Analyse van de neurale lijst migratie en differentiatie door Cross-soorten transplantatie

Het algemene doel van deze procedure is om een dorsaal neuraalbuisexplant van een kwartelsembryo te transplanteren in een kiKensembryo van hetzelfde ontwikkelingsstadium, om zo de migratie en het lot van neurale kamcellen te volgen. Dit wordt bereikt door eerst een klein gaatje te scheuren in het IGN-membraan van het gastheer-kiKensembryo om toegang te krijgen tot de neurale buis. Vervolgens wordt het donor-kwartelsembryo uit het ei gehaald om het voor te bereiden op de excisie van het transplantaat.

In de volgende stap wordt het interessegebied uit de neurale buis van het gastembryo excised. Vervolgens wordt een vergelijkbaar gebied uit de neurale buis van de donor excised voor het transplantaat. Daarna wordt de neurale buis van de donor getransplanteerd in de neurale buis van de gastheer.

Ten slotte wordt het chimerische embryo geïncubeerd tot het gewenste stadium om de aankomst van neurale kamcellen in het gekozen orgaan te detecteren. Uiteindelijk kunnen de migratie en differentiatie van donor-afgeleide neurale kamcellen naar diverse locaties in het gastheerembryo worden gevisualiseerd via immunofluorescentiemicroscopie. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, omdat de stappen voor microdissectie en enting zeer fijne motorische vaardigheden vereisen, waardoor ze moeilijk aan te leren zijn.

Begin met het afwassen van eventueel vuil van de kippeneieren met lauw water. Plaats de eieren horizontaal op een plateau en markeer vervolgens de bovenkant met potlood om de regio aan te geven waar het embryo zich bevindt. Voor X ovo-preparatie van donorembryo's worden de kwartelseieren met de stompe zijde naar beneden geïncubeerd.

Plaats vervolgens de eieren in een bevochtigde incubator op 38 °C en schakel de schudfunctie in. Nadat de eieren klaar zijn met incuberen, steriliseert u de bovenkanten door ze te besproeien met 70% ethanol en deze vervolgens snel af te vegen met een Kimwipe. Om absorptie door de eierschaal te voorkomen, plaatst u elk gesteriliseerd ei op een individuele eierhouder, vergelijkbaar met de hier getoonde Petrischaal die is bekleed met gevouwen Kimwipes. Tik vervolgens met gesteriliseerde AA-pincetten een klein gaatje in het bovenvlak van de eierschaal aan de gepunte zijde van het ei.

Voorzie een spuit van vijf milliliter van een hypodermische naald met een gauge van 18,5. Steek vervolgens de naald verticaal in het gat in de eierschaal, waarbij het schuine uiteinde naar de punt van het ei is gericht. Om te voorkomen dat de dooier per ongeluk door zuiging wordt beschadigd, dient u het gat zoals eerder beschreven te reinigen met 70% ethanol en het gat vervolgens af te dichten met plakband.

Tik vervolgens met de double A-pincet een ander gaatje in het gemarkeerde bovenoppervlak van het horizontale deel, net niet op de apex. Steek daarna één zijde van de gebogen iris-pincet parallel aan het ei in het gaatje. Knijp vervolgens in de schaal en maak een cirkelvormige beweging.

Maak een opening van twee centimeter in diameter in de schaal van het kippenei en gooi het verwijderde stuk eierschaal weg. Het embryo moet zichtbaar zijn als een ondoorzichtige schijf bovenop de dooier. Gooi alle onbevruchte eieren weg, die te herkennen zijn aan een kleine witte vlek op het oppervlak van de dooier of de afwezigheid van het blastoderm.

Buig nu, terwijl u een geschikte oogbescherming draagt, een hypodermische naald van 26,5 gauge in een hoek van 45 graden, beginnend bij de basis van de naald. Bevestig de gebogen naald met de schuine zijde naar boven aan een spuit van 1 mL en vul de naald met verdunde India-inkt. Punctureer het eigeelmembraan buiten de omtrek van de blaster en schuif de punt van de naald onder het embryo, dicht bij het oppervlak van het eigeel, maar niet in de embryonale lagen.

Inject vervolgens precies genoeg inkt om het embryo te omlijnen, waarbij u voorkomt dat er luchtbellen worden geïnjecteerd. Trek de naald voorzichtig terug. Gebruik nu een stereomicroscoop en een lichtbron met een beperkte warmteafgifte, zoals de hier getoonde glasvezel-flexlamp.

Determine het stadium van de embryo's volgens Hamburger en Hamilton. Noteer het stadium op de eierschalen. Breng vervolgens twee tot drie druppels warme, steriele Ringer-oplossing aan op het oppervlak van de embryo's om uitdroging en contaminatie te voorkomen.

Span vervolgens parafilm over het oppervlak van de eieren om de vensters tijdelijk af te dichten. Bereid daarna de kwarteleieren voor op transplantatie. Vul een Petrischaal met ringeroplossing voordat u de eieren uit de incubator haalt.

Open vervolgens de eieren aan de stompe zijde met gebogen pincetten om het embryo bloot te leggen. Maak met dissectiescharen vier sneden in de vorm van een vierkant door het vili-membraan en het blastoderm buiten het embryo, waarbij u er zeker van bent dat alle sneden elkaar raken. Pak vervolgens met gebogen irispincetten voorzichtig één gesneden rand vast, til het embryo uit het ei en breng het over naar de voorbereide petrischaal.

Verwijder ten slotte voorzichtig het vitellijnvlies met een pincet nummer vijf en bepaal vervolgens het stadium van de embryo's onder een dissectiemicroscoop. Verwijder de parafilm van het gast-kiजembryo. Maak vervolgens met een verscherpte wolfraamnaald een klein gaatje in het vitellijnvlies bij de gewenste regio van de neurale buis.

Voeg een druppel Ringer-oplossing toe aan het embryo. Maak vervolgens, voor unilaterale transplantaties zoals in deze video wordt uitgevoerd, met een getrokken glazen naald voorzichtig transversale rostrale en caudale incisies in het middenhersengebied van de neurale buis, zonder het lumen te overschrijden. Snijd daarna bilateraal tussen de dorsale neurale buis en het pariëtale mesoderm.

Scheid ten slotte het uitgesneden X-explantaat voorzichtig van de neurale buis en verwijder het vervolgens uit het embryo door het op te zuigen in een glazen micropipet. Gebruik eerst een kwartelembryo van een vergelijkbaar stadium. Snijd vervolgens een regio van de neurale buis uit met een vergelijkbare grootte als zojuist getoond en zuig het donor-X-explantaat op in een glazen micropipet die ringersoplossing bevat.

Breng het X-explantaat over naar de plek naast het uitgesneden gebied van de gastheer-kuikenembryo. Gebruik vervolgens een getrokken glazen naald om het explantaat te oriënteren door het voorzichtig in het geablateerde gebied te leiden. Voeg zorgvuldig een paar druppels ringersoplossing toe aan het embryo om uitdroging te voorkomen.

Verzegel ten slotte het venster met verpakkingstape, waarbij u ervoor zorgt dat de tape het gehele gebied van het gevenueerde ei afsluit. Plaats het ei terug in de incubator tot het gewenste stadium is bereikt. Schakel de wiegfunctie uit tijdens het incuberen van de kyira; het ei kan twee keer per dag voorzichtig met de hand worden gedraaid om de levensvatbaarheid te vergroten. Indien latere ontwikkelingsstadia worden nagestreefd, toont deze representatieve afbeelding van het gegraftede gebied van de neurale buis na zes uur herincubatie tot HH 11 de verwachte incorporatie van het gegraftede weivogel-donorteweefsel in de neurale buis van het gasterkip. Deze dwarsdoorsnede door het gegraftede gebied bij HH 11 toont neurale kamcellen gelabeld met hnk, waarvan er één lateraal wegmigreert van de neurale buis.

Koeicellen die bijdragen aan de migratiestroom van neurale kamcellen en aan de neurale buis zijn duidelijk gelabeld met QCPN. In latere stadia kunnen cellen die afkomstig zijn van neurale kamcellen van de kwartel worden teruggevoerd naar hun uiteindelijke doelweefsel. Zoals in deze figuur te zien is, zijn QCPN-gelabelde cellen verspreid in het embryo van de kuiken in het maxillaire proces. Bij E5 kan het QCPN-antilichaam eenvoudig worden gecombineerd met andere antilichamen om de differentiatie van neurale kamcellen afkomstig van de kwartel te onderzoeken.

In de gastomgeving. Zoals hier te zien is, zijn trigeminus-sensorische neuronen afkomstig van neurale kamcellen van kieviten gelabeld met QCPN- en T UJ one-antilichamen. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals immunohistochemie en in situ hybridisatie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals uit welke weefsels neurale kamcellen ontstaan en welke genen neurale kamcellen tot expressie brengen terwijl ze differentiëren in diverse weefsels.