Name: Voorbereiden Individuele Drosophila Egg Chambers voor Live Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Leer hoe je individuele Drosophila-eikamers prepareert voor live imaging om mRNA-lokalisatie en dynamische intracellulaire processen te bestuderen. Deze methode combineert snelle dissectie met hoogresolutiebeeldvorming.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door een Wellcome Trust Senior Research Fellowship aan I. Davis.

1. Drosophila voorbereiding vóór het vertrek voor dissectie (Volgens E. Gavis, Princeton University) <ol><li> Gooi de volwassenen uit een dun gezaaid fles en zet de fles tot 25 ° C op voorhand van uw experiment. Zodra nieuwe volwassenen zijn begonnen te ontstaan, wacht twee dagen. </li><li> Neem een ​​vlieg flacon met ongeveer 10 ml van vast voedsel en voeg 0.5-0.7 gram droge gist (zie tabel) op een hoek van 45 graden. Bedek de gehele oppervlakte van de vlieg voedsel met gist. </li><li> Een paar druppels water op de gist voldoende te hydrateren (figuur 1A). Plaats de flacon van 45 graden en laat ongeveer 3 minuten voor de gist om te genieten van het water (Figuur 1B). </li></ol> Opmerking: Als alternatief, premix een gist plakken in een aparte container en de pasta aan de flacon toe te voegen met een spatel. <ol start="4"><li> Verdoof de vliegen in de flacon door het injecteren van CO 2-gas. Als ze stoppen met bewegen, kantelt het onbewuste vliegen op de CO 2 </sub&gt; fly pad voor het sorteren (Figuur 1C). </li><li> Isoleer 10-15 vrouwtjes en vijf mannetjes van de gewenste genotype onder een dissectie ruimte met een fijne tip penseel (figuur 1D). Mannetjes duidelijk zijn door de aanwezigheid van claspers, een donkere uitstekende constructie op hun achterste. </li><li> Selectie toevoegen vliegen om de gegiste flacon (figuur 1E). Plaats bij 25 ° C 24-60 uur. Incubeer gedurende kortere tijdsperioden voor een grotere procent van de jonge tot medio stadium ei kamers en langere termijnen voor de late fase ei kamers. </li></ol> 2. Drosophila vruchtbeginsel ontleding <ol><li> Een kleine druppel olie op een halogene nr. 1.5 22 x 50 mm dekglas (Figuur 2A). Stel de bereide dekglas de zijde waar het niet in de weg. </li><li> Verdoof de vliegen in de gegiste verachtelijke door het injecteren van CO 2-gas en tip op een CO 2-pad. </li><li> Gebruik scherpe fijn-nosed tang te vatten een individuele vrouwelijke vetgemest op de voorste van de buik (niet tussen ee buik thorax) (Figuur 2B-C). </li><li> Houd de vrouw met de tang en bekijken onder een stereomicroscoop, ongeveer 2-3 cm boven de voorbereide dekglaasje aan. </li><li> Nog steeds met de voorste, moet een tweede set van een tang het weefsel te verwijderen op de uiterste achterkant van het vrouwelijke (Figuur 2D). Let op: Gut weefsel meestal uit trekken met de achterste einde. Veeg het verwijderde weefsel van de tang. </li><li> Terwijl u nog steeds de vrouwelijke op de voorste, gebruikt u de afgeveegd tang om zachtjes knijpen of masseren van de buik, het werken vanuit de voorste naar de achterkant. Masseer de buik op dezelfde wijze als het verwijderen tandpasta het einde van een buis. </li><li> Twee grote ondoorzichtige structuren worden geschoven en de buik stok aan het einde van de tang (Figuur 2E-F). Dit zijn de gepaarde eierstokken. </li><li> Raak de eierstokken op de halogene olie op de dia hieronder. </li><li> Herhaal de dissectie 1-2 keer tot een totaal van 4-6 eierstokken te geven in de olie op het dekglaasje (Figure 2G). </li></ol> 3. Isoleren ovarioles Opmerking: Elke eierstok bevat ongeveer 16 ovarioles up van 6 tot 10 eieren kamers van verschillende stadia gerangschikt als kralen aan een snoer 10 gemaakt. Let op: Voorafgaand aan het isoleren van de ovarioles, de lichtbron aan te passen op de stereomicroscoop, zodat de verlichting valt onder een kleine hoek naar het monster. Dit geeft tegenstelling tot het monster en maakt visualisatie van de jonge fase ei kamers. <ol><li> In de olie te scheiden van de twee eierstokken door het verwijderen van het bindweefsel op het achterste einde (oud fasen) met gesloten tang (Figuur 3A). </li><li> Orient een individuele eierstok met de oudste stadia naar links en jongste fase naar rechts. De jonge stadium ei kamers in de eierstok zijn transparant en vormen de meer puntige uiteinde van de eierstok. </li><li> Met een pincet in de dominante hand, voorzichtig pak de achterkant van een eierstok, bij voorkeur door de overblijfselen van ee bindweefsel. Terwijl u de eierstok op zijn plaats met de tang, gebruik dan een dissectie sonde (of wolfraam naald) te plagen uit individuele ovarioles (figuur 3B-D). </li></ol> Opmerking: Individuele ovarioles zal breken tussen de jonge stadia (germarium tot 10 fase) als de oudere fasen zijn te groot om te worden gescheiden van de volledige eierstok. Let op: doorboort een laat stadium eicel met het ontleden van sonde zal resulteren in het cytoplasma lekken in de olie en maak extractie van individuele ovarioles zeer uitdagend. Als een laat stadium eicel wordt aangeprikt, ga dan naar een frisse eierstok. <ol start="4"><li> Zodra de ovariole vrij is van de eierstok, gebruikt u de ontleden sonde te slepen naar het midden van de olie-drop en oriënteren in de gewenste richting voor het experiment. Let op: Ovarioles in olie zal vestigen en zich aan het glas. </li><li> Herhaal dit proces (3.3 tot 3.4), totdat er 15-25 individuele ovarioles. Opmerking: Dit kan de dissectie van multip nodigle eierstokken. Het hele proces duurt minder dan 15 minuten. </li></ol> Opmerking: Het is aan te raden om een ​​eierstok elke ontleden van verschillende vliegen in plaats van het ontleden van beide eierstokken van minder vliegen aan de n aantal vliegen te verhogen voor het experiment. Opmerking: ruwe behandeling van de ovariole zal resulteren in ongezonde oöcyten en kan leiden tot artefacten in het experiment. Let op: eicellen zullen beginnen te fenotypische veranderingen als gevolg van 40 minuten na opengesneden uit de eierstok (vergelijk figuur 7E tot en met F) de nadruk weer te geven. <ol start="6"><li> Eenmaal ovarioles zijn op een adequate oriëntatie (figuur 3E), gebruikt u de sonde ontleden en gesloten tang om overtollig eierstokweefsel te verplaatsen uit de olie. Dit materiaal kan worden weggeveegd van de tang op een papieren handdoek. </li></ol> 4. Het isoleren van individuele laat stadium ei kamers (Volgens E. Gavis, Princeton University) <ol><li> Met een pincet in de Dominmier de hand, pakt u de achterkant van een geïsoleerde eierstok, bij voorkeur door de overblijfselen van het bindweefsel. Terwijl u de eierstok op zijn plaats met de tang, introduceren de ontleden sonde in het achterste eind van de eierstok in de buurt van de tang (figuur 4A). Vermijd het aanprikken van een ei kamers door het invoegen van de sonde tussen de late fase ei kamers. </li><li> Trek de naald door het ontleden van de eierstok totdat deze uit in een vroeg stadium ei kamers (Figuur 4B). Wanneer dit juist gebeurt, zal de sonde te verwijderen het bindweefsel die de ovarioles en laat stadium ei kamers op zijn plaats. </li><li> Herhaal stap 4.2 tot het ovarioles zijn verspreid op het dekglaasje aan. Opmerking: Als ei kamers niet meer gestapeld elkaar deze stap is voltooid. </li><li> De ontleden sonde scheiden eind oöcyten om gemakkelijk te kunnen beeldvorming (Figuur 4C). </li></ol> Let op: doorboort een eicel, terwijl ontleden laat stadium ei kamers is niet zo veroordelen als bij het ontleden van iNDIVIDUELE ovarioles voor jongere stadia. Opmerking: Voor fase 14 ei kamers, gebruik de tang om de dorsale aanhangsels voor oriëntatie te begrijpen. 5. Injectie voorbereiding Opmerking: Voor de injectie van medio stadium eicellen, richt u de ovarioles loodrecht op de lengteas van het dekglas. <ol><li> Zet de imaging microscoop [in ons geval een DeltaVision Core van Applied Precision] en plaats de juiste beeldvorming instellingen (Figuur 5A-B). </li><li> Zet de injectie apparaat (figuur 5C). </li><li> Plaats de injectienaald met een laad-tip (figuur 5D-E). Oplossingen voor worden geïnjecteerd moeten kort worden gecentrifugeerd bij hoge snelheid aan deposito&#39;s die de injectienaald kunnen blokkeren te vermijden. </li><li> Bevestig de geladen injectienaald op de injector. Zorg om te voorkomen dat het breken van de naald (Figuur 5F). </li><li> Om u te helpen met ontstoppen naalden, leg dan een klein stukje glas 2x10 mm van een snee of gebroken dekglaasje eent een zijde van de oliedruppel met de ovarioles. Zorg ervoor dat dit glas fragment is bedekt met olie. Dit glas zal dienen te rammen van de naald tegen de voor het breken of ontstoppen van de naald. </li></ol> 6. Injectie van fluorescerende RNA Voordat u begint: Stel de injectie apparatuur en micro-manipulator controles zodanig dat de injectienaald zich boven het centrum van het gezichtsveld. <ol><li> Plaats het monster te injecteren in de microscooptafel. </li><li> Selecteer de 20x doelstelling. Hogere of lagere vergroting doelstellingen kunnen ook worden gebruikt. </li></ol> Opmerking: Als u een geautomatiseerde podium met punt bezoek aan mogelijkheden is het raadzaam om de etappe te markeren 8-9 eicellen voor injectie voordat u begint. Dit zorgt voor een eenvoudig bezoek aan en de injectie van geselecteerde eicellen. <ol start="3"><li> Laat de injectienaald tot hij raakt de olie. Centreer de naald over het objectief. </li><li> Draaienoff verlichting in de kamer en zet de bright-field licht voor de microscoop. Selecteer het eerste punt (eicel) op de gemarkeerde punten lijst. Kijk door de oculairs, richten zich op de eicel (figuur 6A). </li><li> Handmatig verlaagt de naald tot het in hetzelfde vlak van focus als de eicel en zichtbaar naast de eicel. </li><li> Met behulp van de manipulator, plaatst u de punt van de injectienaald tot hij zich in de eicel. Een snelle stekende beweging is vaak meer succes dan een langzaam vooruit. Eenmaal binnen, werpen een klein volume van de naald en visueel beoordelen van de effecten, te herhalen indien nodig. Als de injectie succesvol is, zal het cytoplasma in de eicel worden verplaatst, als dit niet duidelijk is, herhaal. Het is niet nodig beeld fluorescentie te bepalen of materiaal geïnjecteerd. Na de injectie, verwijder de naald uit in de eicel (figuur 6B-G). </li><li> De precieze hoeveelheid vloeistof geïnjecteerd is moeilijk te kwantificeren. Om de geïnjecteerde volume, automati te verhogenst de druk of de tijd van de injectie puls, breek de naald om de opening licht stijgen of herhaalde injectie pulsen te gebruiken. </li></ol> Opmerking: Het hele injectie proces duurt minder dan 10 seconden op de juiste wijze uitgevoerd. Uitgebreide stekende of slepende met de naald naar binnen om eicel zal resulteren in ernstige schade aan de ei kamer. <ol start="8"><li> Voor het selecteren van de gemarkeerde eicel, verhoging van de injectienaald hoog genoeg in de olie om geen andere oöcyten contact wordt de afstand. </li><li> In het nieuwe eicel, herhaalt u stap 6.6. Ga door op deze manier tot alle benodigde eicellen worden geïnjecteerd. </li></ol> Opmerking: Als een fout is gemaakt tijdens het injecteren, naar de volgende gemarkeerd eicel. Verspil geen tijd op beschadigde eicellen. Opmerking: De naald kan verstopt raken tijdens een injectie sessie. In dit geval zet de naald nabij de gebroken stuk glas in de olie op het dekglaasje. Verstandh het glas en de naald in hetzelfde focal plane, zacht ram de naald in het glas (figuur 6H). Test dat de naald verstopt raken door op de injectie-knop en te kijken of alle vloeistof verlaat de punt van de naald. <ol start="10"><li> Als alle eicellen zijn geïnjecteerd, verplaats de naald omhoog, uit de olie en richt het uit van de bundel pad voor de microscoop. Zorg ervoor dat het in een veilige richting, om te voorkomen dat schade aan de ogen. </li></ol> Opmerking: Als een langere periode van tijd is verstreken tussen de ei kamer isolatie en eicel injectie, eicellen zal moeilijk zijn om te injecteren en vertonen fenotypische veranderingen die gepaard gaan met stress. Soortgelijke problemen kunnen ontstaan ​​met een ruwe behandeling van de eicel of de injectie van overtollige volumes (vergelijk figuren 6I, J, K). 7. Live beeldvorming experimenteel design <ol><li> Selecteer de eerste geïnjecteerde eicel uit de lijst. Test dat de injectie was in de eicel door de beeldvorming een frame in fluorescentie (eens in figuur 6G). </li><li> Configureer de experimentele parameters, waaronder: excitatie golflengte, emissie-pad, excitatie tijd, Z-stack en de tijd tussen de collecties. Opmerking: Voor meer informatie hierover, zie Parton R., et al.. (2010) 2. </li><li> Verzamel de dataset. </li></ol> 8. Representatieve resultaten In vitro gesynthetiseerd Alexa-546 grk RNA geïnjecteerd in een Me31B :: GFP ei kamer (Figuur 7A). Het RNA lokaliseert aan de dorsale anterieure van de eicel en vormt een pet rond de kern (Figuur 7B). Voor meer voorbeelden van RNA-lokalisatie te zien MacDougall N., et al.. (2003) 11. Midden en late fase eicellen te drukken fluorescent gelabelde eiwitten (Tau-GFP, figuur 7C) of RNA-tagging-systemen (GRK * mCherry, figuur 7D) kunnen worden afgebeeld zonder injectie. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig1.jpg" /> Figuur 1. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig2.jpg" /> Figuur 2. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig3.jpg" /> Figuur 3. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig4.jpg" /> Figuur 4. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig5.jpg" /> Figuur 5. <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig6.jpg" /> Figuur 6. <img alt="Figuur 7" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig7.jpg" /> Figuur 7.

<ol><li>Arias, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+and+the+development+of+biology+in+the+20th+century%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster and the development of biology in the 20th century.</a> Methods Mol. Biol. 420, 1-25 (2008).</li>
<li>Parton, R. M., Valles, A. -M., Dobbie, I. D., Davis, I. Pushing the Limits of Live Cell Imaging in Drosophila. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aParton%2C+RM+%22Live+Cell+Imaging%3A+A+Laboratory%22">Live Cell Imaging: A Laboratory</a>. Goldman, R. D., Swedlow, J. R., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 387-418 (2010).</li>
<li>Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+messages%3A+the+intracellular+localization+of+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Moving messages: the intracellular localization of mRNAs.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (5), 363-375 (2005).</li>
<li>Jansen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+Localization%3A+Message+on+the+Move%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">mRNA Localization: Message on the Move.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 247-256 (2001).</li>
<li>Van De Bor, V., Hartswood, E., Jones, C., Finnegan, D., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gurken+and+the+I+factor+retrotransposon+RNAs+share+common+localization+signals+and+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">gurken and the I factor retrotransposon RNAs share common localization signals and machinery.</a> Dev. Cell. 9 (1), 51-62 (2005).</li>
<li>Delanoue, R., Herpers, B., Soetaert, J., Davis, I., Rabouille, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Squid%2FhnRNP+helps+Dynein+switch+from+a+gurken+mRNA+transport+motor+to+an+ultrastructural+static+anchor+in+sponge+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila Squid/hnRNP helps Dynein switch from a gurken mRNA transport motor to an ultrastructural static anchor in sponge bodies.</a> Dev. Cell. 13 (4), 523-538 (2007).</li>
<li>Jaramillo, A. M., Weil, T. T., Goodhouse, J., Gavis, E. R., Schupbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+fluorescently+labeled+endogenous+gurken+mRNA+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">The dynamics of fluorescently labeled endogenous gurken mRNA in Drosophila.</a> J. Cell. Sci. 121 (Pt. 6), 887-894 (2008).</li>
<li>Forrest, K. M., Gavis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+endogenous+mRNA+reveals+a+diffusion+and+entrapment+mechanism+for+nanos+mRNA+localization+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Live imaging of endogenous mRNA reveals a diffusion and entrapment mechanism for nanos mRNA localization in Drosophila.</a> Curr. Biol. 13, 1159-1168 (2003).</li>
<li>Bertrand, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Mol. Cell. 2 (4), 437-445 (1998).</li>
<li>Spradling, A. C. Developmental genetics of oogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpradling%2C+AC+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Martinez-Arias, A. 1, Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor. 1-70 (1993).</li>
<li>MacDougall, N., Clark, A., MacDougall, E., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+gurken+%28TGFalpha%29+mRNA+localizes+as+particles+that+move+within+the+oocyte+in+two+dynein-dependent+steps%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila gurken (TGFalpha) mRNA localizes as particles that move within the oocyte in two dynein-dependent steps.</a> Dev. Cell. 4 (3), 307-319 (2003).</li>
<li>Tekotte, H., Tollervey, D., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+migrating+border+cell+cluster+in+living+Drosophila+egg+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Imaging the migrating border cell cluster in living Drosophila egg chambers.</a> Dev. Dyn. 236 (10), 2818-2824 (2007).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R., Davis, I., Gavis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+bicoid+mRNA+anchoring+highlight+conserved+mechanisms+during+the+oocyte-to-embryo+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Changes in bicoid mRNA anchoring highlight conserved mechanisms during the oocyte-to-embryo transition.</a> Curr. Biol. 18, 1055-1061 (2008).</li>
<li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nat. Protoc. 2 (10), 2467-2473 (2007).</li>
<li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

<html> Live cell imaging is een krachtige test voor de behandeling van cellulaire processen in real time. Naast eenvoudige helder veld observatie, de toevoeging van fluorescerende labels eiwitten en RNA van belang heeft tot vele doorbraken. Hier hebben we aangegeven een protocol voor de beeldvorming natuurlijke persoon die eicellen die in combinatie worden gebruikt met genetische en biochemische assays. In dit protocol hebben we ook uitgelegd hoe je experimenteel leven eicellen te manipuleren door middel van injectie. Er zijn vele mogelijkheden voor materiaal te injecteren, zoals in vitro gesynthetiseerd fluorescent gelabelde RNA assay het vermogen van een secundaire structuur directe RNA lokalisatie (kogel en Davis, niet gepubliceerd) en antilichamen die de functie van eiwitten 6 remmen. Toekomstig werk zal waarschijnlijk zien de invoering van andere etikettering componenten en cellulaire machinerie tot leven eicellen waardoor moleculaire mechanismen te testen. t &quot;&gt; Behoud van de leefbaarheid en de gezondheid van het weefsel essentieel is bij het werken met levende cellen. In dit protocol, we wijzen op een aantal stappen die kunnen leiden tot stress van de ei kamer. bijvoorbeeld, ondanks de olie superieur voor de beeldvorming, uitgebreide cultuur in de olie kan leiden tot stress op het ei kamer. Dit kan gemakkelijk worden gecontroleerd onder helderveld blootstelling door onderzoek van de nucleaire morfologie en positie, eicel membraan dat zal verstoren en blaar onder stress (vergelijk figuur 7E (onbeklemtoonde) naar Figure7F ( benadrukt)). Etappe 9 ei kamers tonen RNA lokalisatie en grens celmigratie 12 over meerdere uren. echter een fase 7/8 ei kamer zal beginnen om nadelige gevolgen in Halo carbon olie vertonen na ongeveer 40 minuten van de eierstokken worden verwijderd uit de vrouw. laat stadium ei kamers, trap 11 tot 14, kan normaal ontwikkelen in olie of waterige media als gevolg van de afscheiding van de eischaal uit de follikel cellen op deze stadia 13. Het is al reported dat de toevoeging van insuline aan waterige insect medium kan Etappe 9 eicellen te behouden voor maximaal 6 uur 14 en germaria tot 14 uur 15. In alle gevallen dient de agressieve manoeuvres van de ei kamer worden vermeden, omdat het wijst op de eicellen en vermindert de levensvatbaarheid ervan. Imaging minder ei kamers en de zorg voor de behandeling van elk is voorzichtig de beste manier om een ​​optimale levensvatbaarheid te garanderen.

Instrumenten die in de dissectie moet schoon zijn, maar hoeven niet te worden geautoclaveerd. Veeg gereedschappen met EtOH en laat ze drogen voordat u begint. <table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Fijn getipt kwast (Kunstenaars Sable, rond, grootte 00 of 0) </td><td> Verkrijgbaar bij de meeste kunstbenodigdheden verkooppunten </td><td></td><td> Een goede borstel belangrijk </td></tr><tr><td> Halocarbon Products Corporation, serie 95 </td><td> Halocarbon Products Corporation, 887 Kinderkamack Road, River Edge NJ 07661 </td><td></td><td> Europese distributeur: Solvadis (GmbH) Zorg ervoor dat zuurstof door borrelen lucht door de olie. </td></tr><tr><td> Dekglas-nr. 1,5, 22 x 50mm </td><td> International-No1-VWR Cat = 631-0137-22-50mm </td><td> Menzel-Glaser-22-40mm-mnj 400-070T </td><td></td></tr><tr><td> Dumont No.5 - Dumostar </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11253-20 </td><td> &quot;Biologie&quot; tip is ook goed, maar kwetsbaarder </td></tr><tr><td> Het ontleden van probe </td><td> Fine Science Tools </td><td> 10140-01 </td><td></td></tr><tr><td> Het ontleden van microscoop </td><td> Olympus </td><td> SZ61 </td><td></td></tr><tr><td> CO2-pad </td><td> Verkrijgbaar via <a href="http://www.flystuff.com">http://www.flystuff.com</a> / (Een divisie van Genesee Scientific) </td><td> 59-114 (789060 Dutscher) </td><td> Europese distributeur: www. dutscherscientific. com</a> / Het is ook relatief eenvoudig om op maat bouwen van uw eigen fly pads </td></tr><tr><td> KimCare </td><td> Kimbery Clark-KimCare-Medical doekjes </td><td> KLEW3020 </td><td></td></tr><tr><td> Microscoop-DeltaVision </td><td> Toegepaste Precision </td><td> DC-CORE </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulator </td><td> Burleigh Micromanipulators van Lumen Dynamics Group inc. 2260 Argentia Road, Mississauga, Ontario, L5N 6H7 Canada </td><td> Burleigh PCS-5000-serie, TS-5000-300 </td><td> <a href="http://www.ldgi-burleigh.com">http://www.ldgi-burleigh.com</a> / (Voorheen Exfo) </td></tr><tr><td> Injectie apparatuur </td><td> TriTech Research, Inc 2961 Veteraan Ave Los Angeles, CA 90064 </td><td> MINJ-1 </td><td> Gewijzigd met een houder voor Eppendorf Femptotips te nemen </td></tr><tr><td> Injectienaald </td><td> Eppendorf Steriele Femtotips I en II </td><td> 930000043 </td><td> Verschillende tips zijn beter voor verschillende toepassingen </td></tr><tr><td> Laden tips 20μl </td><td> Eppendorf </td><td> 5242956.003 </td><td></td></tr><tr><td> Droge gist </td><td> Fleischmann&#39;s Yeast </td><td> # 2192 </td><td></td></tr></tbody></table>

voorbereiden individuele drosophila egg chambers voor live imaging

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Levende cellen imaging is een belangrijke techniek toegepast op een aantal van Drosophila weefsels als model onderwerpen als as specificatie, celdifferentiatie en Organogenese een te onderzoeken. De juiste voorbereiding van de experimentele monsters is een cruciaal, vaak genegeerd, stap. Het doel van de voorbereiding is om fysiologische relevantie en zorgen voor optimale beeldvorming voorwaarden vast te stellen. Voor het behoud levensvatbaarheid van het weefsel, is het essentieel om dehydratie, hypoxie, oververhitting of medium verslechtering te voorkomen 2. De Drosophila ei kamer is een goed opgezet systeem voor de behandeling van vragen over, maar niet beperkt tot, het lichaam patronen, mRNA lokalisatie en de organisatie van het cytoskelet 3,4. Voor de vroege-en midden-stage ei kamers, montage in halogene olie is goed om te overleven in dat het gratis diffusie van zuurstof mogelijk maakt, voorkomt uitdroging en hypoxie en heeft een uitstekende optische eigenschappen voor microscopie. Imveroudering van fluorescente eiwitten mogelijk door het invoeren van transgenen in het ei kamer of fysische injectie van gelabelde RNA, eiwit of antilichamen 5-7. Bijvoorbeeld toevoeging van MS2-constructen in het genoom van dieren kunnen real time waargenomen mRNA in de eicel 8. Deze constructies zorgen voor in-vivo-etikettering van mRNA door middel van gebruik van de bacteriofaag MS2 RNA stam-lus interactie met zijn vacht eiwit 9. Hier presenteren we een protocol voor de winning van eierstokken en het isoleren van individuele ovarioles en ei kamers van de vrouwelijke Drosophila. Voor een gedetailleerde beschrijving van Drosophila oögenese See Allan C. Spradling (1993, herdruk 2009) 10.

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Ei kamer is een uitstekend model voor het bestuderen van de mechanismen van mRNA lokalisatie. Met het oog op de dynamische gebeurtenissen die de processen van de lokalisatie ten grondslag liggen vast te leggen, is een snelle hoge resolutie beeldvorming van levend weefsel nodig is. Hier presenteren we een protocol voor dissectie en beeldvorming van levende monsters met een minimale verstoring.

Voorbereiden Individuele Drosophila Egg Chambers voor Live Imaging

Live-cell imaging is een belangrijke techniek die wordt toegepast op diverse Drosophila-weefsels die als modellen dienen om onderwerpen te onderzoeken zoals axis-specificatie, ...

Het doel van het volgende experiment is om dynamische processen in levende drosophila U-sites vast te leggen. Dit wordt bereikt door eerst intacte eierstokken te isoleren van goed gevoede, tweedagige vrouwelijke vliegen. In een tweede stap worden individuele ovaria uit de eierstokken geëxtraheerd om de eikamers te visualiseren.Wanneer ze vervolgens een passend fluorescent eiwit tot expressie brengen, kunnen individuele eikamers direct worden afgebeeld of kunnen ze verdere manipulaties ondergaan, zoals micro-injectie van fluorescente markers voorafgaand aan de beeldvorming. Uiteindelijk kan door analyse van de filmsequenties de dynamische interactie van intracellulaire componenten worden onthuld. Deze methode heeft ons geholpen om enkele kernvragen op het gebied van RNA-transport en gelokaliseerde translatie te beantwoorden.Hoe wordt bijvoorbeeld de expressie van eiwitten die het lichaamsplan bepalen in tijd en ruimte gereguleerd in het levende organisme? Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn aan deze methode moeite hebben, omdat er aanzienlijke snelheid en behendigheid vereist zijn. Met oefening zullen betere resultaten worden behaald.Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de manipulaties van de eikamers moeilijk tekstueel over te brengen zijn en omdat technische expertise en een vaste hand van de onderzoeker vereist zijn. Begin deze procedure door een kleine druppel halogeenkoolstofolie op een dekglas te plaatsen en leg dit opzij. Narcoseer vervolgens de voorbereide vliegen met koolstofdioxide.Gebruik een scherpe pincet met fijne punt om een dikke vrouwelijke vlieg aan de voorzijde van het abdomen vast te pakken. Pak de vlieg niet in het midden van het abdomen vast. Houd het vrouwtje ongeveer twee tot drie centimeter boven het voorbereide dekglas.Verwijder met een tweede pincet het weefsel aan het uiterste posterieure uiteinde van het vrouwtje. Gebruik hiervoor schone pincetten; dit weefsel omvat gewoonlijk darmweefsel. Masseer de abdomen voorzichtig van het anterieure naar het posterieure uiteinde, alsof u tandpasta uit een tube knijpt.De eierstokken zien eruit als grote ondoorzichtige structuren en zullen aan het uiteinde van de pincet blijven kleven. Verzamel de eierstokken door ze tegen de halo-koolstofolie op het objectglas aan te drukken. Herhaal dit proces vervolgens totdat er vier tot zes eierstokken zijn verzameld.Voordat de aerials worden geïsoleerd, moet de lichtbron op de microscoop worden afgesteld zodat de verlichting onder een kleine hoek op het preparaat valt en contrasterende schaduwen op de weefsels werpt. Bij het dissekeren van de vliegen is het essentieel om de juiste instrumenten te gebruiken.De aanwijzer die we gebruiken is niet te scherp om beschadiging van het weefsel te voorkomen, maar stomp genoeg zodat we de pincet die we gebruiken kunnen vastpakken. Opnieuw: niet te scherp zodat ze de weefsels niet beschadigen, maar net scherp genoeg zodat we zaken kunnen manipuleren zonder het instrument te buigen. Het is daarnaast zeer belangrijk om schone instrumenten te hebben, dus we reinigen deze regelmatig tijdens de procedure met gesloten pincetten.Scheid de twee eierstokken door het verbindingsweefsel aan het posterieure uiteinde te verwijderen. Het posterieure uiteinde bevat de meest rijpe eikamers. Plaats een eierstok horizontaal, met de jongste eikamers naar uw dominante hand toe.Pak vervolgens voorzichtig het posterieure uiteinde vast bij het resterende bindweefsel en gebruik een dissectiepen of wolfraamnaald om individuele ovaria te scheiden. Individuele eikamers van het Jamar-stadium tot stadium 10 zullen van elkaar scheiden, maar oudere eikamers blijven aan het ovarium vastzitten. Sleep met de pen voorzichtig 15 tot 25 gescheiden ovaria naar het midden van de oliedruppel. Als er meer dan één ovarium gedissecteerd moet worden, kies er dan één van een andere vlieg.Verwijder al het overtollige eierstokweefsel en werk snel, aangezien de cytes fenotypische veranderingen zullen vertonen als gevolg van stress. Verwijder na 40 minuten na dissectie uit de eierstok het overtollige eierstokweefsel uit de olie. Gebruik schone instrumenten voor de injectie van cytes in het middenstadium en oriënteer de aerials loodrecht op de lange as van het dekglas. Om eikamers in een laat stadium te isoleren.Een andere methode is vereist bij het vastpakken van de achterzijde van het ovarium, zoals eerder beschreven. Voer de dissectie-sonde in het achterste uiteinde van het ovarium in, vlakbij de pincet. Om te voorkomen dat de eikamers worden doorboord, dient de sonde tussen eikamers in een laat stadium te worden ingebracht.Trek de dissectienaald door het ovarium tot deze naar buiten komt bij de eierkamers in het vroege stadium. Bij een correcte uitvoering verwijdert de naald het bindweefsel dat de aerials en eierkamers in het late stadium op hun plaats houdt. Herhaal deze stap totdat de aerials over het dekglas zijn uitgespreid.Deze stap is voltooid wanneer de eikamers niet langer op elkaar gestapeld zijn. Gebruik een dissectiepincet om de eikamers in een laat stadium te scheiden, zodat de beeldvorming wordt vergemakkelijkt om stadium 14 te positioneren. Gebruik een pincet om de dorsale aanhangsels van de halskamers vast te pakken.Bereid de te injecteren oplossingen voor door deze kortstondig op hoge snelheid te centrifugeren. Hiermee worden eventuele vaste neerslagen die de injectienaald kunnen blokkeren, neergeslagen. Vul vervolgens de injectienaald met een laadtip en bevestig de gevulde injectienaald zorgvuldig aan de injector.Plaats nu een klein stukje glas naast de monsters en monteer het preparaat op de objecttafel van de microscoop. Het glas dient als wand om te breken of te openen. Verwijder de naald.Bereid de microscoop en het injectieapparaat voor het experiment voor. Let er hierbij op dat de naaldpunt niet breekt. Gebruik indien mogelijk een automatische tafel met een puntbezoekfunctie om alle cellen in stadium acht en stadium negen te markeren voor injectie.Laat nu de injectienaald zakken tot deze de olie raakt. Selecteer het eerste punt in de lijst met gemarkeerde punten en focus op de cyte. Laat de naald handmatig zakken tot deze zich in hetzelfde brandvlak bevindt als de cyte.Beweeg met de bedieningselementen van de manipulator de punt van de injectienaald totdat deze zich in de U-plaats bevindt. Een snelle prikbeweging is vaak succesvoller dan een langzame beweging. Spuit zodra de naald is geplaatst een klein volume uit de naald en beoordeel de effecten visueel.Herhaling is vereist. Als de injectie succesvol is, zal het cytoplasma binnen de cel worden verplaatst. De exacte hoeveelheid geïnjecteerde vloeistof is moeilijk te kwantificeren.Om het geïnjecteerde volume te verhogen, kan men ofwel de druk of de duur van de injectiepuls aanpassen. Breek de naaldpunt af om de naaldopening enigszins te vergroten, of gebruik simpelweg meerdere injectiepulsen voordat het volgende mark.Cyte wordt geselecteerd. Til de injectienaald hoog genoeg in de olie op, zodat deze niet tegen andere cytes stoot.Uitgebreid steken of het te lang laten zitten van de naald in de cyte beschadigt de eikammer ernstig. Wees daarom snel. De injectie moet minder dan 10 seconden duren.Als er een fout wordt gemaakt, ga dan naar het volgende merkteken op een locatie. Verspil geen tijd aan beschadigde locaties. Wanneer de naald verstopt raakt, verplaats de naald dan naar het gebroken glasstuk.Terwijl het glas en de naald zich in hetzelfde brandvlak bevinden, wordt de naald voorzichtig in het glas gedrukt. Controleer of de naald niet verstopt is door op de injectieknop te drukken en te kijken of er vloeistof uit de naaldpunt komt. Wanneer alle US-locaties zijn geïnjecteerd, wordt de naald handmatig uit de olie bewogen en buiten het lichtpad van de microscoop geplaatst.Zorg voor een veilige oriëntatie om oogbeschadiging te voorkomen en schakel de lichten uit. Om fluorescente beeldvorming te faciliteren, is snelheid essentieel. Indien er een uur of langer is verstreken tussen de isolatie van de eikamers en de injectie van de cyten, zullen de cyten moeilijk te injecteren zijn en fenotypische veranderingen vertonen die geassocieerd worden met stress.Vergelijkbare problemen kunnen ontstaan door ruwe behandeling van de cyte of het injecteren van te grote volumes. Eikamers die trenchgenische fluorescerende eiwitten tot expressie brengen, kunnen worden afgebeeld zonder dat injectie nodig is. MS-twee labeling van endogeen RNA kan met goede resultaten worden afgebeeld met behulp van de weefselisolatieprocedures via de volledige in vitro gesynthetiseerde procedure.Toen Alexa 546 kin-RNA werd geïnjecteerd in een ME 31 BGFP-eierkamer, lokaliseerde het RNA zich in het dorsaal-anterieure deel van de cyte en vormde het een cap rond de kern zodra dit was beheerst. Deze techniek kan in ongeveer 10 minuten worden uitgevoerd, vanaf het moment van dissectie tot aan het begin van de beeldvorming. Let bij het uitvoeren van deze procedure op het weefsel door snel, maar zorgvuldig te werken. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe dynamische processen in levende Drosophila-cytes kunnen worden vastgelegd.

preparing-individual-drosophila-egg-chambers-for-live-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een eenvoudige, goedkope en effectieve methode voor de bereiding Drosophila embryo's voor live-imaging analyse wordt gepresenteerd. Onze-protocol zorgt voor vochtigheid en gas uit te wisselen en comprimeert niet de Drosophila embryo. Deze methode is geschikt voor het GFP-gebaseerde live beeldvorming van Drosophila embryo's met behulp van een stereomicroscoop of rechtop samengestelde microscoop.

De voorbereiding van Drosophila Embryo&#39;s voor Live-Imaging Met behulp van de Opknoping Drop Protocol

Drosophila hemocytes verspreiden over het geheel van de zich ontwikkelende embryo. Dit protocol laat zien hoe te monteren en het imago van deze migraties met behulp van embryo's met fluorescent gelabelde hemocytes.

Live-beeldvorming van Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migraties

De voorbereiding van de ontwikkeling en Adult Drosophila Hersenen en retinae voor Live Imaging

Een protocol voor levende beeldvorming van GFP-gemerkte eiwitten of autofluorescerende structuren in...

Imaging leven van GFP-gemerkte eiwitten in<em&gt; Drosophila</em&gt; Eicellen

De rechtopstaande beeldvormingsmethode die in dit protocol wordt beschreven, maakt de gedetailleerde visualisatie mogelijk van de polen van een zich ontwikkelend Drosophila melanogaster -ei. Deze uiteinden-op-weergave biedt een nieuw perspectief op de arrangementen en morfologieën van meerdere celtypen in het folliculaire epitheel.

Rechtop Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Egg Chambers

Hier gepresenteerd is een protocol om micro-injectie en tegelijkertijd beeld meerdere Drosophila embryo's tijdens de embryonale ontwikkeling met behulp van een plaat-gebaseerde, hoog gehalte imager.

Drosophila Embryo Preparatuur en microinjectie voor live celmicroscopie uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde high content analyzer

Op lichtplaten gebaseerde fluorescentiemicroscopie is het meest waardevolle hulpmiddel in de ontwikkelingsbiologie. Een belangrijk probleem in vergelijkende studies is de variantie van de omgeving. Ons protocol beschrijft een experimenteel kader voor gelijktijdige live beeldvorming van meerdere specimens en pakt dit probleem daarom proactief aan.

Gelijktijdige live beeldvorming van meerdere insectenembryo's in op de kamer gebaseerde fluorescentiemicroscopen

Het doel van dit protocol is om live imaging te gebruiken om de effecten van oxidatieve schade op de lokalisatie en dynamiek van subcellulaire structuren in Drosophila eierstokken te visualiseren.

Visualiseren van de effecten van oxidatieve schade op Drosophila Egg Chambers met behulp van Live Imaging

In Drosophilaondergaat de oöcytkern microtubuli-afhankelijke migratie tijdens oogenese. Hier beschrijven we een protocol dat is ontwikkeld om de migratie te volgen door live beeldvorming uit te voeren op eierkamers ex-vivo. Onze procedure houdt de eierkamers 12 uur in leven om multi-position 3D time-lapse films te verkrijgen met behulp van spinning-disk confocale microscopie.

Nucleaire migratie in de Drosophila Oocyte

Hier bieden we een gedetailleerd protocol om live beeldvorming uit te voeren van de asymmetrische deling van germinale stamcellen (GSC's) in de Drosophila ovarium-niche. We gebruiken een transgene lijn die ubiquitair een groen fluorescent eiwit (GFP) tot expressie brengt, een fusie van het spectrosoom-eiwit Par-1.

Uitgebreide live beeldvorming van vrouwelijke Drosophila melanogaster kiembaanstammecellen niches

Leer hoe je individuele Drosophila-eikamers prepareert voor live imaging om mRNA-lokalisatie en dynamische intracellulaire processen te bestuderen. Deze methode combineert snelle dissectie met hoogresolutiebeeldvorming.

Voorbereiden Individuele Drosophila Egg Chambers voor Live Imaging

Meer video's verkennen