zijketens en de rug te wisselen, zal verder moeten worden beschouwd in de berekening (figuur 1). De D 2 O is de verdunning van de factor D 2 O na het mengen van het monster en D 2 O buffer naar de H / D-uitwisseling initiëren. De resterende deuteron (4,5%) in de zijketens van de pepsine-digested peptiden dient te worden afgetrokken. De back-uitwisseling is het onvermijdelijke verlies van deuteration in alle gedeutereerd en pepsine-verteerd peptiden in de massa meetproces. De meest toegankelijke oplosmiddel peptide (m / z = 1105,60) na 24-uur van de H / D wisselen vertegenwoordigt een volledige deuteration regio. De ingebouwde deuteron aantal voor elk van de peptiden is het verschil tussen het zwaartepunt van de gedeutereerde en niet-gedeutereerde Pak2 ulcus peptiden. De meest gedeutereerde peptide m / z 1105 werd geselecteerd om volledige deuteration te vertegenwoordigen bij Pak2 was op 24 uur van de H / D wisselen. The Back Exchange Ratio is berekend door de werkelijke opgenomen deuteron aantal op 24 uur van de H / D wisselen, gedeeld door alle mogelijke verwisselbare sites op peptide m / z 1105.

<table border="1"></table><table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Commentaar (optioneel) </td></tr><tr><td> D 2 O </td><td> Aldrich </td><td> 7789-20-0 </td><td></td></tr><tr><td> α-cyano-4-hydroxycinnamic zuur </td><td> Sigma </td><td> 28166-41-8 </td><td></td></tr><tr><td> MALDI-TOF </td><td> PE Biosystems </td><td> Voyager DE STR </td><td></td></tr><tr><td> Q-TOF massaspectrometer </td><td> Q-TOF Ultima-Global </td><td></td><td></td></tr><tr><td> QStar XL oMALDI MS / MS </td><td> Applied Biosystems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Data Explorer 4.0 computerprogramma </td><td> Applied Biosystems </td><td></td><td></td></tr&gt; </tbody></table>

amide waterstof / deuterium exchange en maldi-tof-massaspectrometrie analyse van de pak2 activering

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amide waterstof / deuterium uitwisseling (H / D exchange) gekoppeld aan massaspectrometrie is op grote schaal gebruikt om de interface van eiwit-eiwit interacties, proteïne conformatie verandering, dynamiek en eiwit-eiwit-ligand interacties te analyseren. H / D uit te wisselen over de backbone amide posities is gebruikt om de deuteration tarieven van de micro-regio&#39;s in een eiwit te meten door massaspectrometrie 1,2,3. De resolutie van deze methode hangt af van pepsine vertering van de gedeutereerde eiwit van belang in de peptiden die variëren 3-20 residuen. Hoewel de resolutie van de H / D uitwisseling gemeten door middel van massaspectrometrie lager is dan de single residu resolutie gemeten door de heteronucleair Single Quantum Coherence (HSQC) methode van NMR, de massaspectrometrie meting in H / D uitwisseling wordt niet beperkt door de grootte van de eiwit 4. H / D uitwisseling wordt uitgevoerd in een waterige oplossing die eiwitconformatie onderhoudt. Wij bieden een methode die utilizes de MALDI-TOF voor detectie 2, in plaats van een HPLC / ESI (electrospray ionisatie)-MS-systeem 5,6. De MALDI-TOF zorgt voor nauwkeurige massa-intensiteit van gegevens voor de peptiden van de verteerd eiwit, in dit geval proteïne kinase Pak2 (ook wel γ-Pak). Proteolyse van Pak 2 wordt uitgevoerd in een offline pepsine spijsvertering. Deze alternatieve methode, wanneer de gebruiker geen toegang heeft tot een HPLC kolom en pepsine verbonden met massa-spectrometrie, of wanneer de pepsine column op HPLC resulteert niet in een optimale vertering kaart, bijvoorbeeld, de zwaar disulfide-gebonden afgescheiden fosfolipase A 2 hebben (SPLA 2). Gebruik te maken van deze methode hebben we met succes gevolgd veranderingen in het deuteration niveau tijdens activatie van Pak2 door caspase 3 decollete en autofosforylatie 7,8,9.

MALDI-TOF massaspectrometrie werd met succes gebruikt om de amide waterstof / deuterium uitwisseling in proteïne kinase Pak2 activatie te controleren.

Amide waterstof / deuterium Exchange en MALDI-TOF-massaspectrometrie Analyse van de Pak2 Activering

Amide waterstof/deuterium-uitwisseling (H/D-uitwisseling) gekoppeld aan massaspectrometrie is op grote schaal gebruikt om de interface van eiwit-eiwit...

Dit experiment demonstreert hoe massaspectrometrie kan worden gebruikt om waterstof-deuteriumuitwisseling geassocieerd met eiwitten te monitoren. Structurele veranderingen die leiden tot activatietoestanden worden als eerste onderzocht door protein kinase PAC2 te klieven met caspase 3 en vervolgens PAC2 te activeren door autofosforylering met gebruik van ATP als substraat. In een tweede stap wordt PAC2 verteerd met pepsin en worden de resulterende PAC2-fragmenten geanalyseerd via tandem-massaspectrometrie. Vervolgens worden de waterstof-deuteriumuitwisselingspatronen van PAC2 geanalyseerd door middel van monitoring van het deuteriumniveau van elk PAC2-fragment. De nauwkeurige bepaling van het niveau van waterstof-deuteriumuitwisseling via deze analyse biedt belangrijke inzichten in de klieving door caspase 3 en de autofosforylering van PAC2.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen over proteïnedynamiek, zoals conformationele veranderingen van proteïnen, proteïne-ligandinteracties en proteïne-proteïneinteracties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals HD-exchange LCQ-massaspectrometrie, is instrumenteel. Voor deze procedure is geen HPLC-gekoppelde massaspectrometrie nodig om de resultaten van de HD-exchange te analyseren, en de procedure is eenvoudig uit te voeren om 0,6 µg PAC two te splitsen.Voeg caspase 3 toe en incubeer de reactie bij 34 °C gedurende 30 minuten. Verifieer PAC 2 en de volledige splitsing van PAC 2 door analyse van de producten via SDS-PAGE. Voeg voor de activeringsreactie de gesplitste PAC 2 toe aan 20 µL activeringsbuffer B en incubeer dit bij 34 °C gedurende 30 minuten.Gebruik SDS-PAGE om autofosforylering te bevestigen door migratie van de P 34 en P 27 fragmenten. Was eerst de purine-geconjugeerde aro-beads tweemaal met één milliliter 0,1% trifluorazijnzuur. Verdun twee microliters van 10 milligram per milliliter Pack twee in 100 microliters 0,1% TFA. Voeg 30 microliters gewassen Pepsi-in geconjugeerde agro-beads toe en incubeer gedurende vijf minuten.Ga over tot het equilibreren van een reverse phase H-P-L-C-C 18 kolom met 0,1% TFA bij pH 2,5. Laad vervolgens het Pepin Digest en verdun dit met behulp van een lineaire gradiënt van 100 minuten. Verzamel elke twee minuten fracties nadat de HPLC-fracties zijn gedroogd met een speed VAC reus.Suspendeer de monsters in vijf microliters acetonitril en 0,1% TFA bij pH 2,5. Voer als initiële screening een analyse uit van elke fractie op peptiden middels MALDI-TOF voor alle fracties die peptiden bevatten.Identificeer de fragmenten met tandemmassaspectrometrie. Gebruik de MS-productfunctie in Protein Prospector om dochterionen te matchen met de theoretische m/z-ratio's op basis van de primaire sequentie van PAC twee. Laat vervolgens alle oplossingen en reagentia voor waterstof-deuteriumuitwisseling equilibreren.Start de waterstof-deuteriumuitwisseling door 18 µL buffer D₂O toe te voegen aan 2 µL van 10 mg/mL. Pak twee, voer de reacties in triplo uit over een tijdreeks. Stop de waterstof-deuteriumreactie met 180 µL ijskoud 0,1% TFA bij pH 2,2.Verdeel nu aliquots van 100 µL waterstofdeuterium. Voeg er twee toe aan elke 30 µL geactiveerde pepsin-geconjugeerde aggregaatkralen. Incubeer deze pepsin-digestie vijf minuten op ijs.Vortexen elke 30 seconden beëindigt de digestiereacties effectief; centrifugeer vervolgens om het Pepin snel te verwijderen. Vries de monsters in vloeibare stikstof in voor latere analyse. Bereid de matrix voor en bewaar deze bij 0 °C, waarna elk monster snel gedeeltelijk wordt ontdooid.Meng één µL monster met één µL matrix en breng dit vervolgens 30 seconden vóór de MALDI-analyse aan op een op 4 °C gekoelde MALDI-targetplaat. Pas een matig vacuüm toe op de plaat om de vlekken te drogen. De vlekken worden vervolgens geanalyseerd om MALDI-massaspectra te verkrijgen, waarbij gemiddeld 100 scans in twee minuten worden uitgevoerd.Gebruik vervolgens het computerprogramma Data Explorer 4.0 om de duur van elk fragment te berekenen. Bereken daarna de back exchange op basis van de ratio van de werkelijke incorporatie na 24 uur van waterstof-deuteriumuitwisseling gedeeld door alle mogelijke uitwisselbare plaatsen, zijnde de backbone-amiden, met uitzondering van het eindterminale amide. In dit voorbeeld worden de splitsing en autofosforylering van CASP Bay geverifieerd via SDS-PAGE met Coomassie-kleuring.De niet-gefosforyleerde inactieve PAC2 is een enkele band van 58 kilodaltons. Splitsing van PAC2 is volledig en produceert twee fragmenten, P27, het regulatoire domein en P34, het katalytische domein, na autofosforylering. De migratie van autofosforyleerde P27 en P34 vertoont een overlap op de proteïnegel vanwege de vertraagde migratie van het volledig gefosforyleerde P27-fragment in vergelijking met de niet-gefosforyleerde PAC2.Dit massespectrum toont het verloop van de deuterium-incorporatie voor inactief PAC twee. De MZ-piek 1697.85 bestaat uit meerdere isotopische pieken, zoals blijkt uit de verschuiving van de massenvelop. Naarmate de tijd vordert, geeft de rode stippellijn het gemiddelde van de massenvelop aan en de verschuiving van de massenvelop toont de duur van een peptide Once mastered.Deze techniek kan in twee dagen worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Vergeet niet dat werken met vloeibare stikstof uiterst gevaarlijk kan zijn; neem daarom voorzorgsmaatregelen, zoals het maken van een gaatje in de dop van de 1,5 ml EOL-buis voordat deze in vloeibare stikstof wordt geplaatst.

amide-hydrogendeuterium-exchange-maldi-tof-mass-spectrometry-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Leucine Rich Herhaal Kinase 2 is een grote multidomein kinase, mutaties in die de meest voorkomende genetische oorzaak van de ziekte van Parkinson. Analyse van de kinase-activiteit van dit eiwit heeft zich bewezen als een essentieel instrument in het begrijpen van de biologie en de disfunctie van dit eiwit te zijn. In dit...

Het testen van de kinase-activiteit van LRRK2 In vitro</em

Eiwitconformatie en dynamiek zijn de sleutel tot het begrijpen van de relatie tussen eiwit structuur en functie. Waterstofwisselproces combinatie met hoge-resolutie massaspectrometrie is een veelzijdige methode om de conformationele dynamica van proteïnen en karakteriseren eiwit-ligand en eiwit-eiwit interacties, zoals contact interfaces en allosterische effecten.

Het analyseren van Protein Dynamics gebruik van waterstof Exchange Massaspectrometrie

We beschrijven hier een protocol voor de zuivering en karakterisering van plantaardig eiwit complexen. We zien dat door immunoprecipitatie een eiwit in een complex, zodat we kunnen zijn post-translationele modificaties en zijn interactie partners identificeren.

Identificatie van post-translationele modificaties van Plant eiwitcomplexen

Met behulp van eiwit microarrays met bijna het hele S. cerevisiae proteoom wordt gesondeerd voor snelle onpartijdige ondervraging van duizenden proteïne-proteïne interacties in parallel. Deze werkwijze kan worden gebruikt voor eiwit-kleine molecule, posttranslationele modificatie, en andere assays high-throughput.

Probing hoge dichtheid functioneel eiwit Microarrays om eiwit-eiwit interacties Detect

Conformationele flexibiliteit speelt een cruciale rol in de eiwit-functie. Hierin beschrijven we het gebruik van tijdsopgeloste electrospray ionisatie massaspectrometrie gekoppeld met waterstof deuterium ruil voor het sonderen van de snelle structurele veranderingen die functie rijden besteld en ontvouwen eiwitten.

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Proteïne kinasen zijn hoog geëvolueerde signaal enzymen en steigers die kritisch zijn voor inter- en intracellulaire signaaltransductie. Wij presenteren een protocol voor het meten van kinase-activiteit door middel van radioactief gemerkte adenosintrifosfaat ([γ-32P] ATP), een betrouwbare methode om te helpen bij het ophelderen van cellulaire signalering regulering.

Analyse van proteïnekinaseactiviteit met radiolabelde ATP

Deze workflow beschrijft de prestaties van tijd- en kostenefficiënte verrijking van meerdere eiwitposttranslationele modificaties (PTM's) tegelijkertijd voor kwantitatieve wereldwijde proteomische analyse. Het protocol maakt gebruik van peptide-niveau PTM verrijking met meerdere geconjugeerde antilichamen, gevolgd door data-onafhankelijke acquisitie massaspectrometrie analyse om biologische inzichten te krijgen in PTM crosstalk.

Gelijktijdige affiniteitsverrijking van twee posttranslationele wijzigingen voor kwantificering en sitelokalisatie

Lanthipeptide synthetases katalyseren multistep reacties tijdens de biosynthese van peptide natuurlijke producten. Hier beschrijven we een continue, bottom-up, waterstof-deuterium uitwisseling massaspectrometrie (HDX-MS) workflow die kan worden gebruikt om de conformationele dynamiek van lanthipeptide synthetases te bestuderen, evenals andere vergelijkbare enzymen die betrokken zijn bij peptide natuurlijke productbiosynthese.

Een Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform voor het onderzoeken van Peptide Biosynthetische Enzymen

Gecombineerde precursor isotopic etikettering en isobaric tagging (cPILOT) is een verbeterde monster multiplexing strategie die in staat is het verhogen van het aantal monsters die gelijktijdig kunnen worden geanalyseerd met de beschikbare isobaric tags. De integratie van een robotplatform heeft de experimentele doorvoer, reproduceerbaarheid en kwantitatieve nauwkeurigheid sterk verhoogd.

Geautomatiseerde voorbeeldbixing met behulp van gecombineerde precursor-isotopenlabeling en isobaric tagging (cPILOT)

De mogelijkheid om doelbetrokkenheid door kandidaat-remmers in intacte cellen te beoordelen is cruciaal voor de ontdekking van geneesmiddelen. Dit protocol beschrijft een 384 goed formaat cellulaire thermische verschuiving test die betrouwbaar detecteert cellulaire doel betrokkenheid van remmers gericht op ofwel wild-type SHP2 of de oncogene varianten.

Beoordeling van Cellular Target Engagement door SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

Hier presenteren we een protocol voor de verrijking van endogene fosfoproteïnefosfatasen en hun interagerende eiwitten uit cellen en weefsels en hun identificatie en kwantificering door op massaspectrometrie gebaseerde proteomica.

Een op massaspectrometrie gebaseerde benadering om fosfoproteïnefosfatasen en hun interactoren te identificeren

Leer waterstof/deuterium-uitwisseling bij Pak2-activering met MALDI-TOF-massaspectrometrie. Deze methode onthult structurele dynamiek en conformatieveranderingen van eiwitkinasen voor therapeutisch onderzoek.

Amide waterstof / deuterium Exchange en MALDI-TOF-massaspectrometrie Analyse van de Pak2 Activering

Meer video's verkennen