Voorbereiden Individuele Drosophila Egg Chambers voor Live Imaging

Het doel van het volgende experiment is om dynamische processen in levende drosophila U-sites vast te leggen. Dit wordt bereikt door eerst intacte eierstokken te isoleren van goed gevoede, tweedagige vrouwelijke vliegen. In een tweede stap worden individuele ovaria uit de eierstokken geëxtraheerd om de eikamers te visualiseren.

Wanneer ze vervolgens een passend fluorescent eiwit tot expressie brengen, kunnen individuele eikamers direct worden afgebeeld of kunnen ze verdere manipulaties ondergaan, zoals micro-injectie van fluorescente markers voorafgaand aan de beeldvorming. Uiteindelijk kan door analyse van de filmsequenties de dynamische interactie van intracellulaire componenten worden onthuld. Deze methode heeft ons geholpen om enkele kernvragen op het gebied van RNA-transport en gelokaliseerde translatie te beantwoorden.

Hoe wordt bijvoorbeeld de expressie van eiwitten die het lichaamsplan bepalen in tijd en ruimte gereguleerd in het levende organisme? Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn aan deze methode moeite hebben, omdat er aanzienlijke snelheid en behendigheid vereist zijn. Met oefening zullen betere resultaten worden behaald.

Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de manipulaties van de eikamers moeilijk tekstueel over te brengen zijn en omdat technische expertise en een vaste hand van de onderzoeker vereist zijn. Begin deze procedure door een kleine druppel halogeenkoolstofolie op een dekglas te plaatsen en leg dit opzij. Narcoseer vervolgens de voorbereide vliegen met koolstofdioxide.

Gebruik een scherpe pincet met fijne punt om een dikke vrouwelijke vlieg aan de voorzijde van het abdomen vast te pakken. Pak de vlieg niet in het midden van het abdomen vast. Houd het vrouwtje ongeveer twee tot drie centimeter boven het voorbereide dekglas.

Verwijder met een tweede pincet het weefsel aan het uiterste posterieure uiteinde van het vrouwtje. Gebruik hiervoor schone pincetten; dit weefsel omvat gewoonlijk darmweefsel. Masseer de abdomen voorzichtig van het anterieure naar het posterieure uiteinde, alsof u tandpasta uit een tube knijpt.

De eierstokken zien eruit als grote ondoorzichtige structuren en zullen aan het uiteinde van de pincet blijven kleven. Verzamel de eierstokken door ze tegen de halo-koolstofolie op het objectglas aan te drukken. Herhaal dit proces vervolgens totdat er vier tot zes eierstokken zijn verzameld.

Voordat de aerials worden geïsoleerd, moet de lichtbron op de microscoop worden afgesteld zodat de verlichting onder een kleine hoek op het preparaat valt en contrasterende schaduwen op de weefsels werpt. Bij het dissekeren van de vliegen is het essentieel om de juiste instrumenten te gebruiken.

De aanwijzer die we gebruiken is niet te scherp om beschadiging van het weefsel te voorkomen, maar stomp genoeg zodat we de pincet die we gebruiken kunnen vastpakken. Opnieuw: niet te scherp zodat ze de weefsels niet beschadigen, maar net scherp genoeg zodat we zaken kunnen manipuleren zonder het instrument te buigen. Het is daarnaast zeer belangrijk om schone instrumenten te hebben, dus we reinigen deze regelmatig tijdens de procedure met gesloten pincetten.

Scheid de twee eierstokken door het verbindingsweefsel aan het posterieure uiteinde te verwijderen. Het posterieure uiteinde bevat de meest rijpe eikamers. Plaats een eierstok horizontaal, met de jongste eikamers naar uw dominante hand toe.

Pak vervolgens voorzichtig het posterieure uiteinde vast bij het resterende bindweefsel en gebruik een dissectiepen of wolfraamnaald om individuele ovaria te scheiden. Individuele eikamers van het Jamar-stadium tot stadium 10 zullen van elkaar scheiden, maar oudere eikamers blijven aan het ovarium vastzitten. Sleep met de pen voorzichtig 15 tot 25 gescheiden ovaria naar het midden van de oliedruppel. Als er meer dan één ovarium gedissecteerd moet worden, kies er dan één van een andere vlieg.

Verwijder al het overtollige eierstokweefsel en werk snel, aangezien de cytes fenotypische veranderingen zullen vertonen als gevolg van stress. Verwijder na 40 minuten na dissectie uit de eierstok het overtollige eierstokweefsel uit de olie. Gebruik schone instrumenten voor de injectie van cytes in het middenstadium en oriënteer de aerials loodrecht op de lange as van het dekglas. Om eikamers in een laat stadium te isoleren.

Een andere methode is vereist bij het vastpakken van de achterzijde van het ovarium, zoals eerder beschreven. Voer de dissectie-sonde in het achterste uiteinde van het ovarium in, vlakbij de pincet. Om te voorkomen dat de eikamers worden doorboord, dient de sonde tussen eikamers in een laat stadium te worden ingebracht.

Trek de dissectienaald door het ovarium tot deze naar buiten komt bij de eierkamers in het vroege stadium. Bij een correcte uitvoering verwijdert de naald het bindweefsel dat de aerials en eierkamers in het late stadium op hun plaats houdt. Herhaal deze stap totdat de aerials over het dekglas zijn uitgespreid.

Deze stap is voltooid wanneer de eikamers niet langer op elkaar gestapeld zijn. Gebruik een dissectiepincet om de eikamers in een laat stadium te scheiden, zodat de beeldvorming wordt vergemakkelijkt om stadium 14 te positioneren. Gebruik een pincet om de dorsale aanhangsels van de halskamers vast te pakken.

Bereid de te injecteren oplossingen voor door deze kortstondig op hoge snelheid te centrifugeren. Hiermee worden eventuele vaste neerslagen die de injectienaald kunnen blokkeren, neergeslagen. Vul vervolgens de injectienaald met een laadtip en bevestig de gevulde injectienaald zorgvuldig aan de injector.

Plaats nu een klein stukje glas naast de monsters en monteer het preparaat op de objecttafel van de microscoop. Het glas dient als wand om te breken of te openen. Verwijder de naald.

Bereid de microscoop en het injectieapparaat voor het experiment voor. Let er hierbij op dat de naaldpunt niet breekt. Gebruik indien mogelijk een automatische tafel met een puntbezoekfunctie om alle cellen in stadium acht en stadium negen te markeren voor injectie.

Laat nu de injectienaald zakken tot deze de olie raakt. Selecteer het eerste punt in de lijst met gemarkeerde punten en focus op de cyte. Laat de naald handmatig zakken tot deze zich in hetzelfde brandvlak bevindt als de cyte.

Beweeg met de bedieningselementen van de manipulator de punt van de injectienaald totdat deze zich in de U-plaats bevindt. Een snelle prikbeweging is vaak succesvoller dan een langzame beweging. Spuit zodra de naald is geplaatst een klein volume uit de naald en beoordeel de effecten visueel.

Herhaling is vereist. Als de injectie succesvol is, zal het cytoplasma binnen de cel worden verplaatst. De exacte hoeveelheid geïnjecteerde vloeistof is moeilijk te kwantificeren.

Om het geïnjecteerde volume te verhogen, kan men ofwel de druk of de duur van de injectiepuls aanpassen. Breek de naaldpunt af om de naaldopening enigszins te vergroten, of gebruik simpelweg meerdere injectiepulsen voordat het volgende mark.Cyte wordt geselecteerd. Til de injectienaald hoog genoeg in de olie op, zodat deze niet tegen andere cytes stoot.

Uitgebreid steken of het te lang laten zitten van de naald in de cyte beschadigt de eikammer ernstig. Wees daarom snel. De injectie moet minder dan 10 seconden duren.

Als er een fout wordt gemaakt, ga dan naar het volgende merkteken op een locatie. Verspil geen tijd aan beschadigde locaties. Wanneer de naald verstopt raakt, verplaats de naald dan naar het gebroken glasstuk.

Terwijl het glas en de naald zich in hetzelfde brandvlak bevinden, wordt de naald voorzichtig in het glas gedrukt. Controleer of de naald niet verstopt is door op de injectieknop te drukken en te kijken of er vloeistof uit de naaldpunt komt. Wanneer alle US-locaties zijn geïnjecteerd, wordt de naald handmatig uit de olie bewogen en buiten het lichtpad van de microscoop geplaatst.

Zorg voor een veilige oriëntatie om oogbeschadiging te voorkomen en schakel de lichten uit. Om fluorescente beeldvorming te faciliteren, is snelheid essentieel. Indien er een uur of langer is verstreken tussen de isolatie van de eikamers en de injectie van de cyten, zullen de cyten moeilijk te injecteren zijn en fenotypische veranderingen vertonen die geassocieerd worden met stress.

Vergelijkbare problemen kunnen ontstaan door ruwe behandeling van de cyte of het injecteren van te grote volumes. Eikamers die trenchgenische fluorescerende eiwitten tot expressie brengen, kunnen worden afgebeeld zonder dat injectie nodig is. MS-twee labeling van endogeen RNA kan met goede resultaten worden afgebeeld met behulp van de weefselisolatieprocedures via de volledige in vitro gesynthetiseerde procedure.

Toen Alexa 546 kin-RNA werd geïnjecteerd in een ME 31 BGFP-eierkamer, lokaliseerde het RNA zich in het dorsaal-anterieure deel van de cyte en vormde het een cap rond de kern zodra dit was beheerst. Deze techniek kan in ongeveer 10 minuten worden uitgevoerd, vanaf het moment van dissectie tot aan het begin van de beeldvorming. Let bij het uitvoeren van deze procedure op het weefsel door snel, maar zorgvuldig te werken. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe dynamische processen in levende Drosophila-cytes kunnen worden vastgelegd.