Name: In vitro transcriptie en aftopping van Gaussia Luciferase mRNA Gevolgd door HeLa celtransfectie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Leer de synthese en transfectie van capped en uncapped mRNA in HeLa-cellen met Gaussia luciferase als reporter. Deze methode optimaliseert RNA-productie en vergelijkt capping-technieken voor efficiënte eiwitexpressie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dongxian Yue, Brett Robb, George Tzertzinis, Tanya Bhatia, Breton Hornblower.

RNases zijn veelal aanwezig op de huid, in haar, stof, op laboratoriumoppervlakken, in oplossingen, enz. Draag handschoenen en reinig het werkvlak, pipetten enz. grondig voor gebruik om RNase-contaminatie te voorkomen. Het gebruik van nuclease-vrije pipetpunten, buisjes, glaswerk en reagentia wordt sterk aanbevolen.
1. In vitro transcriptie met de T7 High-yield RNA Synthesis Kit
De DNA-template voor de transcriptiereactie is een gelineariseerd plasmide dat het Gaussia luciferase-gen bevat en een T7-promotor stroomopwaarts van de coderende sequentie (Figuur 1B).
<ol>
	<li>Ontdooi de componenten van de T7 High Yield RNA Synthesis kit en houd deze op ijs.</li>
	<li>Voor niet-gecapte RNA wordt de reactie bij kamertemperatuur in de volgende volgorde klaargezet:</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Component</td>
			<td>Volume (μl)</td>
			<td>Definitief</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nucleasevrij water*</td>
			<td>X</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X reactiebuffer</td>
			<td>2</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Template-DNA *</td>
			<td>X</td>
			<td>1 μg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA-polymerasemengsel</td>
			<td>2</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Totaal</td>
			<td>20</td>
			<td> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
*Voeg 1 μg DNA toe en vul het totale reactievolume aan tot 20 μl met nucleasevrij water. De hoeveelheid water die moet worden toegevoegd, varieert afhankelijk van de concentratie van het template-DNA.
<ol start="3">
	<li>Voor gecapte RNA: Stel de reactie op bij kamertemperatuur in de volgende volgorde:</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Component</td>
			<td>Volume (μl)</td>
			<td>Eindconcentratie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleasevrij water*</td>
			<td>X</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Reactiebuffer</td>
			<td>2</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP (20 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>2mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3´-0-Me-m7G(5')ppp(5')G cap analoog (ARCA)(40mM)</td>
			<td>4</td>
			<td>8mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Template DNA*</td>
			<td>X</td>
			<td>1 μg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA Polymerase Mix</td>
			<td>2</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Totaal</td>
			<td>20</td>
			<td> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
*Voeg 1 μg DNA toe en vul het totale reactievolume aan tot 20 μl met nucleasevrij water. De hoeveelheid toe te voegen water varieert afhankelijk van de concentratie van het template-DNA.
<ol start="4">
	<li>Meng goed door te vortexen en incubeer de reacties 2 uur lang bij 37 °C in een droge luchtincubator.</li>
	<li>Synthetiseer met behulp van stappen 1.3-1.4 gecapte transcripten van Cypridina luciferase (CLuc) vanuit een gelineariseerd plasmide dat het CLuc-gen bevat. Dit mRNA zal samen worden getransfecteerd met het gecapte en ongecapte GLuc mRNA voor de normalisatie van de GLuc-expressie.</li>
</ol>
2. Verwijdering van template-DNA
De transcriptiereacties worden behandeld met DNase I om het DNA-sjabloon te verwijderen voordat er wordt overgegaan tot zuivering.
<ol>
	<li>Voeg 70 μl nucleasevrij water toe aan de transcriptiereacties, gevolgd door 10 μl DNase I reactiebuffer.</li>
	<li>Voeg 2 μl DNase I toe aan de reacties.</li>
	<li>Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C in een droge luchtincubator.</li>
</ol>
3. Kolomzuivering van gecapte en ongecapte RNA
<ol>
	<li>Purificeer het gecapte en ongecapte RNA met de MEGAclearKit volgens de instructies van de fabrikant (elk RNA-purificatiekit op basis van spincolumns kan worden gebruikt).</li>
	<li>Kwantificeer het RNA met een NanoDrop Spectrofotometer.</li>
	<li>Beoordeel de kwaliteit van de RNA-monsters met de Agilent RNA 6000 Nano Kit en de Agilent 2100 Bioanalyzer, conform de instructies van de fabrikant.</li>
</ol>
4. RNA-capping met behulp van het Vaccinia-cappingsysteem
<ol>
	<li>Neem 10 μg van het gezuiverde uncapped GLuc mRNA.</li>
</ol>
Een standaard capping-reactie kan tot 10 μg (100nt of groter) RNA cappen. Als een grotere hoeveelheid RNA gecapt moet worden, kan de reactie dienovereenkomstig worden opgeschaald.
<ol start="2">
	<li>Verhoog het volume tot 15 μl met nucleasevrij water.</li>
	<li>Verhit het RNA 10 minuten lang bij 65 °C om secundaire structuren te verwijderen. Plaats het vervolgens 5 minuten op ijs.</li>
	<li>Voor het opzetten van de capping-reactie voegt u 2 μl 10X Capping Buffer, 1 μl GTP (10 mM), 1 μl vers verdunde S-adenosylmethionine (2 mM) en 1 μl (10 units) Vaccinia capping enzyme toe aan de 15 μl gedenatureerd RNA.</li>
	<li>Meng goed door voorzichtig te vortexen en incubeer de reactie 30 minuten bij 37 °C in een droogluchtincubator.</li>
</ol>
5. Kolomzuivering van gecapte RNA
<ol>
	<li>Zuiver het gecapte RNA met de MEGAclear Kit (elke op spin-kolommen gebaseerde RNA-zuiveringskit kan worden gebruikt).</li>
	<li>Beoordeel de kwaliteit van de RNA-monsters met de Agilent RNA 6000 Nano Kit en de Agilent 2100 Bioanalyzer, conform de instructies van de fabrikant.</li>
</ol>
6. Transfectie van HeLa-cellen met behulp van de TransIT mRNA Transfection Kit
<ol>
	<li>Zaai HeLa-cellen uit in een 48-wells plaat in 150 μl Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), High Glucose, aangevuld met 10% foetaal runderserum (0,7-2,3 × 105 cellen/well).</li>
	<li>Incubeer gedurende 16-24 uur bij 37 °C totdat de cellen 60-90% confluent zijn.</li>
	<li>Verdun het GLuc- (met en zonder cap) en CLuc-RNA tot een concentratie van 100 ng/μl.</li>
</ol>
Elke transfectie wordt in 8 replica's uitgevoerd.
<ol start="4">
	<li>Bereid 8 eppendorf buisjes voor. Voeg aan elk buisje 1 μl ongecapte GLuc RNA, 1 μl gecapte CLuc RNA (voor normalisatie) en 25 μl serumvrij DMEM toe. Meng goed.</li>
	<li>Bereid 8 eppendorf buisjes voor. Voeg aan elk buisje 1 μl gecapte GLuc RNA (cap-analoog), 1 μl gecapte CLuc RNA (voor normalisatie) en 25 μl serumvrij DMEM toe. Meng goed.</li>
	<li>Bereid 8 eppendorf buisjes voor. Voeg aan elk buisje 1 μl gecapte GLuc RNA (Vaccinia), 1 μl gecapte CLuc RNA (voor normalisatie) en 25 μl serumvrij DMEM toe. Meng goed.</li>
	<li>Voeg 0,2 μl mRNA Boost Reagent toe aan de eerste set van 8 buisjes en meng.</li>
	<li>Voeg 0,2 μl TransIT mRNA Reagent toe aan de eerste set van 8 buisjes en meng.</li>
	<li>Incubeer gedurende 2-5 minuten bij kamertemperatuur. (Incubeer niet langer dan 5 minuten).</li>
	<li>Voeg het transfectiemengsel druppelsgewijs toe aan de wells met HeLa-celculturen (zie Figuur 3 voor de opstelling van de plaat).</li>
	<li>Herhaal stappen 7 tot en met 10 met de 2e en 3e sets van 8 buisjes.</li>
	<li>Incubeer overnacht (16 uur) bij 37 °C in 5% CO2.</li>
</ol>
7. Gaussia Luciferase (GLuc) Assay
Analyseer het supernatant van elke put op GLuc-activiteit met behulp van de BioLux Gaussia Luciferase Assay Kit als volgt:
<ol>
	<li>Bereid een verse assay-oplossing door 15 μl BioLux GLuc Substrate toe te voegen aan 1,5 ml BioLux GLuc Assay Buffer (er is 50 μl assay-oplossing per monster nodig). Bereid voldoende volume voor de monsters en voor het primen van de injector van de luminometer (raadpleeg de instructies van de fabrikant).</li>
	<li>Meng goed door de buis meerdere keren om te keren (niet vortexen).</li>
</ol>
Luminescentie wordt gemeten met de Centro LB 960 microplate luminometer van Berthold Technologies.
<ol start="3">
	<li>Stel de luminometer in op een injectievolume van 50 μl en een integratietijd van 2-10 seconden.</li>
	<li>Voeg 10 μl van het supernatant van de celcultuur uit elke well toe aan een zwarte 96-well plaat.</li>
	<li>Spoor de injector voor met de assay-oplossing en ga over tot de meting van de luminescentie.</li>
	<li>De waarden verkregen uit niet-getransfecteerde wells zullen als negatieve controles worden gebruikt.</li>
</ol>
8. Cypridina Luciferase (CLuc) Assay
Analyseer het supernatant van elke put op CLuc-activiteit met de BioLux Cypridina Luciferase Assay Kit als volgt:
<ol>
	<li>Bereid vers gereconstitueerd substraat (100x) volgens de instructies in de handleiding van de kit.</li>
	<li>Ontdooi de BioLux Cypridina Luciferase Assay Buffer en meng deze goed (bescherm tegen licht).</li>
	<li>Om de CLuc-assayoplossing te bereiden, voegt u 15 μl van het gereconstitueerde substraat (100x) toe aan 1,5 ml BioLux Cypridina Luciferase Assay Buffer (er is 50 μl assayoplossing per monster nodig). Bereid voldoende voor de monsters en voor het primen van de injector van de luminometer (raadpleeg de instructies van de fabrikant).</li>
	<li>Meng goed door de buis enkele keren om te keren (niet vortexen).</li>
	<li>Bewaar de oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (bescherm tegen licht).</li>
</ol>
Luminescentie wordt gemeten met de Centro LB 960 microplate luminometer van Berthold Technologies.
<ol start="6">
	<li>Stel de luminometer in op een injectievolume van 50 μl, een vertraging van 1-2 seconden en een integratietijd van 2-10 seconden.</li>
	<li>Voeg 10 μl van het supernatant van de celcultuur uit elke put toe aan een zwarte 96-wells plaat.</li>
	<li> Cursoreer de injector met de CLuc-assayoplossing en meet de luminescentie.</li>
	<li>De waarden verkregen uit niet-getransfecteerde putten dienen als negatieve controles.</li>
</ol>
9. Representatieve Resultaten
De T7 High Yield RNA Synthesis Kit kan tot 180 μg ongecapped RNA en 40 tot 50 μg gecapped RNA produceren per reactie van 20 μl. Bij analyse met de Agilent 2100 Bioanalyzer moet RNA van goede kwaliteit en intacte structuur één enkele, scherpe piek vertonen die het RNA-transcript representeert. Een brede piek of meerdere pieken duiden op RNA-degradatie. Het is daarnaast belangrijk om de grootte van het RNA te verifiëren. RNA-transcripten met een grotere lengte dan verwacht kunnen het gevolg zijn van onvolledige digestie van het template plasmide-DNA. RNA-degradatie en een lagere opbrengst zijn gewoonlijk het resultaat van contaminanten die vanuit het template-DNA in de reactie zijn geïntroduceerd. Figuur 2 is een voorbeeld van het electroferogram en het gelbeeld verkregen na het analyseren van hoogwaardig, intact RNA op de Bioanalyzer.
Transfectie van HeLa-cellen met zowel gecapte als ongecapte GLuc-RNA wordt gevolgd door incubatie en het analyseren van de celcultuur-supernatanten op luciferase-activiteit. De 5'-capstructuur is belangrijk voor het beschermen van het RNA tegen exonuclease-degradatie8 en voor het bevorderen van de translatie-initiatie9 van het mRNA. Daarom is RNA-capping een essentiële stap voor transfectie-experimenten. De co-transcriptionele (cap-analoog) methode levert ongeveer 40 μg RNA op waarvan 80% gecapt is. Het protocol met gebruik van Vaccinia-capping-enzym capt tot 10 μg RNA (100 nt of groter) per reactie met een efficiëntie van bijna 100%.
Figuur 4 toont het verschil in luciferase-expressie tussen culturen die zijn getransfecteerd met gecapte en ongecapte RNA-monsters. Er is duidelijk te zien dat celculturen die zijn getransfecteerd met gecapt RNA een veel hogere expressie van luciferase vertonen vergeleken met culturen die zijn getransfecteerd met ongecapt RNA (die geen luciferase-activiteit vertonen). Daarnaast valideert Figuur 4 dat beide capping-technieken, het gebruik van een cap-analoog en het gebruik van het Vaccinia capping-enzym, succesvol functionele, gecapte RNA-transcripten produceren die in eiwit kunnen worden vertaald. De tweezijdige p-waarde verkregen uit de t-test was 0,2583, wat aangeeft dat er geen significant statistisch verschil is tussen de luminescentiegegevens van de twee capping-methoden.
<img alt="T7-transcriptiediagram; DNA-sjabloon, RNA-transcript; nucleotidevolgorde-proces." src="/files/ftp_upload/3702/3702fig1A.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 1.">
Figuur 1A. RNA-synthese door T7 RNA-polymerase
 
<img alt="Plasmidkaart-diagram van pCMV-GLuc, 5764 bp; genexpressie, kloonvectoren, restrictieplaatsen." src="/files/ftp_upload/3702/3702fig1B.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 2."> 
Figuur 1B. pCMV-GLuc vector bevattend het GLuc-gen en de T7-promotor.
 
<img alt="RNA chromatografieresultaten; analyse van ongecapte versus gecapte RNA; elektroforesekaart." src="/files/ftp_upload/3702/3702fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 2."> 
Figuur 2. Bioanalyzer-elektroferogrammen en gel-afbeelding van gecapt en ongecapt RNA. De X-as is de grootte van het RNA in nucleotiden (nt) en de Y-as stelt fluorescentie-eenheden (FU) voor. A) Elektroferogram van GLuc mRNA (ongecapt) na zuivering. B) Elektroferogram van GLuc mRNA (gecapt met behulp van Vaccinia capping-enzym). C) Elektroferogram van GLuc mRNA (co-transcriptioneel gecapt met behulp van een cap-analoog). D) Gel-achtige afbeelding gegenereerd door de Bioanalyzer. De 'L'-baan is de RNA-ladder, baan 1 is ongecapt GLuc mRNA, baan 2 is GLuc mRNA gecapt met behulp van de cap-analoog en baan 3 is het GLuc RNA gecapt met behulp van het Vaccinia capping-enzym.
 
<img alt="Diagram van de plaatindeling voor het genexpressie-experiment; monstertypes: uncapped/capped GLuc &amp; CLuc." src="/files/ftp_upload/3702/3702fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 3."> 
Figuur 3. Voorbeeld van de plaatopstelling voor HeLa-celtransfectie. Elke well bevat uitgeplaatte HeLa-cellen die 60-90% confluent zijn. Het transfectiemengsel, bestaande uit het betreffende GLuc RNA (uncapped, gecapt met cap-analoog of gecapt met Vaccinia capping-enzym), gecapt CLuc RNA (voor normalisatie), mRNA Boost Reagent en TransIT mRNA Reagent, wordt aan elke well toegevoegd. Elke transfectie wordt uitgevoerd in 8 replica's (wells met dezelfde kleur in de figuur).
 
 
<img alt="Staafdiagram van genormaliseerde luminescentie; GLuc RNA met en zonder cap; resultaten van RNA-analyse." src="/files/ftp_upload/3702/3702fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 4."> 
Figuur 4.GLuc-expressie in HeLa-cellen. Gezuiverd capped en uncapped GLuc mRNA werd getransfecteerd in HeLa-cellen en gedurende de nacht (16 uur) geïncubeerd bij 37 °C. De supernatanten van de celcultuur uit elke put werden geanalyseerd op GLuc- en CLuc-activiteit en de luminescentiewaarden werden geregistreerd. De GLuc-luminescentiewaarden werden genormaliseerd ten opzichte van de luminescentiewaarden van capped CLuc RNA.
<img alt="Formule voor GLuc luminescentieverhouding, luminescentiemeting, vergelijking voor genormaliseerde waarden, RLU." src="/files/ftp_upload/3702/3702eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Vergelijking 1">
* Luminescentie van niet-getransfecteerde cellen werd afgetrokken van de GLuc- en CLuc-waarden vóór normalisatie.
 
Handelsmerken
BioLux is een handelsmerk van New England Biolabs, Inc.
TransIT is een geregistreerd handelsmerk van Mirus Bio LLC.
MEGAclear is een handelsmerk van Ambion.

<ol><li>Lazarev, D., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+splicing+and+transcription+are+not+sufficient+to+enhance+splicing+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Concurrent splicing and transcription are not sufficient to enhance splicing efficiency.</a> RNA. 13, 1546-1557 (2007).</li>
<li>Donze, O., Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+in+mammalian+cells+using+siRNAs+synthesized+with+T7%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Polymerase.+Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RNA interference in mammalian cells using siRNAs synthesized with T7.</a> RNA Polymerase. Nucl. Acids Res. 30, 10-46 (2002).</li>
<li>Van Gelder, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nati.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1663-1667 (1990).</li>
<li>Schneider, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+T7+RNA+polymerase+based+in+vitro+linear+RNA+amplification+for+use+in+microarray+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of T7 RNA polymerase based in vitro linear RNA amplification for use in microarray experiments.</a> BMC Genomics. 5, 29-29 (2004).</li>
<li>Conry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+messenger+RNA+polynucleotide+vaccine+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of a messenger RNA polynucleotide vaccine vector.</a> Cancer Research. 55, 1397-1400 (1995).</li>
<li>Huang, F., Wang, G., Coleman, T., Li, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+adenosine+derivatives+as+transcription+initiators+and+preparation+of+5%C3%A2%E2%82%AC%C2%B2+fluorescein-+and+biotin-labeled+RNA+through+one-step+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Synthesis of adenosine derivatives as transcription initiators and preparation of 5â€² fluorescein- and biotin-labeled RNA through one-step transcription.</a> RNA. 9, 1562-1570 (2003).</li>
<li>Warren, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+reprogramming+to+pluripotency+and+directed+differentiation+of+human+cells+with+synthetic+modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).</li>
<li>Furuichi, Y., LaFiandra, A., Shatkin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5%27-Terminal+structure+and+mRNA+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">5'-Terminal structure and mRNA stability.</a> Nature. 266, 235-239 (1977).</li>
<li>Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap+and+cap+binding+proteins+in+the+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cap and cap binding proteins in the control of gene expression.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. 2, 277-298 (2011).</li>
<li>Lewis, J. D., Izaurflde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+the+Cap+Structure+in+RNA+Processing+and+Nuclear+Export%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The Role of the Cap Structure in RNA Processing and Nuclear Export.</a> Eur. J. Biochem. 247, 461-469 (1997).</li>
<li>Inoue, K., Ohno, M., Sakamoto, H., Shimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+cap+structure+on+pre-mRNA+splicing+in+Xenopus+oocyte+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Effect of the cap structure on pre-mRNA splicing in Xenopus oocyte nuclei.</a> Genes Dev. 3, 1472-1479 (1989).</li>
<li>Martin, S. A., Paoletti, E., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+mRNA+guanylyltransferase+and+mRNA+%28guanine+7-%29methyltransferase+from+vaccinia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification of mRNA guanylyltransferase and mRNA (guanine 7-)methyltransferase from vaccinia virus.</a> J. Biol. Chem. 250, 9322-9329 (1975).</li>
<li>Martin, S. A., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+RNA+by+mRNA+guanylytransferase+and+mRNA+%28guanine-7-%29methyl-transferase+from+vaccinia+virions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Modification of RNA by mRNA guanylytransferase and mRNA (guanine-7-)methyl-transferase from vaccinia virions.</a> J. Biol. Chem. 250, 9330-9335 (1975).</li>
<li>Shuman, S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+use+of+vaccinia+virus+mRNA+capping+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Purification and use of vaccinia virus mRNA capping enzyme.</a> Meth. Enzymol. 181, 170-180 (1990).</li>
<li>Thiel, V., Herold, J., Scelle, B., Siddell, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+RNA+transcribed+in+vitro+from+a+cDNA+copy+of+the+human+coronavirus+genome+cloned+in+vaccinia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Infectious RNA transcribed in vitro from a cDNA copy of the human coronavirus genome cloned in vaccinia virus.</a> J. Gen. Virol. 82, 1273-1281 (2001).</li>
<li>Marcotrigiano, J., Gingras, A. -C., Sonenberg, N., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocrystal+Structure+of+the+Messenger+RNA+5%C3%A2%E2%82%AC%C2%B2+Cap-Binding+Protein+%28eIF4E%29+Bound+to+7-methyl-GDP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cocrystal Structure of the Messenger RNA 5â€² Cap-Binding Protein (eIF4E) Bound to 7-methyl-GDP.</a> Cell. 89, 951-961 (1997).</li>
<li>Stepinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+properties+of+mRNAs+containing+the+novel+%22anti-reverse%22+cap+analogs+7-methyl+%283%27-O-methyl%29GpppG+and+7-methyl+%283%27-deoxy%29+GpppG%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Synthesis and properties of mRNAs containing the novel "anti-reverse" cap analogs 7-methyl (3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl (3'-deoxy) GpppG.</a> RNA. 7, 1486-1495 (2001).</li>
<li>Kuge, H., Brownlee, G. G., Gershon, P. D., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap+ribose+methylation+of+c-mos+mRNA+stimulates+translation+and+oocyte+maturation+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Cap ribose methylation of c-mos mRNA stimulates translation and oocyte maturation in Xenopus laevis.</a> Nucl. Acids Res. 26, 3208-3214 (1998).</li>
<li>Schagat, T., Paguio, A., Kopish, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalizing+Genetic+Reporter+Assays%3A+Approaches+and+Considerations+for+Increasing+Consistency+and+Statistical+Significance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Notes%22%5BJournal%5D)">Normalizing Genetic Reporter Assays: Approaches and Considerations for Increasing Consistency and Statistical Significance.</a> Cell Notes. 17, 9-12 (2007).</li>
<li>Barbosa, E., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+%28nucleoside-2%27-%29+-+methyltransferase+from+Vaccinia+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">mRNA (nucleoside-2'-) - methyltransferase from Vaccinia Virus.</a> J. Biol. Chem. 253, 7698-7702 (1978).</li>
<li>Lockless, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+capped+RNA+substrates+by+VP39%2C+the+vaccinia+virus-encoded+mRNA+cap-specific+2%27-O-methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Recognition of capped RNA substrates by VP39, the vaccinia virus-encoded mRNA cap-specific 2'-O-methyltransferase.</a> Biochemistry. 37, 8564-8574 (1998).</li>
</ol>

Alle auteurs zijn werknemers van New England Biolabs, Inc.

In vitro transcriptie is een nuttige methode om hoge opbrengsten RNA te verkrijgen voor diverse toepassingen. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van de T7 High Yield RNA Synthesis Kit is dat de formulering is geoptimaliseerd om hoge RNA-opbrengsten te behalen. Bovendien zijn de in de kit meegeleverde reagentia vrij van contaminerende nucleasen, wat resulteert in de synthese van intacte RNA-transcripten van hoge kwaliteit. De kit is ontworpen voor een hoge stabiliteit en flexibiliteit, zodat deze kan worden gebruikt voor de synthese van mRNA, kleurstofgelabeld RNA, radiogelabelde probes met een hoge specifieke activiteit en gecapte RNA. De handleiding van de kit bevat een lijst met specifieke protocollen en aanvullende materialen die nodig zijn voor elk van deze toepassingen. Ook bevat deze technische informatie over het gebruik van PCR-producten en synthetische DNA-oligonucleotiden als templates voor transcriptie. Het is belangrijk op te merken dat de transcriptiekit uitsluitend DNA-templates kan gebruiken die een T7-promotor bevatten.
De in dit artikel beschreven methode demonstreert post-transcriptionele RNA-capping met gebruik van het Vaccinia-cappingenzym, evenals co-transcriptionele capping met behulp van een RNA-capstructuur-analoog. We hebben aangetoond dat beide methoden gecapte RNA synthetiseren dat functioneel actief is na transfectie. De 5'-capstructuur verbetert de stabiliteit van het RNA en de translatie-efficiëntie, en is daarom belangrijk voor micro-injectie11 en transfectie7 experimenten. De co-transcriptionele capping-methode genereert 40-50 μg aan ~80% gecapt RNA. Het is belangrijk op te merken dat het gebruik van 3'-0-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA-cap-analoog (ARCA), dat geblokkeerd is bij de 3'-hydroxyl van de m7G, zorgt voor incorporatie van de cap in de juiste oriëntatie17. Om grotere hoeveelheden RNA te capten, is het mogelijk om de standaardreacties voor beide capping-methoden op te schalen. Het gebruik van het Vaccinia Capping System zou echter een haalbaardere optie zijn wat betreft de kosten, aangezien co-transcriptionele capping gebruikmaakt van een cap-analoog, wat een relatief duur component is. Het Vaccinia Capping System is bovendien een betere methode, aangezien het een capping-efficiëntie van bijna 100% heeft.
De hierboven beschreven RNA-cappingmethoden synthetiseren RNA met een cap 0-structuur aan het 5'-uiteinde. De cap 1-structuur omvat aanvullende methylering op de 2'-O-positie van de ribosesuiker van het eerste nucleotide aan het 5'-uiteinde van het RNA. Er is gerapporteerd dat de cap 1-structuur de translatie-efficiëntie van RNA verhoogt18 en deze kan worden ingebouwd door gebruik te maken van 2'-O-methyltransferase20, 21.
De in dit artikel beschreven methode kan worden gebruikt voor de transcriptie, capping en transfectie van elk gewenst mRNA. De luciferases GLuc en CLuc werden specifiek in dit protocol gebruikt vanwege hun vele voordelen. Ze worden direct uitgescheiden in het celmedium, waardoor cellyse niet nodig is. Daarnaast genereren ze een hoge bioluminescente signaalintensiteit, en de activiteitsassays zijn zeer gevoelig en eenvoudig uit te voeren. Het is belangrijk om op te merken dat de GLuc-expressie in de cellen beïnvloed kan worden door diverse factoren naast de functionaliteit van het RNA zelf. Enkele voorbeelden hiervan zijn pipetteerfouten, variërende celaantallen per well, transfectie-efficiëntie, enz. Datanormalisatie wordt gebruikt om rekening te houden met deze factoren. In ons protocol co-transfecteren we CLuc-RNA als interne controle samen met het GLuc-RNA. Wanneer de GLuc-luminescentie wordt gedeeld door de CLuc-controlewaarden, wordt deze genormaliseerd voor de fouten en variabiliteit in de transfectie19.

<table><tbody><tr><td>T7 High Yield RNA Synthese Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2040S</td><td></td></tr><tr><td>3&amp;rsquo;-0-Me-m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;G(5&amp;rsquo;)ppp(5&amp;rsquo;)G RNA-capstructuur-analoog</td><td>New England Biolabs</td><td>S1411S</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (RNase-vrij)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>Vaccinia Capping System</td><td>New England Biolabs</td><td>M2080S</td><td></td></tr><tr><td>MEGAclear Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Spectrofotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Trans&lt;/em&gt;IT mRNA Transfectiekit</td><td>Mirus Bio LLC</td><td>MIR2250</td><td></td></tr><tr><td>HyClone* Klassiek vloeibaar medium: Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium, High Glucose</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30285.01</td><td></td></tr><tr><td>HyClone niet-essentiële aminozuren</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>Centro LB 960</td><td>Berthold Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLux&lt;em&gt; Gaussia&lt;/em&gt; Luciferase Assay Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E3300S</td><td></td></tr><tr><td>BioLux &lt;em&gt;Cypridina&lt;/em&gt; Luciferase Assay Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E3309S</td><td></td></tr><tr><td>RNase-remmer, muis</td><td>New England Biolabs</td><td>M0314</td><td></td></tr><tr><td>RNase-remmer, menselijke placenta</td><td>New England Biolabs</td><td>M0307</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-GLuc Controleplasmid</td><td>New England Biolabs</td><td>N8081</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro transcriptie en aftopping van gaussia luciferase mrna gevolgd door hela celtransfectie

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcriptie is de synthese van RNA-transcripten door RNA-polymerase vanuit een lineair DNA-sjabloon dat de overeenkomstige promotersequentie (T7, T3, SP6) en het te transcriberen gen bevat (Figuur 1A). Een typische transcriptiereactie bestaat uit het sjabloon-DNA, RNA-polymerase, ribonucleotide-trifosfaten, RNase-remmer en buffer die Mg2+ ionen bevat.
Voor diverse toepassingen zijn vaak grote hoeveelheden hoogwaardig RNA vereist. Het gebruik van in vitro transcriptie is gerapporteerd voor studies naar RNA-structuur en -functie, zoals splicing1, RNAi-experimenten in zoogdiercellen2, antisense RNA-amplificatie via de "Eberwine-methode"3, microarray-analyse4 en voor studies naar RNA-vaccins5. De techniek kan ook worden gebruikt voor het produceren van radiogemarkeerde en met kleurstoffen gemarkeerde probes6. Warren, et al. rapporteerden onlangs de herprogrammering van menselijke cellen door transfectie met in vitro getranscribeerd capped RNA7. De T7 High Yield RNA Synthesis Kit van New England Biolabs is ontworpen om tot 180 μg RNA per 20 μl reactie te synthetiseren. RNA met een lengte tot 10kb is succesvol getranscribeerd met behulp van deze kit. Gelineariseerd plasmid-DNA, PCR-producten en synthetische DNA-oligonucleotiden kunnen als templates voor transcriptie worden gebruikt, mits zij de T7-promotersequentie stroomopwaarts van het te transcriberen gen bevatten.
De toevoeging van een 5'-capstructuur aan het RNA is een belangrijk proces in eukaryoten. Het is essentieel voor de RNA-stabiliteit8, efficiënte translatie9, nucleair transport10 en splicing11. Het proces omvat de toevoeging van een 7-methylguanosinecap aan het 5'-trifosfaatuiteinde van het RNA. RNA-capping kan post-transcriptioneel worden uitgevoerd met behulp van capping-enzymen of co-transcriptioneel met behulp van cap-analogen. Bij de enzymatische methode wordt het mRNA gecapt met behulp van het capping-enzym van het Vaccinia-virus12,13. Het enzym voegt een 7-methylguanosinecap toe aan het 5'-uiteinde van het RNA met GTP en S-adenosylmethionine als donoren (cap 0-structuur). Beide methoden leveren functioneel actief gecapt RNA op dat geschikt is voor transfectie of andere toepassingen14, zoals het genereren van viraal genomisch RNA voor reverse-genetic-systemen15 en kristallografische studies van cap-bindende eiwitten zoals eIF4E16.
In de hieronder beschreven methode wordt de T7 High Yield RNA Synthesis Kit van NEB gebruikt om gecapte en ongecapte RNA-transcripten van Gaussia luciferase (GLuc) en Cypridina luciferase (CLuc) te synthetiseren. Een deel van het ongecapte GLuc-RNA wordt gecapt met behulp van het Vaccinia Capping System (NEB). Een gelineariseerd plasmide dat het GLuc- of CLuc-gen en de T7-promotor bevat, dient als template-DNA. Het getranscribeerde RNA wordt getransfecteerd in HeLa-cellen en de supernatanten van de celculturen worden geanalyseerd op luciferase-activiteit. Gecapt CLuc-RNA wordt gebruikt als interne controle om de GLuc-expressie te normaliseren.

Deze methode beschrijft de hoge opbrengst in vitro synthese van zowel gecapte als ongecapte mRNA vanuit een gelineariseerd plasmide dat het Gaussia luciferase (GLuc) gen bevat. Het RNA wordt gezuiverd en een fractie van het ongecapte RNA wordt enzymatisch gecapt met behulp van het capping-enzym van het Vaccinia virus. In de laatste stap wordt het mRNA getransfecteerd in HeLa-cellen en worden de supernatanten van de celcultuur geanalyseerd op luciferase-activiteit.

In vitro transcriptie en aftopping van Gaussia Luciferase mRNA Gevolgd door HeLa celtransfectie

In vitro transcriptie is de synthese van RNA-transcripten door RNA-polymerase vanuit een lineair DNA-sjabloon dat de overeenkomstige promotersequentie bevat ...

Het algemene doel van deze procedure is om HeLa-cellen te transfecteren met gecapte en ongecapte mRNA-transcripten van Gaïa-luciferase en de celkweek te analyseren op luciferase-activiteit. Dit wordt bereikt door eerst de T seven high yield RNA synthesis kit te gebruiken om via in vitro transcriptie zowel ongecapte als gecapte mRNA-transcripten van Gaïa-luciferase te synthetiseren. Twee methoden voor het cappen van het mRNA worden gedemonstreerd.In de ene methode wordt een cap-analoog tijdens de transcriptie gebruikt, terwijl in de andere de vaccinia-capping-enzym wordt ingezet voor post-transcriptionele capping. De volgende stap is het transfecteren van de gecapte en ongecapte mRNA-transcripten in HeLa-cellen. Uiteindelijk wordt de luciferase-activiteit als gevolg van ongecapt of gecapt mRNA vergeleken in het supernatant van de HeLa-celcultuur.Het belangrijkste voordeel van deze methode ten opzichte van het zelf opzetten van een transcriptiereactie is dat de T seven high yield RNA synthesis kit is getest en geoptimaliseerd om een hoge opbrengst en, nog belangrijker, kwalitatief hoogwaardige, volledige RNA-transcripten te produceren. Dit is uiterst belangrijk voor een succesvolle RNA-translatie en expressie van functioneel actieve eiwitten. Deze methode biedt dus inzicht in RNA-transfectie; in vitro getranscribeerde RNA's kunnen daarnaast worden gebruikt voor andere toepassingen, zoals micro-injectie, microarray-analyse, hybridisatie-gebaseerde blots en studies naar RNA-structuur en -functie.Het DNA-sjabloon voor deze voorbeeldreactie is een gelineariseerd plasmide dat het Gaussian luciferase- of gluc-gen bevat. Met een T7-promotor zullen zowel gecapte als ongecapte producten worden gesynthetiseerd. Begin met het ontdooien van de componenten van de T7 high yield RNA synthesis kit en bewaar deze op ijs.Slijt handschoenen en maak het werkvlak, de pipetten en andere materialen grondig schoon om RNA-contaminatie te voorkomen. Het gebruik van nucleasevrije pipetpunten, buisjes en glaswerk wordt sterk aanbevolen voor de synthese van uncapped RNA. Stel de reactie op bij kamertemperatuur, beginnend met de 10 x buffer en water, gevolgd door de nucleotiden, het DNA-template en tot slot de polymerase-mix.De volgorde van toevoeging van reagentia is belangrijk voor de synthese van gecapte RNA. Maak met behulp van een cap-analoog een vergelijkbaar reactiemengsel, maar voeg de cap-analoognucleotiden toe. Nadat de standaardnucleotiden zijn toegevoegd, worden de reactiecomponenten gemengd door voorzichtig te vortexen, gevolgd door een korte centrifugatie (pulse spin). Incubeer de reacties vervolgens gedurende twee uur bij 37 °C in een droge luchtincubator. Richt als interne controle een tweede reactie in om cap-transcripten van c Luke te synthetiseren vanuit een gelineariseerd plasmide; de expressie van C Luke wordt gebruikt om de gluc-expressie te normaliseren.Verwijder na de incubatie de DNA-template uit elk reactiemengsel. Voeg 70 µL nucleasevrij water toe, gevolgd door 10 µL DNase I reactiebuffer en vervolgens twee µL DNase I. Laat het DNA 15 minuten reageren bij 37 °C in een droge luchtincubator.Zuiver nu de reacties met een willekeurige spin-kolomgebaseerde RNA-zuiveringskit en kwantificeer het RNA met een NanoDrop TM-spectrofotometer. Beoordeel tot slot de kwaliteit van de RNA's met de Agilent RNA 6, 000 nano Kit en de Agilent 2100 bioanalyzer. Breng voor een standaard capping-reactie 10 micrograms van het gezuiverde uncapped gluc mRNA aan in 15 microliters nuclease-vrij water.Dit kan naar behoefte worden opgeschaald. Verhit het RNA gedurende 10 minuten bij 65 °C om de secundaire structuren te verbreken en plaats het vervolgens vijf minuten op ijs. Voeg voor het opzetten van de capping-reactie capping-buffer, GTP (vers verdund), S-adenosylmethionine en vaccinia capping-enzym toe aan het gedenatureerde RNA. Vortex de reactiecomponenten voorzichtig, centrifugeer kort (pulse spin) en incubeer de reactie 30 minuten bij 37 °C in een droge luchtincubator.Na de incubatie dient het RNA te worden gezuiverd en geanalyseerd, zoals beschreven aan het einde van de vorige sectie. Begin met het uitplaten van HeLa-cellen. In 28 wells van een 48-wells plaat moet elke well 70 tot 230.000 cellen en 150 µL high glucose DMEM bevatten, aangevuld met 10% serum.Incubeer de plaat bij 37 °C tot de cellen 60 tot 90% confluent zijn, wat ongeveer 16 tot 24 uur zou moeten duren. Wanneer de cellen gereed zijn, bereid dan de transfectiemengsels. Verdun het RNA tot een concentratie van 100 ng/µL.Bereid vervolgens 24 microcentrifugebuisjes voor voor drie verschillende reacties. Elke reactie wordt acht keer gedupliceerd over acht buisjes. Voeg één microliter ongecapte gluc RNA toe, één microliter gecapte c luke RNA voor normalisatie en 25 microliters serumvrij medium.Meng DMEM altijd goed met een pipetteur in de volgende acht buisjes. Stel dezelfde reactie op, maar voeg in de laatste acht buisjes capped gluc RNA toe, bereid met een cap-analoog, in plaats van het uncapped gluc RNA. Voeg nu in de eerste set van acht buisjes met uncapped gluc RNA capped gluc RNA uit de vaccinia-reactie toe in plaats van het met cap-analoog bereide gluc RNA; meng hierbij 0,2 µL mRNA boost-reagens, gevolgd door het mengen van 0,2 µL.Het Transit mRNA-reagens maakt het mogelijk dat de reacties bij kamertemperatuur gedurende maximaal vijf minuten verlopen. Twee minuten na aanvang van de reactie wordt elk mengsel druppelsgewijs overgebracht naar een putje met gecultiveerde cellen. Herhaal deze stap met de volgende twee sets buisjes die cap, analoge cap gluc, RNA en gecapte gluc RNA uit de vaccinia-reactie bevatten.Laat vier putjes als negatieve controles, incubeer de cellen overnacht bij 37 °C in 5% koolstofdioxide. De bovengenoemde analyse werd uitgevoerd met behulp van de Biox GIA Luciferase assaykit voor de Gluc-assay. Bereid een verse assayoplossing door 15 µL biox gluc substraat toe te voegen aan 1,5 mL biox gluc assaybuffer.Vortex het uiteindelijke mengsel niet. Meng het door de buis om te keren voor de CLU-assay. Bereid 100 x vers gereconstitueerd substraat.Maak vervolgens de assay-oplossing door 15 µL van het gereconstitueerde substraat toe te voegen aan 1,5 mL Blu Ciena luciferase assay-buffer. Meng de C Luke assay-oplossing zonder te vortexen en incubeer deze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en in het donker. De assay-oplossingen zijn nu klaargemaakt.Meet de luminescentie van de cellen met een microplaat-luminometer. Stel de luminometer zo in dat er 50 µL assay-oplossing gedurende twee tot 10 seconden wordt geïnjecteerd. Draag vervolgens 10 µL van elk celluultuursupernatant over naar een well van een zwarte 96-wellsplaat. Cursoreer de injector met de assay-oplossing en ga over tot het meten van de luminescentie. De T seven high yield RNA synthesis kit kan tot 180 micrograms ongecapped RNA en 40 tot 50 micrograms gecapped RNA produceren per 20 microliter reactie wanneer geanalyseerd op de Agilent 2100 bioanalyzer. Goede kwaliteit intact.RNA moet een enkele scherpe piek vertonen die het RNA-transcript representeert. Een brede piek of meerdere pieken duiden op RNA-degradatie. Het is ook belangrijk om de grootte van het RNA te verifiëren.Transcripten die langer zijn dan verwacht kunnen worden veroorzaakt door een onvolledige digestie van het template-plasmide; D-N-A-R-N-A degradatie en een lagere opbrengst zijn gewoonlijk het gevolg van contaminanten in de reactie die afkomstig zijn van het template. Na de DNA-transfectie volgden incubatie en een assay voor luciferase-activiteit. De 5'-capstructuur is belangrijk voor het beschermen van het RNA tegen exonuclease-degradatie en voor het bevorderen van de translatie-initiatie.Daarom is RNA-capping een essentiële stap voor transfectie-experimenten. Het verschil in gemeten luminescentie tussen celculturen die getransfecteerd zijn met gecapte en ongecapte transcripten ondersteunt dit duidelijk, en laat bovendien zien dat beide capping-technieken — met gebruik van een cap-analoog en met gebruik van het vaccinia-cappingenzym — succesvol functionele gecapte RNA-transcripten produceren. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u hoogwaardige gecapte RNA-transcripten synthetiseert voor gebruik bij transfectie en diverse andere toepassingen.

in-vitro-transcription-capping-gaussia-luciferase-mrna-followed-hela

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Met de groeiende belangstelling voor stamceltherapieën, moleculaire imaging technieken zijn ideaal voor de bewaking stamceltransplantatie gedrag na transplantatie. Luciferase reporter genen hebben ingeschakeld non-invasieve, repetitieve evaluatie van de overleving van de cel, de locatie en de proliferatie in vivo. Deze video zal laten zien hoe je hESC proliferatie track in een levende muis.

In vitro en in vivo bioluminescente reportergen-beeldvorming van menselijke embryonale stamcellen

Hierin beschrijven we de methoden om te bouwen, visualiseren en kwantificeren van de bioluminescente reacties van zowel vuurvlieg en Renilla luciferase enzymen uitgedrukt in gemetastaseerde borstkanker cellen tijdens hun groei en...

In vivo Dual ondergrond Bioluminescent Imaging

Circadiane klokken functioneren binnen de individuele cellen, dat wil zeggen, ze zijn cel-autonoom. We beschrijven werkwijzen voor het genereren van cel-autonome klok modellen niet-invasieve, luciferase-gebaseerde real-time bioluminescentie technologie. Reporter cellen handelbaar, functionele modelsystemen voor het bestuderen van circadiane biologie.

Monitoring Cell-autonome circadiane klok Rhythms of genexpressie met behulp van Luciferase Bioluminescentie Reporters

Het bereiken van een systeemniveau begrip van cellulaire processen is een doel van de hedendaagse celbiologie. We beschrijven hier strategieën voor multiplexing luciferase reporters van verschillende cellulaire functie eindpunten naar gen-functie met behulp van genoom-schaal RNAi bibliotheken ondervragen.

Een Multiplexed Luciferase-gebaseerde screening Platform voor ondervragen Kanker-geassocieerde signaaltransductie in gekweekte cellen

In deze video artikel beschrijven we de in vitro synthese van gemodificeerde mRNA voor inductie van eiwitexpressie in cellen.

In vitro Synthese van gemodificeerde mRNA voor inductie van eiwitexpressie in menselijke cellen

Expressie van malaria eiwitten in cellen gebaseerde systemen blijft uitdagend. We tonen twee stappen en een stap IVT (in vitro translatie) celvrije expressiesystemen voor het uitdrukken van malaria rhoptry recombinante eiwitten uit HeLa-cellen. We maken gebruik van een Ni-gebaseerde hars affiniteit zuiveringssysteem de rhoptry eiwitten te zuiveren.

HeLa basis Cell vrije expressie systemen voor expressie van<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Eiwitten

GL261-glioomcellen bieden een bruikbaar immunocompetent diermodel van glioblastoom. De doelen van dit protocol zijn om de juiste technieken te demonstreren voor het monitoren van intracraniële tumorgroei met behulp van in vivo bioluminescentie-beeldvorming, en om de bruikbaarheid van luciferase-gemodificeerde GL261-cellen te verifiëren voor het bestuderen van tumorimmunologie en immunotherapeutische benaderingen voor de behandeling van glioblastoom.

Bioluminescentie beeldvorming van een Immunocompetente diermodel voor Glioblastoma

In dit werk bieden we een experimentele workflow van hoe actieve enhancers kunnen worden geïdentificeerd en experimenteel gevalideerd.

Voorspelling en Validatie van Gene Regulatory Elements geactiveerd tijdens retinoïnezuur Induced embryonale stamcellen Differentiatie

Dit protocol beschrijft een methode om stabiele integratie van een gen van belang in het menselijk genoom door het transcriptionally gereglementeerde Sleeping Beauty -systeem. Voorbereiding van de integratie van defecte lentivirale vectoren, de in vitro -transductie van menselijke cellen en de moleculaire test op getransduceerde cellen worden gemeld.

Een efficiënte In Vitro omzetting methode door een Transcriptionally gereglementeerde Sleeping Beauty systeem verpakt in een defecte lentivirale Vector integratie

Hier presenteren we een protocol om eIF4E-eIF4G-interactie in levende cellen te meten waarmee de gebruiker door geneesmiddelen veroorzaakte verstoring van de complexe dynamiek van eIF4F in screeningsformaten kan evalueren.

Monitoring van eIF4F-assemblage door eIF4E-eIF4G-interactie in levende cellen te meten

Hier geven we details over hoe lysaten bereid kunnen worden en in vitro-vertaling worden uitgevoerd met behulp van Drosophila-embryo's .

Celvrije in vitro mRNA-translatie in Drosophila-lysaten

Leer de synthese en transfectie van capped en uncapped mRNA in HeLa-cellen met Gaussia luciferase als reporter. Deze methode optimaliseert RNA-productie en vergelijkt capping-technieken voor efficiënte eiwitexpressie.

In vitro transcriptie en aftopping van Gaussia Luciferase mRNA Gevolgd door HeLa celtransfectie

Meer video's verkennen