High-throughput Detection Methode voor Influenza Virus
4 februari 2012
Deze methode beschrijft het gebruik van Infrared kleurstofinkt imaging systeem voor detectie van H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) vloeistof van geïnfecteerde muizen op een hoog gevoeligheid. Deze methodologie kan worden uitgevoerd in een 96 - of 384-wells plaat, vereist <10 pi volume van testmateriaal en heeft het potentieel voor gelijktijdige screening van meerdere pathogenen.
Het algemene doel van deze procedure is om influenzavirus-titers efficiënt te kwantificeren in de luchtwegen van besmette muizen. Muizen worden eerst intranasaal geïnoculeerd met influenzavirus op geselecteerde tijdstippen na infectie.
De M worden gedood en bronchoalveolaire lavage of BAL-vloeistof wordt verzameld. Vervolgens wordt de BAL-vloeistof gebruikt om MDCK-cellen te infecteren. Geïnfecteerde cellen kunnen vervolgens worden gekleurd voor de aanwezigheid van virale eiwitten met behulp van specifieke primaire antilichamen, gevolgd door infrarood geconjugeerde secundaire antilichamen.
Infrarode signalen worden gelezen met behulp van de Lycor Odyssey-scanner en de Odyssey-software kan worden gebruikt om virale titers te bepalen. Met behulp van een standaardcurve kan een kwantitatieve bepaling van virale titers worden verkregen. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van de bestaande methoden zijn de nauwkeurige kwantificering van de virale titers, de reproduceerbaarheid en het kleine volume dat nodig is om deze test uit te voeren.
De implicaties van deze techniek kunnen worden uitgebreid naar diagnose en therapie van verschillende respiratoire virale ziekten, omdat het kan worden gebruikt om virale titers in klinische monsters te kwantificeren. Volgend op deze procedure. Andere methoden zoals QPCR kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het aantal virale kopieën. Bij het uitvoeren van deze techniek is het belangrijk om te onthouden om het standaardcontrolevirus na deze ontwikkeling te controleren.
Deze techniek baant de weg voor de onderzoeker op het gebied van virale logica om virustiter of twist-kleuring van virale eiwitten in klinische monsters te verkennen. Eenmaal beheerst kan deze techniek in 17 uur worden uitgevoerd. Het wordt nauwkeurig uitgevoerd. Infecteer muizen intranasaal met 5.000 platformeenheden of PFU van PR acht influenzavirus in 30 microliter steriele PBS of met PBS alleen als een negatieve controle voor BAL-vloeistofverzameling van geëuthaniseerde dieren, snijd eerst de borstholte open en maak een snede van een centimeter parallel aan de luchtpijp om deze bloot te leggen met fijne steriele schaar.
Maak een kleine snede in de luchtpijp, spoel de luchtpijp door met 0,5 milliliter 1%BSA bevattende PBS en aspireer voorzichtig het lavagevocht weg. Bewaar de BAL-vloeistoffen bij min 20 graden Celsius om virale titers in lavagevloeistoffen te kwantificeren. Cultiveer eerst 5 miljoen MDCK-cellen in 20 milliliter compleet RPMI in een T 75-kolf een nacht bij 37 graden Celsius. De volgende dag oogst je de cellen en plateer ze in een optische platte zwarte 96-wellplaat bij 10.000 cellen per putje.
Bekijk de plaat vervolgens een nacht bij 37 graden Celsius. Aas voorzichtig de supernatant af en was de cellen twee keer in compleet maar serumvrij DMEM met 0,2%BSA in plaats van FBS. Zodra de cellen zijn gewassen, voeg je 50 microliter BAL-vloeistof of 50 microliter van een suspensie met een bekende concentratie virus per putje toe.
Voeg vervolgens 50 microliter per putje DMEM-medium toe, medium dat TPCK-behandeld trypsine bevat bij 0,2 microgram per milliliter om virale aanhechting, binnenkomst en replicatie te verbeteren. Bewaar de cellen een uur bij 37 graden Celsius om het virus te laten absorberen. Voeg vervolgens 100 microliter FBS-bevattend compleet RPMI toe aan elk putje en cultiveer de cellen een nacht lang om de infectie te laten propageren na de overnachting.
Was de cellen met 100 microliter 1%B-S-A-P-B-S. Zodra de cellen zijn gewassen, voeg je 100 microliter per putje van 1%para formaldehyde toe en bewaar de platen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om de cellen te fixeren. Was vervolgens met 100 microliter per putje van 1%B-S-A-P-B-S en bewaar de cellen nog 30 minuten voor blokkering. Zodra de cellen geblokkeerd zijn, voeg je 50 microliter per putje van primaire antivirale M twee antilichaam toe, verdund bij een tot 1000, en bewaar de platen gedurende een uur bij kamertemperatuur om eventuele virale eiwitten die aanwezig zijn na de incubatie te kleuren. Was de cellen vervolgens drie keer in 1%B-S-A-P-B-S en bewaar ze een uur bij kamertemperatuur in het donker met 100 microliter per putje van infraroodkleurgeconjugeerd secundair antilichaam bij een verdunning van een tot 200. Zodra de cellen zijn gekleurd, was ze drie keer zoals eerder.
Plaats vervolgens de platen op de leesglasplatform van de Licor Odyssey infraroodscanner. Selecteer de 96-wellplaatinstelling op de lezer met behulp van de Licor Odyssey-software. Identificeer de blanco negatieve controleputjes, bepaal vervolgens de fluorescentie van de hele plaat.
Gebruik de hulplijntool om het gebied van interesse of ROI in het midden van een test te tekenen. Gebruik de ROI van een negatieve controle. Gebruik de ROI van een negatieve controle. Gebruik de ROI van een negatieve controle. Gebruik de ROI van een negatieve controle. Gebruik de ROI van een negatieve controle. Gebruik de ROI van een negatieve controle. Gebruik de ROI van een negatieve controle. Gebruik de ROI van een negatieve controle. Gebruik de ROI van een negatieve controle. Gebruik de ROI van een negatieve controle. Gebruik de ROI van een negatieve controle. Gebruik de ROI van een negatieve controle. Gebruik de ROI van een negatieve controle. Gebruik de ROI van een negatieve controle. Gebruik de ROI van een negatieve controle. Gebruik de ROI van een negatieve controle. Gebruik de ROI van een negatieve controle. Gebruik de ROI van een negatieve controle. Gebruik de ROI van een negatieve controle. Gebruik de ROI van een negatieve controle. Gebruik de ROI van een negatieve controle. Gebruik de ROI van een negatieve controle. Gebruik de ROI van een negatieve controle. Gebruik de ROI van een negatieve controle. Gebruik de ROI van een negatieve controle. Gebruik de ROI van een negatieve controle. Gebruik de ROI van een negatieve controle. Gebruik de ROI van een negatieve controle. Gebruik de ROI van een negatieve controle. Gebruik de ROI van een negatieve controle. Gebruik de ROI van een negatieve controle. Gebruik de ROI van een negatieve control
Overzicht
Deze methode beschrijft het gebruik van een infrarood kleurstof-gebaseerd beeldvormingssysteem voor de detectie van H1N1 in bronchoalveolaire lavagel (BAL) vloeistof van geïnfecteerde muizen met hoge gevoeligheid. De methodologie kan worden uitgevoerd in een 96- of 384-well plate, vereist minder dan 10 渭l testmateriaal en maakt gelijktijdige screening van meerdere pathogenen mogelijk.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Virologie
- Besmettelijke ziekten
- Immunologie
Achtergrond
- Het influenzavirus vormt aanzienlijke gezondheidsrisico's, wat efficiënte kwantificeringsmethoden vereist.
- Traditionele methoden kunnen gebrek hebben aan gevoeligheid of grotere monstersvolumes vereisen.
- Infrarood kleurstof-gebaseerde beeldvorming biedt een nieuwe aanpak voor virale detectie.
- Het kwantificeren van virale titers kan helpen bij het begrijpen van ziekteprogressie en behandelingseffectiviteit.
Doel van de studie
- Om influenza virale titers efficiënt te kwantificeren in de luchtwegen van geïnfecteerde muizen.
- Om de gevoeligheid en specificiteit van de infrarood kleurstof-gebaseerde beeldvormingstechniek te evalueren.
- Om het potentieel voor toepassing in klinische monsters te verkennen.
Gebruikte methoden
- Muizen werden intranasaal geïnoculeerd met influenzavirus.
- Bronchoalveolaire lavagel (BAL) vloeistof werd verzameld na infectie.
- MDCK cellen werden geïnfecteerd met BAL vloeistof om de aanwezigheid van het virus te beoordelen.
- Infrarode signalen werden gedetecteerd met behulp van de Licor Odyssey scanner.
Belangrijkste resultaten
- Er werden significante toenames in virale lading waargenomen op dagen 2 en 4 na infectie.
- Virale titers correleerden goed met gewichtsverlies van muizen na infectie.
- De techniek toonde hoge gevoeligheid met een detectielimiet van 103 TCID.
- Toepassing van de methode op menselijke monsters was ook succesvol.
Conclusies
- Het infrarood kleurstof-gebaseerde beeldvormingssysteem biedt een nauwkeurige en reproduceerbare methode voor het kwantificeren van virale titers.
- Deze techniek heeft potentiële implicaties voor het diagnosticeren en behandelen van respiratoire virale ziekten.
- Verder onderzoek kan de toepassing uitbreiden naar andere virale pathogenen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This infrared dye-based assay enables high-throughput quantification of influenza viral titers from clinical samples, supporting rapid strain identification and pandemic response. The method provides precise, reproducible measurements with minimal sample volume, facilitating scalable screening workflows. Its compatibility with 96- and 384-well formats allows integration into automated discovery pipelines for antiviral lead identification and mechanistic de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying viral load as a functional readout of antiviral efficacy.
- Operational Value: Supports biological de-risking through objective, titer-dependent fluorescence measurements that reduce mechanistic ambiguity.
- Predictive Value: Generates quantitative data for portfolio triage by correlating viral titer reduction with compound activity in preclinical models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, reproducible outputs suitable for high-throughput screening of compound libraries against influenza.
- Scalability: Compatible with 96- and 384-well plate formats, enabling concurrent screening of thousands of samples per run.
- Quantitative Output: Generates fluorescence intensity data that directly correlates with viral titer, supporting dose-response curve construction and IC50 determination.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses MDCK cells infected with clinical BAL fluid to model human respiratory infection, enhancing translational validity.
- Preclinical Continuity: Enables longitudinal tracking of viral load from discovery through preclinical validation, supporting risk-adjusted advancement decisions.
- Biomarker Alignment: Viral titer serves as a mechanistic biomarker for evaluating antiviral candidates in vivo and in vitro.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the antiviral discovery continuum from early target validation through lead optimization to preclinical efficacy testing, providing a quantitative bridge between in vitro screening and in vivo outcomes.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring viral protein expression as a direct readout of infection status and compound effect.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility across large compound sets, reducing false positives and negatives in primary screens.
- Analytics: Delivers integrated intensity measurements that allow statistical comparison of conditions and calculation of signal-to-noise ratios for assay quality control.
- Translational Research: Connects in vitro antiviral activity to in vivo viral load reduction, supporting biomarker-driven go/no-go decisions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable infrared imaging capability applicable to multiple respiratory viruses beyond influenza, maximizing platform utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in antiviral efficacy through precise, linear quantification of viral titers across a wide dynamic range.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via infrared detection that minimizes autofluorescence and batch variability.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early go/no-go decisions based on quantitative antiviral activity, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of candidates by correlating in vitro titer reduction with in vivo efficacy predictors.
Implementation Considerations
- Requires expertise in virology, cell culture, and immunofluorescence techniques for proper assay execution and interpretation.
- Dependent on Licor Odyssey infrared scanner and associated software for signal acquisition and quantification.
- Necessitates standardization of antibody dilutions, incubation times, and washing protocols across users and sites.
- Must account for cell line variability and viral strain differences when adapting the assay to other pathogens or models.
- Limited to detecting viral proteins; cannot distinguish between infectious and non-infectious particles without complementary assays.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:26
Intra-nasal Infection of Mice with Influenza and Collection of Bronchio-Alveolar Lavage Fluid
3:22
Infection of MDCK Cells with Virus and Detection of Viral M2 Protein with the LI-COR Odyssey
8:09
Quantification of Influenza Viral Titer using Infra-red Staining and Detection
9:16
Conclusion
