MAME Modellen voor 4D live-cell imaging van de tumor: micro-omgeving interacties die van invloed zijn Maligne Progression

Het algemene doel van deze procedure is het bouwen van 3D co-cultuurmodellen, aangeduid als mammary architecture and microenvironment engineering, of MAM, voor gebruik bij live-cell imaging van cel-celinteracties in real-time. Dit wordt bereikt door eerst dekglasjes te coaten met een fibroblast D-gequenched, of DQ collageen one, collageen one-matrix.

Vervolgens wordt DQ-gequenchte collageen IV gebruikt. Gereconstitueerde basaalmembraanmatrix wordt toegevoegd bovenop de gestolde DQ-collageen I-matrix met daarin ingebedde fibroblasten. In de derde stap wordt een suspensie van epitheelcellen of tumorcellen over de dekglasjes gegoten, zodat de cellen kunnen hechten aan het DQ-collageen IV en de gereconstitueerde basaalmembraanmatrix, waarna medium wordt toegevoegd.

Ten slotte wordt confocale microscopie gebruikt voor 4D-beeldvorming, waarbij een beeld in drie ruimtelijke dimensies plus tijd van de levende mam-coculturen wordt geanalyseerd. Uiteindelijk maakt 4D-beeldvorming de visualisatie en analyse mogelijk van de dynamische interactie tussen borsttumorklellen en andere cellen van de tumoromgeving die van invloed kunnen zijn op de progressie naar een invasief fenotype. Een belangrijk voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals intravitale beeldvorming, is dat de interacties die in ons model worden waargenomen plaatsvinden tussen cellen van één soort, namelijk menselijke tumorcellen en menselijke tumor-geassocieerde cellen, in plaats van bijvoorbeeld tussen menselijke tumorcellen en muisstromale cellen.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode enige moeite hebben, omdat de assemblage van de hoofdkernculturen eerst gevisualiseerd moet worden en vervolgens een redelijke mate van vaardigheid en oefening vereist voor een succesvol resultaat. Begin met het plaatsen van één met alcohol gesteriliseerde rechthoekige plastic afdekking. Schuif deze in een 35 millimeter cultuurschaal of gebruik een IBI tree, 35 millimeter mu schaal.

Meng vervolgens het gewenste aantal fibroblasten met DQ-collageen. Pipetteer daarna met een micropipet van 100 µL voorzichtig 70 µL van het fibroblast-DQ-collageen, één collageen één matrix, over het gehele oppervlak van het dekglas en plaats de kweekschaal gedurende 30 minuten in de bevochtigde incubator van 37 °C zonder kooldioxide. Nadat de matrices zijn gestold, laat u deze 10 minuten equilibreren in een incubator van 37 °C met 5% kooldioxide.

Plaats de schaal vervolgens onder een zuigkast tot deze op kamertemperatuur is. Voeg 60 µL DQ-collageen, vier gereconstitueerde basaalmembraanmatrix toe bovenop het gestolde DQ-collageen, één collageen één-matrix met ingebedde fibroblasten. Verspreid vervolgens met een pipetpunt de DQ-collageen vier gereconstitueerde basaalmembraanmatrix voorzichtig en gelijkmatig, waarbij wordt voorkomen dat de fibroblasten in de DQ-collageen één, collageen één-matrix worden bekrast.

Plaats vervolgens de schaal en het dekglas gedurende 10 minuten in de incubator bij 37 °C met 5% carbon dioxide terwijl de DQ collagen four gereconstitueerde basaalmembraanmatrix stolt; trypsiniseer de cellen en tel de cellen voor de cocultuur. Plaats nu 50 µL van de celсусpensie op het gecoate dekglas en plaats de schaal gedurende 40 tot 60 minuten in een incubator bij 37 °C met 5% carbon dioxide om de cellen te laten hechten aan de DQ collagen four gereconstitueerde basaalmembraanmatrix. Nadat de cellen aan de matrix zijn gehecht, worden twee mL kweekmedium met 2% gereconstitueerde basaalmembraan aan de 35 mm schaal toegevoegd.

Incubeer vervolgens gedurende de gewenste periode voordat u beelden maakt; na het wassen met PBS worden de cocultures 45 minuten lang geïncubeerd met 5 µM CellTracker Orange in MEGM-medium in een incubator bij 37 °C en 5% CO2. Was de cocultures na de incubatie opnieuw met PBS en incubeer ze 30 minuten in voorverwarmd MEGM-medium in een incubator bij 37 °C en 5% CO2. Maak beelden van de levende cocultures bij een lage vergroting, bijvoorbeeld 10x met een water-immersielens op een confocale microscoop, en leg optische coupes vast met intervallen van 10 µm over de gehele diepte van de structuren.

Gebruik de optische coupes om de beelden in 3D te reconstrueren met Velocity-software of een vergelijkbaar programma. Maak films van de 3D-reconstructies, zodat de structuren, cel-cel interacties en interacties met de omringende matrix gevisualiseerd kunnen worden. In dit representatieve schema van een maim co-cultuur werd een IBI-behandelde muis-schotel eerst gecoat met collageen, één bevattend DQ-collageen, en één met fibroblasten, hier weergegeven in magenta.

Vervolgens werd een tweede laag gereconstitueerd basaalmembraan met DQ collagen four toegevoegd. Daarna werden tumorcellen in het rood bovenop het 2% gereconstitueerde basaalmembraan gezaaid. In cultuur.

Het medium, weergegeven door de crèmekleurige stippen, werd bij elke mediumwissel toegevoegd. De fluorescente splitsingsproducten van DQ collageen één en vier zijn in het groen weergegeven. Gedurende de 23 dagen van deze representatieve MCF 10 DCIS- en WS 12 TI-cocultuur werd proliferatie van de cellen waargenomen (rood, hier en in de volgende figuren), evenals degradatie van DQ collageen vier en één (groen, hier en in de volgende figuren) en van de collageenmatrices, zoals blijkt uit de afname van het volume van de coculturen.

Dezelfde levende cocultures werden gedurende 23 dagen geobserveerd, waarbij beelden werden vastgelegd met confocale microscopie op dag drie, 16 en 23 van de coculture. De interacties in de Mame-cocultures zijn dynamisch en kunnen in de loop van de tijd veranderen. Zo is, zoals te zien in dit 3D-model van de cel-mam-coculture op dag drie, op dit tijdstip net begonnen met prolifereren in de matrices; de situatie is nog vrij stabiel, wat blijkt uit de afwezigheid van groene fluorescentie.

Tegen dag 16, naarmate de cellen zijn blijven prolifereren, zijn ze echter ook begonnen met het afbreken van de matrixstructuur, zoals hier waargenomen met het DQ collagen, waarbij de splitsingsproducten één en vier in het groen verschijnen, en de actieve afbraak van de matrix door de cellen waar de matrix en de cellen samen fluoresceren, wat zichtbaar is in het geel. Tegen dag 23 is bijna de helft van de matrix afgebroken door de snel prolifererende cellen vergeleken met dag drie, toen het volume van de co-cultuur 110.000 µm³ was. Tussen dag 16 en 23 is het volume op deze dag gereduceerd tot slechts 46.250 µm³.

Bij de co-cultuur is de proteolyse van DQ collagen four aan het oppervlak van de DCIS-cellen in rood, en de diffuse proteolyse van DQ collagen, one in gebieden nabij de fibroblasten in wit waarneembaar. De differentiële kleuring die in deze co-cultuur wordt gebruikt, maakt het ook mogelijk om de afzonderlijke migratie- en proliferatiepatronen van de twee celtypen na hun ontwikkeling te observeren. Deze techniek baande de weg voor onderzoekers op het gebied van borstkanker om de effecten van de tumor-macro-omgeving op de progressie van kanker te verkennen, door gebruik te maken van live-cell imaging van dynamische interacties tussen kankercellen en omringende stromacellen.