Name: High-throughput Detection Methode voor Influenza Virus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Leer een infraroodkleurstof-gebaseerde beeldvormingsmethode voor de detectie van influenzavirus in BAL-vloeistof van geïnfecteerde muizen. Deze techniek biedt hoge gevoeligheid met slechts 10 µl monster en is toepasbaar in 96- of 384-putjesplaten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund NIH subsidies R01 A1064826-01, U19 AI062627-01, NO1-HHSN26600500032C (voor SM). Wij danken ons laboratorium leden voor discussie en technische hulp, Tina Heil voor de kritische beoordeling van het manuscript. Wij willen David Bina, Milwaukee Health Department Laboratorium bedanken voor viruskweek en PCR.

<ol><li>Hirst, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+agglutination+of+red+cells+by+allantoic+fluid+of+chick+embryos+infected+with+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The agglutination of red cells by allantoic fluid of chick embryos infected with influenza virus.</a> Science. 94, 22-23 (1941).</li>
<li>Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+polymerase+chain+reaction+as+a+rapid+and+efficient+alternative+to+estimation+of+picornavirus+titers+by+tissue+culture+infectious+dose+50%25+or+plaque+forming+units%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units.</a> Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).</li>
<li>Kalter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemagglutinating+Behavior+of+Mouse+and+Egg-adapted+Type+A+%28PR8%29+Influenza+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hemagglutinating Behavior of Mouse and Egg-adapted Type A (PR8) Influenza Virus.</a> Science. 110, 184-184 (1949).</li>
<li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Plaques+in+Monolayer+Tissue+Cultures+by+Single+Particles+of+an+Animal+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Production of Plaques in Monolayer Tissue Cultures by Single Particles of an Animal Virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 38, 747-752 (1952).</li>
<li>Deyde, V. M., Nguyen, T., Bright, R. A., Balish, A., Shu, B., Lindstrom, S., Klimov, A. I., Gubareva, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+molecular+markers+of+antiviral+resistance+in+influenza+A+%28H5N1%29+viruses+using+a+pyrosequencing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Detection of molecular markers of antiviral resistance in influenza A (H5N1) viruses using a pyrosequencing method.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 53, 1039-1047 (2009).</li>
<li>Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+polymerase+chain+reaction+as+a+rapid+and+efficient+alternative+to+estimation+of+picornavirus+titers+by+tissue+culture+infectious+dose+50%25+or+plaque+forming+units%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units.</a> Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).</li>
<li>Rahman, M., Kieke, B. A., Vandermause, M. F., Mitchell, P. D., Greenlee, R. T., Belongia, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+Directigen+flu+A%2BB+enzyme+immunoassay+and+direct+fluorescent+assay+for+detection+of+influenza+infection+during+the+2004-2005+season%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Microbiology+and+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Performance of Directigen flu A+B enzyme immunoassay and direct fluorescent assay for detection of influenza infection during the 2004-2005 season.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 58, 413-418 (2007).</li>
<li>Landry, M. L., Ferguson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suboptimal+detection+of+influenza+virus+in+adults+by+the+Directigen+Flu+A%2BB+enzyme+immunoassay+and+correlation+of+results+with+the+number+of+antigen-positive+cells+detected+by+cytospin+immunofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Suboptimal detection of influenza virus in adults by the Directigen Flu A+B enzyme immunoassay and correlation of results with the number of antigen-positive cells detected by cytospin immunofluorescence.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 3407-3409 (2003).</li>
<li>Herrmann, B., Larsson, C., Zweygberg, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+and+typing+of+influenza+viruses+A+and+B+by+a+nested+reverse+transcription-PCR%3A+comparison+to+virus+isolation+and+antigen+detection+by+immunofluorescence+and+optical+immunoassay+%28FLU+OIA%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection and typing of influenza viruses A and B by a nested reverse transcription-PCR: comparison to virus isolation and antigen detection by immunofluorescence and optical immunoassay (FLU OIA).</a> J. Clin. Microbiol. 39, 134-138 (2001).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> Am. J. Epidemiol. 27, 493-497 (1938).</li>
<li>Doerr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins%3A+into+the+infrared%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins: into the infrared.</a> Nat. Meth. 6, 482-483 (2009).</li>
<li>Shu, B., Wu, K. H., Emery, S., Villanueva, J., Johnson, R., Guthrie, E., Berman, L., Warnes, C., Barnes, N., Klimov, A., Lindstrom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+performance+of+the+CDC+real-time+reverse+transcriptase+PCR+swine+flu+panel+for+detection+of+2009+A+%28H1N1%29+pandemic+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 2614-2619 (2011).</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

De recente uitbraak van vogelgriep in Zuidoost-Azië en een wereldwijde angst voor de varkensgriep pandemie op te leggen enorme problemen voor de volksgezondheid en veiligheid. Kritische aandacht is gewijd in het genereren van vaccins voor bestaande en nieuwe stammen van het influenza virus. De beschikbaarheid van snelle high-throughput technologie voor nauwkeurige detectie en accurate virale titer berekeningen zal enorm verbeteren behandeling. De meest gebruikte technieken gebruikt om virus titer te berekenen onder meer plaque-vormende en influenza hemagglutinatie assays. De plaque-vormende test werd voor het eerst ontwikkeld om bacteriofaag titers schatten en werd door Renato Dulbecco te berekenen dier virale titers 4. Om dit assay uitvoert, worden 10-voudige verdunningen van influenza stock of dierlijke specimens zoals BAL stof bereid en 0,1 ml aliquots worden geïnoculeerd de monolaag van MDCK cellen in 6-wells platen. De virus mag adsorberen aan de MDCK cellen gevolgd door de addition van een voedingsmedium en agarose. Tijdens de incubatie het oorspronkelijke geïnfecteerde cellen vrijkomen virale nageslacht die verspreid alleen de naburige cellen. De cytopathogeen effect van de influenza virale infectie produceert een cirkelvormige zone van geïnfecteerde cellen heet een plaque. Elke plaque wordt vermoedelijk gevormd na infectie van een enkele cel met een enkel virusdeeltje gevolgd door replicatie van virus. Contrast tussen de levende cellen en de plaques kunnen worden verbeterd door kleurstoffen zoals kristal violet. Een belangrijk nadeel van deze assay is gebrek aan reproduceerbaarheid en enorme variaties binnen experimenten. Een andere assay gebruikt om de influenza virale titer bepalen, is de hemagglutinatie assay. De hemagglutinine-eiwit aanwezig op het oppervlak van het influenzavirus bindt efficiënt te N-acetylneuraminezuur-bevattende eiwitten op zoogdiercellijnen en aviaire rode bloedcellen 1. Deze interactie tussen het influenzavirus en erytrocyten leidt tot agglutinatie in de vorm van een rooster. Het lEvel van agglutinatie wordt gebruikt om de titer van het influenzavirus in test specimens schatten. Erythrocyt agglutinatie assay wordt alleen gebruikt om de titratie van een bekend virus bepalen en kan niet worden gebruikt voor stamidentificatienummer doeleinden. Aangezien deze test maakt geen onderscheid tussen de live en de doden virussen, is het moeilijk te verkrijgen precieze berekening van virale titers. De huidige klinische diagnose van influenza-infecties zijn gebaseerd op serologische testen, polymerase chain reaction, direct monster immunofluorescentie en celkweek 1,6. De nieuwe methode hier beschreven heeft ook klinische en laboratorium diagnostische mogelijkheden. Influenza detectie kits Directigen FLU-A (BD Biosciences, San Jose, CA) en BinaxNow (Binax, Inc, Scarborough, ME) gebruik immunochromatografie test voor het virale antigeen te detecteren, zoals nucleoproteïne 7. Met deze kits, detectie van virus kan worden bereikt binnen 15 min; maar alle negatieve monsters verder moeten s becreened door de cel kweekmethode. Diverse studies hebben ook gemeld lage gevoeligheid van deze kits, in het bijzonder, wanneer de infectie was mild of laag 8. In onze methode, we voortdurend te sporen zo laag als 100 PFU van het virus. Dit suggereert onze techniek is nuttig in detectie H1N1 virus in klinische monsters, zelfs wanneer de infectie is mild. Een fluorescentie-gebaseerde methode van virale antigenen te detecteren is gemeld, waar ofwel nasofaryngeale aspiraat monsters werden direct geanalyseerd of werden geënt op een monolaag van gevoelige cellen voor virus vermenigvuldiging en de daarop volgende analyses 9. Zijn echter deze methoden beperkt voor diagnostische doeleinden en zijn niet geschikt voor virus titer berekeningen. Q-PCR helpt te identificeren de aanwezigheid van virale RNA en schat geen de besmettelijkheid van levende virussen. In vergelijking met deze testen, zullen IR dye-gebaseerde test systeem te helpen bij het opsporen en virale titer opsomming in klinische en laboratorium monsters. In geval van influenza uitbraak, iskritisch voor duizenden monsters diagnosticeren in korte tijd periode. Onze methode is gebaseerd op een 384-wells plaat en IR-scanner kan scannen 6-platen op een moment (&gt; 2.000 monsters), daardoor een groter voordeel ten opzichte van andere direct fluorescent methoden. Haalbaarheid van een snelle verwerking van duizenden klinische monsters zou kunnen verminderen-test variabiliteit, de lengte van test tijd en kosten. Het gebruik van een M2-specifiek antilichaam biedt het voordeel van onafhankelijk van stam verschillen in H en N eiwitten. De M2-eiwit wordt relatief geconserveerd in de meeste influenza-stammen infecteren de mens. Als antilichamen die specifiek circulerende vlekken zijn gecombineerd met onze systeem kan men meten zowel de titer van virus en identificeer de stam. Aangezien M2 is de doelstelling voor het Amantadine-achtige drugs, kan mutanten ontstaan ​​die kunnen de bindingsplaats voor het mAb hier gebruikt te veranderen. Dit betekent een potentiële beperking voor dit systeem bij personen die behandeld worden door deze medicijnen. Veelvoudassays worden gebruikt om griep te titers sommen in test monsters. Om virus titer, 50% weefselkweek infectieuze dosis (TCID 50) en eieren allantoïsvocht-based assays berekenen worden schaal gebruikt 1,10. Echter, eisen van meerdere dagen te maken van deze methoden minder betrouwbaar. Verder in deze methoden berekeningen gebaseerd op de 50% verandering in de aantal plaques verzorgen de theoretische maar minder nauwkeurig virale titraties. Plaque vormende assays kan worden uitgevoerd binnen 96 uur, maar gebrek aan reproduceerbaarheid is een belangrijke zorg in virale titer berekeningen. De onderhavige techniek hier beschreven heeft verschillende duidelijke voordelen. Eerste is een zeer reproduceerbare techniek met consistente uitkomsten. Second, virale titer berekeningen zijn gebaseerd op eenvoudige kwantificering van fluorescentie-intensiteiten die worden vergeleken tegen gedefinieerde standaard curves. Derde kan twee of meer primaire antilichamen worden gebruikt om meerdere serotypes diagnosticeren in een gegeven monster. Ook, IR dye-geconjugeerde antilichamen hebben minimal autofluorescentie en zijn gebruikt voor cell imaging 11. UV of visuele straling (300-600 nM) resulteert in hoge cellulaire autofluorescentie door de aanwezigheid van hoge quantum opbrengst endogene fluoroforen. Deze omvatten aromatische aminozuren, lipo-pigmenten, pyridinic nucleotiden (NADPH), elastine, collageen en Flavin coënzymen. Deze intrinsieke eigenschap van cellen maakt het moeilijk om deze bronnen van straling gebruiken als probes om de expressie van specifieke eiwitten kwantificeren. In tegenstelling, bijna-IR-kleurstoffen prikkelen en uit te stoten tussen 670-1000 nm. Veel gastheer cellulaire moleculen en polycyclische aromatische koolwaterstoffen niet enthousiast op deze golflengte en als gevolg van verminderde lichtverstrooiing, zendt extreem lage achtergrond fluorescentie. Verder wordt het venster tussen de achtergrond en specifieke detectie enorm gevolg van een hoge extinctiecoëfficiënt van de nabije-IR fluoroforen verbeterd. Fotostabiliteit, superieure signaal-ruisverhouding, is uiterst relevant in de kwantificering van virale titers. Gebruik van microfluidic kamers zal automatiseren van de screening door de robot controles, en kan ons toelaten om zeer besmettelijk klinische monsters te testen met gemak. Zo is het gebruik van buurt-IR kleurstoffen in deze methoden is ideaal en zeer betrouwbare van virale titers in weefselmonsters te sommen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Bovine serum albumine </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11750 </td><td></td></tr><tr><td> PR8 virus </td><td></td><td></td><td> Van Dr Thomas M Moran </td></tr><tr><td> Geit anti-muis IRDye @ 800 </td><td> LI-COR biowetenschappen </td><td> 926-32210 </td><td> 1:200 verdunning </td></tr><tr><td> LI-COR Odyssey IR-scanner </td><td> LI-COR-biowetenschappen </td><td> 9201-01 </td><td></td></tr><tr><td> 384-putten vlakke bodemplaat </td><td> Nalge Nunc internationale </td><td> 164730 </td><td></td></tr><tr><td> 96-wells vlakke bodemplaat </td><td> Nalge Nunc internationale </td><td> 165305 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM medium </td><td> InvitrOgen </td><td> 11965126 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI medium </td><td> Invitrogen </td><td> 11875135 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumbicarbonaat </td><td> Invitrogen </td><td> 25080 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamine 100x </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> Trypson-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> R001100 </td><td></td></tr><tr><td> Natrium Pyruvaat </td><td> Invitrogen </td><td> 11360070 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-M-2 antilichaam </td><td></td><td></td><td> Van Dr Thomas M Moran </td></tr><tr><td> Anti-NP mAb </td><td> CDC </td><td> V2S2208 </td><td> Verkregen met een MTA </td></tr></tbody></table>

high-throughput detection methode voor influenza virus

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is een respiratoire ziekteverwekker die een hoge mate van morbiditeit en mortaliteit elk jaar in meerdere delen van de wereld veroorzaakt. Daarom is nauwkeurige diagnose van de infecterende stam en snelle high-throughput screening van grote aantallen klinische monsters van het grootste belang om de verspreiding van een pandemie infecties te controleren. De huidige klinische diagnose van influenza-infecties zijn gebaseerd op serologische testen, polymerase chain reaction, direct monster immunofluorescentie en celkweek 1,2. Hier melden wij de ontwikkeling van een nieuwe diagnostische techniek die gebruikt wordt om live influenza virussen op te sporen. We gebruikten de muis-aangepaste menselijke A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 bij de werkzaamheid van deze techniek gebruik MDCK cellen 4 testen. MDCK cellen (10 4 of 5 x 10 3 per well) werden gekweekt in 96 - of 384-wells platen, besmet met PR8 en virale proteïnen werden gedetecteerd met behulp anti-M2 gevolgd door een IR kleurstof-geconjugeerd secsecundaire antilichaam. M2 5 en hemagglutinin 1 zijn twee belangrijke marker eiwitten gebruikt in veel verschillende diagnostische assays. Gebruikmakend van IR-kleurstof-geconjugeerde secundaire antilichamen tot een minimum beperkt de autofluorescentie verband gebracht met andere fluorescente kleurstoffen. Het gebruik van anti-M2 antilichaam liet ons toe de antigen-specifieke fluorescentie-intensiteit gebruiken als direct metric van virale kwantiteit. Om de fluorescentie-intensiteit te sommen, gebruikten we de LI-COR Odyssey op basis van IR-scanner. Dit systeem maakt gebruik van twee kanaals laser gebaseerde IR detecties te fluoroforen te identificeren en ze te onderscheiden van achtergrondruis. Het eerste kanaal enthousiast op 680 nm en stoot op 700 nm om te helpen op de achtergrond te kwantificeren. Het tweede kanaal detecteert fluoroforen dat prikkelen bij 780 nm en uitzenden op 800 nm. Het scannen van PR8-geïnfecteerde MDCK cellen in de IR-scanner wees op een virale titer-afhankelijke heldere fluorescentie. Een positieve correlatie van fluorescentie-intensiteit van het virus titer vanaf 10 2 -10 5 PFU zou kunnen zijn conconsequent nageleefd. Minimale maar detecteerbare positiviteit consistent gezien met 10 2 -10 3 PFU PR8 virale titers aangetoond dat de hoge gevoeligheid van de bijna-IR kleurstoffen. De signaal-ruisverhouding werd bepaald door vergelijking van de mock-geïnfecteerde of isotype antilichaam-behandelde MDCK cellen. Met behulp van de fluorescentie-intensiteiten van 96 - of 384-wells plaat formaten, bouwen we standaard titratiekromme. In deze berekeningen, de eerste variabele het virale titer terwijl de tweede variabele is de fluorescentie-intensiteit. Daarom gebruikten we de exponentiële distributie naar een curve-fit met het polynoom relatie tussen de virale titers en fluorescentie-intensiteiten bepalen genereren. Gezamenlijk kunnen we concluderen dat IR op dye-basis eiwitdetectie systeem kan helpen bij de diagnose infecteren virusstammen en precies opsomming gegeven van de titer van het infecterende ziekteverwekkers.

Deze methode beschrijft het gebruik van Infrared kleurstofinkt imaging systeem voor detectie van H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) vloeistof van geïnfecteerde muizen op een hoog gevoeligheid. Deze methodologie kan worden uitgevoerd in een 96 - of 384-wells plaat, vereist &lt;10 pi volume van testmateriaal en heeft het potentieel voor gelijktijdige screening van meerdere pathogenen.

High-throughput Detection Methode voor Influenza Virus

Het influenzavirus is een respiratoir pathogeen dat jaarlijks in diverse delen van de wereld leidt tot een hoge mate van morbiditeit en mortaliteit. Daarom, ...

Het algemene doel van deze procedure is om influenza-virustiters in de luchtwegen van geïnfecteerde muizen efficiënt te kwantificeren. Muizen worden eerst intranasaal geïnoculeerd met influenza-virus op geselecteerde tijdstippen na infectie.De M worden geofferd en er wordt een bronchoalveolaire lavage of BAL-vloeistof verzameld. Vervolgens wordt de BAL-vloeistof gebruikt om MDCK-cellen te infecteren. Geïnfecteerde cellen kunnen daarna worden gekleurd voor de aanwezigheid van virale eiwitten met behulp van specifieke primaire antilichamen, gevolgd door infrarood-geconjugeerde secundaire antilichamen.Infraroodsignalen worden uitgelezen met de Lycor Odyssey-scanner en de Odyssey-software kan worden gebruikt om virale titers te bepalen. Met behulp van een standaardcurve kan een kwantitatieve bepaling van de virale titers worden verkregen. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zijn de nauwkeurige kwantificering van de virale titers, de reproduceerbaarheid en het kleine volume dat nodig is om deze assay uit te voeren.De implicaties van deze techniek kunnen worden uitgebreid naar de diagnose en therapie van diverse respiratoire virale aandoeningen, omdat deze na deze procedure kan worden gebruikt om virale titers in klinische monsters te kwantificeren. Andere methoden zoals qPCR kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het virale kopiegetal. Bij het uitvoeren van deze techniek is het belangrijk om te onthouden de titerstandaardcontrole van het virus na deze ontwikkeling te controleren.Deze techniek baant de weg voor onderzoekers op het gebied van virale logica om de virustiter te onderzoeken of virale eiwitten in klinische monsters aan te tonen. Zodra men de methode beheerst, kan deze techniek in 17 uur worden uitgevoerd. Voer de procedure als volgt nauwkeurig uit: infecteer muizen intranasaal met 5.000 plaque-vormende eenheden of PFU van het PR8-influenzavirus in 30 µL steriele PBS, of met alleen PBS als negatieve controle. Voor het verzamelen van BAL-vloeistof van geëuthanaseerde dieren moet eerst de borstholte worden geopend en een incisie van één centimeter parallel aan de trachea worden gemaakt om deze met fijne steriele scharen bloot te leggen.Maak een kleine incisie in de trachea, infuseer de trachea met 0,5 milliliters PBS met 1% BSA en aspireer het spoelvocht voorzichtig. Bewaar de BAL-vloeistoffen bij min 20 graden centigrade om de virale titers in het spoelvocht te kwantificeren. Kweek eerst 5 miljoen MDCK-cellen in 20 milliliters compleet RPMI in een T 75-fles gedurende één nacht bij 37 graden centigrade; oogst de volgende dag de cellen en zaai deze uit in een optische zwart 96-wells plaat met een vlakke bodem in een dichtheid van 10.000 cellen per well.Incubeer de plaat vervolgens na de incubatie een nacht bij 37 °C. Aspireer voorzichtig het supernatant af en was de cellen twee keer in compleet maar serumvrij DMEM dat 0,2% BSA bevat in plaats van FBS. Zodra de cellen gewassen zijn, voegt u 50 µL BAL-vloeistof of 50 µL van een suspensie met een bekende virusconcentratie per well toe.Voeg vervolgens per well 50 µL DMEM toe, een medium dat TPCK-behandelde trypsine bevat in een concentratie van 0,2 µg/mL om de virale aanhechting, entry en replicatie te bevorderen. Incubeer de cellen gedurende één uur bij 37 °C om het virus te laten adsorberen. Voeg daarna 100 µL FBS-bevattend volledig RPMI toe aan elke well en kweek de cellen gedurende de nacht om de infectie te laten propageren na de incubatie overnacht.Was de cellen met 100 µL 1% B-S-A-P-B-S. Zodra de cellen zijn gewassen, voegt u 100 µL per putje 1% paraformaldehyde toe en incubeert u de platen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om de cellen te fixeren. Was vervolgens met 100 µL per putje 1% B-S-A-P-B-S en incubeer de cellen nogmaals 30 minuten voor blokkering. Zodra de cellen zijn geblokkeerd, voegt u 50 µL per putje primaire antivirale M2-antilichamen toe, verdund in een verhouding van 1:1000, en incubeert u de platen gedurende één uur bij kamertemperatuur om eventueel aanwezige virale eiwitten te kleuren. Was na de incubatie de cellen drie keer in 1% B-S-A-P-B-S en incubeer ze gedurende één uur bij kamertemperatuur in het donker met 100 µL per putje secundaire antilichamen geconjugeerd aan een infraroodkleurstof in een verdunning van 1:200. Was de cellen, zodra ze zijn gekleurd, drie keer zoals eerder beschreven.Plaats vervolgens de platen op het leesglasplatform van de Licor Odyssey infraroodscanner. Selecteer de instelling voor 96-wellsplaten op de reader met behulp van de Licor Odyssey-software. Identificeer de blanco negatieve controlewells en kwantificeer vervolgens de fluorescentie van de gehele plaat.Gebruik de tool voor automatische vormen om het interessegebied of de ROI in het midden van een testput te tekenen. Gebruik de ROI van een negatieve controleput om de basislijnwaarde voor fluorescentie van de assay vast te stellen, en plaats vervolgens de twee tegengestelde kruisdraaden die door de Odyssey-software worden geleverd binnen de ROI om de intensiteit van de fluorescentie over de put te meten.Scan vervolgens de plaat met behulp van het 780 nanometer kanaal voor detectie en 680 nanometer als referentiegolflengte. Zodra het leescommando is geactiveerd, worden de fluorescentie-intensiteiten op uniforme intervallen van de ROI gemeten. Vervolgens worden de verzamelde datapunten geïntegreerd.Een standaarddeviatie-multiplier bepaalt het niveau van het signaal boven de basislijn dat in de ROI wordt opgenomen; zorg ervoor dat de optie geïntegreerde intensiteit voor berekeningen wordt geselecteerd, aangezien dit het netto pixelvolume voor gedefinieerde gebieden onafhankelijk van de grootte vertegenwoordigt. Achtergrondfluorescentie wordt gekwantificeerd aan de hand van de mock-geïnfecteerde controles en wordt gebruikt om de geïntegreerde intensiteit in de testputjes te schatten. De infraroodfluorescentie uit dubbele putjes die seriële verdunningen van getitreerd virus bevatten, wordt gebruikt om een standaardcurve op te stellen.De standaardcurve kan vervolgens worden gebruikt om de titers van BAL-vloeistof van geïnfecteerde muizen te bepalen. In dit experiment werd een significante toename van de virale load waargenomen op dag twee en vier. Na infectie was het virus op dag 10 geklaard, zoals hier wordt getoond.Virale titers gemeten met deze assay correleren goed met het gewichtsverlies bij muizen na infectie. Deze techniek kan ook worden toegepast op menselijke monsters. Hier wordt een kwantificering van het H1N1-virus uit een menselijk neusswab getoond.De detectielimiet hier is 10 tot de derde TCID of tissue culture infective dose. Na het bekijken van deze video heeft u een goed begrip van hoe u de influenza-virustiter kunt schatten met behulp van een assay op basis van infraroodkleurstof. Een visuele demonstratie van deze techniek is essentieel, omdat het gebruik van de corp imager moeilijk kan zijn; dit zal helpen bij het vereenvoudigen en demonstreren van onze methoden voor het kwantificeren van virustiters in een plaat met 96 of 384 putjes.En tot slot, vergeet niet dat werken met virussen extreem gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen, altijd moeten worden getroffen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

high-throughput-detection-method-for-influenza-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Redding van influenza A-virussen uit het plasmide DNA is een fundamentele en essentiële experimentele techniek die het mogelijk maakt influenza onderzoekers recombinante virussen te genereren om meerdere aspecten in de biologie van influenza virus te bestuderen en om te worden gebruikt als potentiële vectoren of vaccins.

Generatie van recombinant griepvirus uit plasmide-DNA

ampliPHOX colorimetrische detectie technologie wordt gepresenteerd als een goedkoop alternatief voor fluorescentie detectie voor microarrays. Op basis van fotopolymerisatie, ampliPHOX produceert vaste polymeer vlekken die zichtbaar zijn met het blote oog in slechts een paar minuten. Resultaten worden vervolgens afgebeeld en automatisch geïnterpreteerd met een eenvoudige maar krachtige software pakket.

ampliPHOX Colorimetrische Detectie op een DNA Microarray voor Influenza

Deze studie beschrijft diagnose van aviaire influenza bij wilde vogels met behulp van een draagbare RRT-PCR-systeem. De methode maakt gebruik van gevriesdroogde reagentia om het scherm wilde vogels in een niet-laboratorium setting, typisch voor een uitbraak scenario. Het gebruik van moleculaire technieken biedt nauwkeurige en gevoelige alternatieven voor een snelle diagnose.

Een snelle diagnose van aviaire influenza virus bij wilde vogels: Het gebruik van een Portable RRT-PCR en gevriesdroogd reagentia in het veld

In this video, we discuss the correlation between the CIT50 and the multiplicity of viral infections. The virus-infected cells display cytopathic effects, causing their death and detachment from the gold microelectrode, which in turn, reduces the impedance.

Impedance-Based Cellular Assay to Measure Multiplicity of Infection of Influenza Virus

The video demonstrates an assay for quantifying influenza viruses A and B. This assay employs nicking endonuclease amplification with influenza-specific primers and target detection using molecular beacon probes.

A Molecular-Based Assay for Quantifying Influenza A and B Viruses

Een geïntegreerde microfluïdische thermoplastische chip is ontwikkeld voor gebruik als een moleculaire diagnostische. De chip voert nucleïnezuur extractie, reverse transcriptase, en PCR. Werkwijzen voor het vervaardigen en gebruiken van een chip worden beschreven.

Microfluïdische chip fabricage en methode om Influenza Detect

Met behulp van een gedrukte glycaan-microarray-strategie werd een conventionele 96-wells plaat assay geminiaturiseerd voor analyse van hemagglutinine aviditeit en specificiteit voor sialic acid bevattende receptoren van het influenza A-virus.

Geminiaturiseerde Glycan Microarray Assay voor het beoordelen van Avidity en specificiteit van influenza A-virus hemagglutinine

We beschrijven een snelle, moleculair-gebaseerde Influenza A en B assay. De Influenza test detecteert elk doel binnen 15 minuten door het gebruik van isotherme amplificatie met influenza-specifieke primers, gevolgd door detectie van targets met moleculaire beacon sondes. De Influenza A en B test is gebruiksvriendelijk en vereist een minimale hands-on tijd om te presteren.

Snelle Moleculaire detectie en differentiatie influenzavirussen A en B

High-throughput testen van DNA en RNA gebaseerde pathogenen op nanoschaal PCR wordt omschreven met een syndromale honden en paarden luchtwegen PCR panel.

High-throughput detectie van respiratoire pathogene in dierlijke specimens door nanoschaal PCR

Deze studie beschrijft een   -Imaging gebaseerde micro-neutralisatietest de antigene relaties tussen virussen te analyseren. Het protocol maakt gebruik van een flatbed scanner en heeft vier stappen, waaronder titratie titratie kwantificering, neutralisatie, en neutralisatie kwantificering. De test werkt goed met de huidige circulerende influenza A (H1N1) pdm09, A (H3N2) en B-virussen.

Optimalisatie van een kwantitatieve micro-neutralisatie assay

We beschrijven het gebruik van een fenotypische fluorescentie-gebaseerde neuraminidase remming test om de gevoeligheid van influenza A en B virussen beoordelen in de neuraminidase-remmer klasse van antivirale middelen.

Fluorescentie gebaseerde neuraminidase remmingstest om de gevoeligheid van de influenza virussen zijn voorgesteld om de neuraminidase remmer Class of Antivirals

Leer een infraroodkleurstof-gebaseerde beeldvormingsmethode voor de detectie van influenzavirus in BAL-vloeistof van geïnfecteerde muizen. Deze techniek biedt hoge gevoeligheid met slechts 10 µl monster en is toepasbaar in 96- of 384-putjesplaten.

High-throughput Detection Methode voor Influenza Virus

Meer video's verkennen