High-throughput Detection Methode voor Influenza Virus

Het algemene doel van deze procedure is om influenza-virustiters in de luchtwegen van geïnfecteerde muizen efficiënt te kwantificeren. Muizen worden eerst intranasaal geïnoculeerd met influenza-virus op geselecteerde tijdstippen na infectie.

De M worden geofferd en er wordt een bronchoalveolaire lavage of BAL-vloeistof verzameld. Vervolgens wordt de BAL-vloeistof gebruikt om MDCK-cellen te infecteren. Geïnfecteerde cellen kunnen daarna worden gekleurd voor de aanwezigheid van virale eiwitten met behulp van specifieke primaire antilichamen, gevolgd door infrarood-geconjugeerde secundaire antilichamen.

Infraroodsignalen worden uitgelezen met de Lycor Odyssey-scanner en de Odyssey-software kan worden gebruikt om virale titers te bepalen. Met behulp van een standaardcurve kan een kwantitatieve bepaling van de virale titers worden verkregen. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zijn de nauwkeurige kwantificering van de virale titers, de reproduceerbaarheid en het kleine volume dat nodig is om deze assay uit te voeren.

De implicaties van deze techniek kunnen worden uitgebreid naar de diagnose en therapie van diverse respiratoire virale aandoeningen, omdat deze na deze procedure kan worden gebruikt om virale titers in klinische monsters te kwantificeren. Andere methoden zoals qPCR kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het virale kopiegetal. Bij het uitvoeren van deze techniek is het belangrijk om te onthouden de titerstandaardcontrole van het virus na deze ontwikkeling te controleren.

Deze techniek baant de weg voor onderzoekers op het gebied van virale logica om de virustiter te onderzoeken of virale eiwitten in klinische monsters aan te tonen. Zodra men de methode beheerst, kan deze techniek in 17 uur worden uitgevoerd. Voer de procedure als volgt nauwkeurig uit: infecteer muizen intranasaal met 5.000 plaque-vormende eenheden of PFU van het PR8-influenzavirus in 30 µL steriele PBS, of met alleen PBS als negatieve controle. Voor het verzamelen van BAL-vloeistof van geëuthanaseerde dieren moet eerst de borstholte worden geopend en een incisie van één centimeter parallel aan de trachea worden gemaakt om deze met fijne steriele scharen bloot te leggen.

Maak een kleine incisie in de trachea, infuseer de trachea met 0,5 milliliters PBS met 1% BSA en aspireer het spoelvocht voorzichtig. Bewaar de BAL-vloeistoffen bij min 20 graden centigrade om de virale titers in het spoelvocht te kwantificeren. Kweek eerst 5 miljoen MDCK-cellen in 20 milliliters compleet RPMI in een T 75-fles gedurende één nacht bij 37 graden centigrade; oogst de volgende dag de cellen en zaai deze uit in een optische zwart 96-wells plaat met een vlakke bodem in een dichtheid van 10.000 cellen per well.

Incubeer de plaat vervolgens na de incubatie een nacht bij 37 °C. Aspireer voorzichtig het supernatant af en was de cellen twee keer in compleet maar serumvrij DMEM dat 0,2% BSA bevat in plaats van FBS. Zodra de cellen gewassen zijn, voegt u 50 µL BAL-vloeistof of 50 µL van een suspensie met een bekende virusconcentratie per well toe.

Voeg vervolgens per well 50 µL DMEM toe, een medium dat TPCK-behandelde trypsine bevat in een concentratie van 0,2 µg/mL om de virale aanhechting, entry en replicatie te bevorderen. Incubeer de cellen gedurende één uur bij 37 °C om het virus te laten adsorberen. Voeg daarna 100 µL FBS-bevattend volledig RPMI toe aan elke well en kweek de cellen gedurende de nacht om de infectie te laten propageren na de incubatie overnacht.

Was de cellen met 100 µL 1% B-S-A-P-B-S. Zodra de cellen zijn gewassen, voegt u 100 µL per putje 1% paraformaldehyde toe en incubeert u de platen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om de cellen te fixeren. Was vervolgens met 100 µL per putje 1% B-S-A-P-B-S en incubeer de cellen nogmaals 30 minuten voor blokkering. Zodra de cellen zijn geblokkeerd, voegt u 50 µL per putje primaire antivirale M2-antilichamen toe, verdund in een verhouding van 1:1000, en incubeert u de platen gedurende één uur bij kamertemperatuur om eventueel aanwezige virale eiwitten te kleuren. Was na de incubatie de cellen drie keer in 1% B-S-A-P-B-S en incubeer ze gedurende één uur bij kamertemperatuur in het donker met 100 µL per putje secundaire antilichamen geconjugeerd aan een infraroodkleurstof in een verdunning van 1:200. Was de cellen, zodra ze zijn gekleurd, drie keer zoals eerder beschreven.

Plaats vervolgens de platen op het leesglasplatform van de Licor Odyssey infraroodscanner. Selecteer de instelling voor 96-wellsplaten op de reader met behulp van de Licor Odyssey-software. Identificeer de blanco negatieve controlewells en kwantificeer vervolgens de fluorescentie van de gehele plaat.

Gebruik de tool voor automatische vormen om het interessegebied of de ROI in het midden van een testput te tekenen. Gebruik de ROI van een negatieve controleput om de basislijnwaarde voor fluorescentie van de assay vast te stellen, en plaats vervolgens de twee tegengestelde kruisdraaden die door de Odyssey-software worden geleverd binnen de ROI om de intensiteit van de fluorescentie over de put te meten.

Scan vervolgens de plaat met behulp van het 780 nanometer kanaal voor detectie en 680 nanometer als referentiegolflengte. Zodra het leescommando is geactiveerd, worden de fluorescentie-intensiteiten op uniforme intervallen van de ROI gemeten. Vervolgens worden de verzamelde datapunten geïntegreerd.

Een standaarddeviatie-multiplier bepaalt het niveau van het signaal boven de basislijn dat in de ROI wordt opgenomen; zorg ervoor dat de optie geïntegreerde intensiteit voor berekeningen wordt geselecteerd, aangezien dit het netto pixelvolume voor gedefinieerde gebieden onafhankelijk van de grootte vertegenwoordigt. Achtergrondfluorescentie wordt gekwantificeerd aan de hand van de mock-geïnfecteerde controles en wordt gebruikt om de geïntegreerde intensiteit in de testputjes te schatten. De infraroodfluorescentie uit dubbele putjes die seriële verdunningen van getitreerd virus bevatten, wordt gebruikt om een standaardcurve op te stellen.

De standaardcurve kan vervolgens worden gebruikt om de titers van BAL-vloeistof van geïnfecteerde muizen te bepalen. In dit experiment werd een significante toename van de virale load waargenomen op dag twee en vier. Na infectie was het virus op dag 10 geklaard, zoals hier wordt getoond.

Virale titers gemeten met deze assay correleren goed met het gewichtsverlies bij muizen na infectie. Deze techniek kan ook worden toegepast op menselijke monsters. Hier wordt een kwantificering van het H1N1-virus uit een menselijk neusswab getoond.

De detectielimiet hier is 10 tot de derde TCID of tissue culture infective dose. Na het bekijken van deze video heeft u een goed begrip van hoe u de influenza-virustiter kunt schatten met behulp van een assay op basis van infraroodkleurstof. Een visuele demonstratie van deze techniek is essentieel, omdat het gebruik van de corp imager moeilijk kan zijn; dit zal helpen bij het vereenvoudigen en demonstreren van onze methoden voor het kwantificeren van virustiters in een plaat met 96 of 384 putjes.

En tot slot, vergeet niet dat werken met virussen extreem gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen, altijd moeten worden getroffen tijdens het uitvoeren van deze procedure.