Name: Hybridisatie In situ Van de speekselklieren, eierstokken, en embryos van Vector Muggen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Leer hybride in situ-hybridisatie voor genexpressie-analyse in speekselklieren, eierstokken en embryo's van vector muggen. Deze methode visualiseert transcriptlokalisatie voor functionele genomics-onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen graag Marika Walters bedanken voor advies bij de ontwikkeling van hybridisatie in situ methoden voor zachte weefsels en Yury Goltsev voor de bespreking van protocollen voor in situ hybridisatie van de Anopheles gambiae embryo&#39;s, die vervolgens werden aangepast en gewijzigd om het protocol beschreven hier voor de hybridisatie in de ontwikkeling van ter plaatse van Aedes en Culex embryo&#39;s. We erkennen ook nuttig zijn aanbevelingen gegeven door Adam Pare en David Kosman. Wij danken Osvaldo Marinotti voor de wetenschappelijke discussie en het bewerken van de protocol tekst.

<ol><li>Juhn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+mapping+of+gene+expression+in+the+salivary+glands+of+the+dengue+vector+mosquito%2C+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit.+Vectors%22%5BJournal%5D)">Spatial mapping of gene expression in the salivary glands of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti.</a> Parasit. Vectors. 4, 1(2011).</li>
<li>Coleman, J., Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+midgut+and+salivary+glands+from+Ae.+aegypti+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of midgut and salivary glands from Ae. aegypti mosquitoes.</a> J. Vis. Exp. (5), e228(2007).</li>
<li>Benedict, M. Q. Dissecting Plasmodium-infected Mosquitoes: Salivary Glands, Chapter. 5.4.2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBenedict%2C+MQ+%22Methods+in+Anopheles+Research%22">Methods in Anopheles Research</a>. , Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). (2007).</li>
<li>Sappington, T. W., Brown, M. R., Raikhel, A. S. Culture and analysis of insect ovaries, Chapter. 42.3. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSappington%2C+TW+%22The+Molecular+Biology+of+Insect+Disease+Vectors%3A+A+methods+manual%22">The Molecular Biology of Insect Disease Vectors: A methods manual</a>. , Chapman & Hall. London. (1997).</li>
<li>Goltsev, Y., Hsiong, W., Lanzaro, G., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+combinations+of+gap+repressors+for+common+stripes+in+Anopheles+and+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Different combinations of gap repressors for common stripes in Anopheles and Drosophila embryos.</a> Dev. Biol. 275, 435-446 (2004).</li>
<li>Benedict, M. Q. Anopheles Embryo Fixation, Chapter. 3.7. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBenedict%2C+MQ+%22Methods+in+Anopheles+Research.+Malaria+Research+and+Reference+Reagent+Resource+Center+%28MR4%29%22">Methods in Anopheles Research. Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4)</a>. , (2007).</li>
<li>Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((oskar+gene+expression+in+the+vector+mosquitoes%2C+Anopheles+gambiae+and+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">oskar gene expression in the vector mosquitoes, Anopheles gambiae and Aedes aegypti.</a> Insect Mol. Biol. 15, 363-372 (2006).</li>
<li>Juhn, J., Marinotti, O., Calvo, E., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+structure+and+expression+of+nanos+%28nos%29+and+oskar+%28osk%29+orthologues+of+the+vector+mosquito%2C+Culex+quinquefasciatus%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene structure and expression of nanos (nos) and oskar (osk) orthologues of the vector mosquito, Culex quinquefasciatus.</a> Insect Mol. Biol. 17, 545-552 (2008).</li>
<li>Raminani, L. N., Cupp, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Embryology+of+Aedes+aegypti+%28L.%29+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Insect+Morphol.+%26+Embryol%22%5BJournal%5D)">Early Embryology of Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae).</a> Int. J. Insect Morphol. & Embryol. 4, 517-528 (1975).</li>
<li>Raminani, L. N., Cupp, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryology+of+Aedes+aegypti+%28L.%29+%28Diptera%3A+Culicidae%29%3A+Organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Insect+morphol.+%26+Embryol%22%5BJournal%5D)">Embryology of Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae): Organogenesis.</a> Int. J. Insect morphol. & Embryol. 7, 273-296 (1978).</li>
<li>Ivanova-Kazas, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+development+of+Anopheles+maculipennis+Mg%5BTitle%5D)+AND+%22Izv.+Akad.+Nauk+SSSR+ser.+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic development of Anopheles maculipennis Mg.</a> Izv. Akad. Nauk SSSR ser. Biol. 2, 140-170 (1949).</li>
<li>Goltsev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+evolutionary+basis+for+drought+tolerance+of+the+Anopheles+gambiae+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental and evolutionary basis for drought tolerance of the Anopheles gambiae embryo.</a> Dev. Biol. 330, 462-470 (2009).</li>
<li>Papatsenko, D., Levine, M., Goltsev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clusters+of+temporal+discordances+reveal+distinct+embryonic+patterning+mechanisms+in+Drosophila+and+Anopheles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Clusters of temporal discordances reveal distinct embryonic patterning mechanisms in Drosophila and Anopheles.</a> PLoS Biol. 9, e1000584(2011).</li>
<li>Davis, C. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+larval+embryogenesis+in+the+mosquito+Culex+fatigans+Wiedemann+%28Diptera%3A+Culicidae%29+and+the+sheep-fly+Lucilla+seriata+Meigen+%28Diptera%3A+Calliphoridae%29+I.+Description+of+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Aust.+J.+Zool%22%5BJournal%5D)">A comparative study of larval embryogenesis in the mosquito Culex fatigans Wiedemann (Diptera: Culicidae) and the sheep-fly Lucilla seriata Meigen (Diptera: Calliphoridae) I. Description of embryonic development.</a> Aust. J. Zool. 15, 547-579 (1967).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen toelichtingen.

De in situ hybridisatie en colorimetrische kleuringsprotocol presenteerde hier voor de hele-mount muggen weefsels en embryo&#39;s is een nuttige techniek voor de lokalisatie van transcripties in specifieke organen en celtypes. Deze procedures zijn een verbetering ten opzichte van onze eerder gemeld methoden, zowel in het stroomlijnen van uitgebreide wasstappen en het verstrekken van aanvullende technische details en reagens bronnen. Onze ervaring is dat colorimetrische detectie van hybridisatie signalen is superieur in gevoeligheid en de helderheid van hybridisatie-signaal in vergelijking met fluorescentie detectie op basis van regelingen. Bovendien colorimetrische detectie omzeilt kwesties in verband met het signaal discriminatie in embryo&#39;s, die inherent auto-TL. Beperkingen in het opsporen van hybridisatie signalen zich voordoen als een lage-overvloed transcripties zijn gericht en achtergrondkleuring is evident. Het verhogen van de hybridisatietemperatuur van 65 ° C is gebleken verminderen teruggrond hybridisatiesignalen, maar niet voorgesteld vervanging voor het ontwerpen unieke doelwitspecifieke RNA probes. Dit protocol is gebruikt om uit te voeren in situ hybridisatie van hele-mount speekselklieren van Aedes aegypti, en eierstokken en embryo&#39;s van Anopheles gambiae, Anopheles stephensi, Ae. aegypti en Culex quinquefasciatus. Deze methode is ook toepasbaar op andere mug weefsels en vermoedelijk van andere insecten. Daarnaast hebben we samengesteld voor het eerst vergelijkende richtlijnen voor de enscenering van de embryonale ontwikkeling in drie vector muggen, Ae. aegypti, An. gambiae en Cx. fatigans. Zij zijn beschreven voor specifieke stammen van deze drie soorten onder discreet kweekomstandigheden. Het is belangrijk op te merken dat de ontwikkeling tijdsverloop kan variëren voor verschillende stammen van muggensoorten en onder verschillende kweekomstandigheden. Hybridisaties in situ supplement aan de gang zijnde inspanningen om anaLyze de transcriptomen van muggen en andere geleedpotigen, en kan een beter beeld van de regulatie van genexpressie in deze organismen te bieden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> Ambion </td><td> AM9261 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl </td><td> Ambion </td><td> AM9855G </td><td> pH 8,0 </td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> Ambion </td><td> AM9625 </td><td></td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> Ambion </td><td> AM9763 </td><td></td></tr><tr><td> 1,5 ml microfugebuisje buizen </td><td> Ambion </td><td> AM12400 </td><td> Minder ondoorzichtige dan de standaard buizen, helpt bij het visualiseren van monsters </td></tr><tr><td> Gedeïoniseerd formamide </td><td> Ambion </td><td> AM9342 </td><td> Opslag bij 4 ° C </td></tr><tr><td> DEPC water </td><td> Ambion </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Ambion </td><td> AM2546 </td><td></td></tr><tr><td> 5,25% Natriumhypochloriet </td><td> Austin&#39;s </td><td></td><td> A-1 Merk </td></tr><tr><td> T3 RNA polymerase-Plus </td><td> Ambion </td><td> AM2733 </td><td> Opslag bij -20 ° C </td></tr><tr><td> T7 RNA polymerase </td><td> Ambion </td><td> AM2082 </td><td> Opslag bij -20 ° C </td></tr><tr><td> 95% Ethanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC61511-0040 </td><td></td></tr><tr><td> Fisherbrand wegwerp polyethyleen transferpipetten </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-711-7M </td><td></td></tr><tr><td> 37% Formaldehyde </td><td> Fisher Scientific </td><td> F79-500 </td><td></td></tr><tr><td> HPLC-grade methanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A452-1 </td><td></td></tr><tr><td> Magnesiumchloride </td><td> Fisher Scientific </td><td> M87-500 </td><td></td></tr><tr><td> Microscoop afdekglas </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12 542A </td><td> 18 x18 mm </td></tr><tr><td> N-heptaan </td><td> Fisher Scientific </td><td> H350-1 </td><td></td></tr><tr><td> P-xyleen </td><td> Fisher Scientific </td><td> O5082-500 </td><td></td></tr><tr><td> Pyrex 9-goed Spot Plate </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13 748B </td><td> 100x85 mm </td></tr><tr><td> Natriumchloride </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC32730-0025 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumhydroxide </td><td> Fisher Scientific </td><td> SS255-1 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost / Plus objectglaasjes </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-15 </td><td> 25x75x1.0 mm </td></tr><tr><td> Davlyn Red Clear-liner Toupee tape </td><td> Hair Direct </td><td> ROOD-75R12 </td><td> Poly / Skin basismateriaal 0,75 in x 12 m rol tape </td></tr><tr><td> TOPOTA Cloning Kit voor Sequening met een schot Top10 chemisch competente E. coli </td><td> Invitrogen </td><td> K457501 K457540 </td><td> 20 reacties 40 reacties </td></tr><tr><td> Gesoniceerd zalmsperma DNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15632-011 </td><td> Opslag bij -20 ° C </td></tr><tr><td> Anti-digoxigenine-AP Fab fragmenten </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1093274 </td><td> Opslag bij 4 ° C </td></tr><tr><td> DIG RNA etikettering mix </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1277073 </td><td> Opslag bij -20 ° C </td></tr><tr><td> NBT / BCIP stockoplossing </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1681451 </td><td> Opslag bij 4 ° C </td></tr><tr><td> West-blokkeren Reagens </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11921673001 </td><td> Opslag bij 4 ° C </td></tr><tr><td> Saatilene Hitech polyester mesh (330,130) </td><td> Saati Print </td><td> 330,34 UO PW </td><td> 330 draden / inch, 34 micron draad diameter, oranje kleur </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Sigma </td><td> G6279-1 </td><td> 70% PBT </td></tr><tr><td> Heparine natriumzout </td><td> Sigma </td><td> H3393 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P1379-500 </td><td></td></tr><tr><td> 37% Formaldehyde </td><td> Ted Pella </td><td> 18508 </td><td> 10 ml in amber ampullen </td></tr><tr><td> 16 oz. Solo papier containers met deksels </td><td> De Paper Company </td><td> SOLOKH16AJ8000 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilicaatglas scintillation flacon met losse schroefdop </td><td> VWR International </td><td> 66022-128 </td><td> 20 ml bij 500 </td></tr><tr><td> Sealed Air Bubble wrap celluar opvulmateriaal </td><td> VWR International </td><td> 500018-081 </td><td> 10 voet / roll 0,188 cm dik </td></tr><tr><td> Kip serum </td><td></td><td></td><td> Volbloed werd verzameld, hetzij van de vleugel ader of door cardiale punctie van een jonge kip. Bloed werd geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 1 uur tot gecoaguleerd en op ijs gezet gedurende 30 minuten. Het serum werd verzameld en gecentrifugeerd bij 3000 x g gedurende 10 minuten. De resulterende supernatant (toegelicht serum) werd verzameld en opgeslagen bij -20 ° C tot gebruik. </td></tr></tbody></table> Tabel 4. Tabel specifieke reagentia en materialen voor hybridisatie in situ.

hybridisatie<em&gt; in situ</em&gt; van de speekselklieren, eierstokken, en embryo&#39;s van vector muggen

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Muggen zijn vectoren voor een gevarieerde set van pathogenen, waaronder arboviruses, protozoaire parasieten en nematoden. Onderzoek van de transcripten en gen toezichthouders die zijn uitgedrukt in weefsels waarin de mug gastheer en pathogeen interactie krijgen en in organen die betrokken zijn bij de voortplanting van groot belang zijn voor strategieën om muggen overgedragen overdracht van de ziekte te verminderen en te verstoren ei-ontwikkeling. Een aantal hulpmiddelen zijn gebruikt om te bestuderen en valideren van de tijdelijke en weefsel-specifieke regulatie van genexpressie. Hier wordt beschreven protocollen die zijn ontwikkeld om ruimtelijke informatie, die inzicht waar specifieke genen tot expressie en producten verbetert accumuleren verkrijgen. De beschreven protocol is gebruikt om uitdrukking te valideren en te bepalen accumulatie patronen van transcripten in weefsels die verband houden met muggen overgedragen pathogeen transmissie, zoals vrouwelijke speekselklieren, en subcellulaire compartimenten van de eierstokken en embryo&#39;s, waarin islaat om muggen voortplanting en ontwikkeling. De volgende procedures een geoptimaliseerde methode die de efficiëntie van verschillende stappen in het protocol verbetert zonder verlies van doelwitspecifieke hybridisatie signalen. Richtlijnen voor het RNA-probe voorbereiding, zijn ontleding van zachte weefsels en de algemene procedure voor fixatie en hybridisatie beschreven in deel A, terwijl de stappen die specifiek zijn voor het verzamelen, fixatie, pre-hybridisatie en hybridisatie van muggen embryo&#39;s worden gedetailleerd beschreven in deel B

Temporele en ruimtelijke genexpressie analyses moeten een cruciale rol in de functionele genomica. Whole-mount hybridisatie<em&gt; In situ</em&gt; Is handig voor het bepalen van de lokalisatie van transcripten in de weefsels en subcellulaire compartimenten. Hier schetsen we een hybridisatie<em&gt; In situ</em&gt; Protocol met aanpassingen voor specifieke weefsels in muggen.

Hybridisatie<em&gt; In situ</em&gt; Van de speekselklieren, eierstokken, en embryo&#39;s van Vector Muggen

Muggen zijn vectoren voor een diverse verzameling pathogenen, waaronder arbovirussen, protozoaire parasieten en nematoden. Onderzoek naar transcripten en genen ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het uitvoeren van hybridisatie in situ om de lokalisatie- en accumulatiepatronen van specifieke transcripten binnen muggenweefsels en embryo's te bepalen. Dit wordt bereikt door eerst de muggenweefsels of embryo's te fixeren, zodat de ultrastructuur van het weefsel en de mRNA-doelwitten behouden blijven en beschikbaar zijn voor hybridisatie met antisense RNA-probes. Vervolgens worden de antisense RNA-probes gehybridiseerd met de doeltranscripten binnen de gefixeerde weefsels of embryo's.Vervolgens worden colorimetrische antilichaamkleuringsmethoden uitgevoerd om de lokalisatie en accumulatiepatronen van het doel-mRNA te detecteren. Er worden resultaten verkregen die ruimtelijke patronen van RNA-accumulatie laten zien op basis van hybridisatie in C twee en colorimetrische detectiemethoden. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de functionele genomica, zoals het vaststellen wanneer en waar genproducten zich ophopen in de mug.Deze procedure stelt ons ook in staat om informatie over de ruimtelijke lokalisatie te verkrijgen om beter te begrijpen hoe genexpressie wordt gereguleerd voor biologische processen zoals reproductieve ontwikkeling en interacties tussen muggen en pathogenen. Om de hybridisatie van digoxygenine-gelabelde RNA-probes aan muggenweefsels voor te bereiden, begint men met het dissekeren van de eierstokken en speekselklieren. Fixeer vervolgens het weefsel en behandel het indien nodig met proteinase K.Nadat de weefsels zijn nagefixeerd, worden ze 30 minuten geëquilibreerd in één milliliter van een een-op-een mengsel van hybridisatieloplossing PBT of HIB PBT met agitatie; wacht vervolgens tot het weefsel is bezonken en schenk daarna zoveel mogelijk HIB PBT af. Voeg vervolgens één milliliter HIB toe aan elke monsterbuis. Wikkel de monsterbuis in luchtdichte beschermende verpakking, zoals noppenfolie, en plaats deze in een hybridisatiefles.Sluit de fles af met een hybridisatiedop en incubeer deze 30 minuten bij 55 °C onder rotatie. Haal de fles uit de incubator, laat het weefsel bezinken en schenk vervolgens voorzichtig de prehybridisatiebuffer af, waarbij 50 µL van de oplossing in de buis achterblijft om monsterverlies te voorkomen. Voeg daarna 50 µL voorverwarmde hoge buffer toe aan hetzelfde monster en plaats dit in een warmteblok ingesteld op 55 °C; denatureer de eerder bereide RNA-sonde gedurende vijf minuten bij 85 °C.Plaats het vervolgens onmiddellijk vijf minuten op ijs. Pipetteer daarna de RNA-sonde in de monsterbuis. De RNA-sonde zal op de HI-oplossing naar het oppervlak drijven.Meng door tegen de wand van de buis te tikken. Incubeer de monsters voorzichtig in een vast microcentrifuge-rek in een hybridisatieoven bij 55 °C gedurende 16 tot 24 uur. Volg daarna de RNA-behandeling en antilichaamkleuring zoals beschreven in het schriftelijke protocol.Monteer de weefselmonsters door ze eerst met een 200 µL pipetpunt over te brengen naar individuele rondbodemputjes van een Pyrex spotplaat. Verwijder zoveel mogelijk van het PBT en bedek het monster met 70% glycerol in water. Laat de glycerol het monster gedurende de nacht bij vier °C penetreren.Om microscoopglaasjes voor te bereiden, begint u met het schoonvegen van het glasoppervlak met Kim wipes. Breng vervolgens met een penseel twee stukjes onzichtbare plakband parallel aan elkaar aan, zodat er een smal kanaal wordt gevormd. Pak de monsters één voor één op en plaats ze langs de lengte van het kanaal, waarbij elk monster in dezelfde oriëntatie wordt gepositioneerd ten opzichte van de anterieure, posterieure en dorso-ventrale uitlijningen.Nadat elk monster is gepositioneerd, wordt een Kim wipe-strookje gebruikt om overtollige glyceroloplossing rondom de weefsels te absorberen. Het verwijderen van de overtollige glycerol is belangrijk om de vorming van luchtbellen te voorkomen bij het verzegelen van de gemonteerde monsters op de objectglas onder een dekglas. Plaats voorzichtig een dekglas over het kanaal met de uitgelijnde monsters. Bevestig het dekglas semi-permanent op het objectglas door de hoeken met transparante nagellak aan te stippen. Gebruik een 200 µL pipet om langzaam 70% glycerol in één uiteinde van het kanaal te dispenseren om het kanaal en het gebied onder het dekglas permanent te vullen.Zegel de gemonteerde monsters door nagellak aan alle vier de zijden van het dekglas aan te brengen. Laat de nagellak voldoende drogen voordat de monsters worden afgebeeld. Nadat embryo's zijn verzameld uit een kooi met 300 gepaarde volwassen vrouwelijke muggen en deze tot de gewenste stadia zijn ontwikkeld, worden ze vanuit hun verzamelcontainer overgebracht naar een tylene mesh decoration Catch tube voor tachtig embryo's.Plaats de opvangbuis in een bekerglas dat is gevuld met voldoende gedestilleerd water, zodat de opvangbuis voor de helft gevuld is. Gebruik een kunstpenseel om de embryo's van het tylene-gaas los te maken en breng ze over naar de met water gevulde opvangbuis. Voor een grote hoeveelheid embryo's verwijdert u het tylene-gaas uit de opvangbak en vouwt u het gaas voorzichtig om een trechter te vormen, terwijl u de gaastrechter met één hand vasthoudt.Gebruik de andere hand om water langs de zijkanten van de trechter te spuiten om de embryo's in de opvangbuis te spoelen. Deze methode kan worden toegepast op abnormale embryo's omdat zij de adhesieve stof missen die aanwezig is op het oppervlak van gezonde embryo's, waardoor eitjes aan diverse substraten kunnen hechten. Bereid 40 milliliters decoratie-oplossing voor en giet de oplossing in een 100 millimeter Petrischaal.Voeg 50 milliliter gedestilleerd water toe aan een bekerglas van 100 milliliter en zet dit opzij. Plaats vervolgens de embryo's in de Petrischaal met decoratielosie. Gebruik een wegwerppipet van polyethyleen om de embryo's te wassen terwijl u het opvangbuisje ronddraait, zodat de embryo's ondergedompeld blijven en worden bewogen in de decoratielosie.De-chorionering is een van de meest gevoelige stappen van het protocol, en een te langdurige behandeling van de embryo's van achtpotigen met natriumhypochloriet zal een correcte barstvorming van het endochorion voorkomen. Voor embryo's van achtpotigen is een maximale tijd van 35 seconden vereist, terwijl 75 seconden voldoende is voor embryo's van QX. Verifieer de de-chorionering onder een dissectiemicroscoop bij een lage vergroting. Bij embryo's van achtpotigen zal het netachtige exochorion ontbreken en is alleen het gladde, gepolijste oppervlak van het zwarte endochorion aanwezig voor embryo's met anomalieën.De exo-chorionvlotten en richelstructuren zullen afwezig zijn zodra de embryo's zijn gecoat. Ga over tot het fixeren en openbreken van het endo-chorion volgens de procedure die in het schriftelijke protocol is beschreven. Om het opengebroken endo-chorion te verwijderen, plaatst u een stukje dubbelzijdige toupetape in het midden van een Petri-schaal van drie centimeter met behulp van een 200 µL pipetpunt met een grote opening.Breng de embryo's over van de methanol naar de dubbelzijdige plakband. Laat de embryo's één tot twee minuten bezinken en aan het oppervlak van de plakband hechten, giet het overtollige methanol af en laat het oppervlak één tot twee minuten licht drogen. Voeg vervolgens 95% ethanol toe aan de Petrischaal om de embryo's verder op de plakband te immobiliseren; pipetteer 600 µL gedestilleerd water in de ethanol en draai de schaal voorzichtig om te mengen.Gebruik vervolgens een 27.5 naald bevestigd aan een spuit van één milliliter om het gebarsten endochorion af te pellen. Nadat het witte embryo uit de zwarte resten van het endochorion is bevrijd met een fijngepunte kunstenaarpenseel, worden de embryo's prompt van de tape overgebracht naar het ethanolreservoir van de Petrischaal. Breng de embryo's vervolgens met een pipetpunt van drie millimeter over naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter die 500 µL 100% ethanol bevat. Was de embryo's tot slot twee tot drie keer in 100% ethanol en bewaar de embryo's in pure ethanol bij -20 °C.In deze figuur toont in C twee hybridisatie van complete speekselklieren van vrouwelijke Aedes aegypti met mRNA-probes gericht op amylase 1D7S2 en D7L2 de accumulatie van deze transcripten in respectievelijk de proximale laterale, distale laterale en distale lateraal-mediale lobben. In dit experiment werden complete cysten van drie muggensoorten gehybridiseerd met mRNA-probes die specifiek gericht zijn op de respectievelijke autologe transcripten van Oscar. Hier in C twee werd hybridisatie van complete embryo's van Anopheles gambiae, Aedes aegypti en Culex quinquefasciatus uitgevoerd met gebruik van antisense RNA-probes gericht op de respectievelijke autologe Oscar-transcripten van de muggen.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van het uitvoeren van een C two-hybridisatie-experiment om de lokalisatie en accumulatie van transcripten in specifieke muggenweefsels of embryo's te bepalen.

hybridization-situ-salivary-glands-ovaries-embryos-vector

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Methoden voor het gebruik van Alphavirus transducing systemen om TL-verslaggevers uit te drukken in vitro en in volwassen muggen worden beschreven. Deze techniek kan worden aangepast aan een eiwit van belang uit te drukken in plaats van of naast een verslaggever.

Alphavirus Transducing System: Tools voor het visualiseren van besmetting in Mosquito Vector

Fluorescerende<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie op Mitotische Chromosomen van muggen

Voor een efficiënte controle van mug virusverspreiding gedragen, is de kennis van het potentieel van de vector van respectieve muggen van bijzonder belang. Beschrijven we gedwongen speekselvloed als een methode voor het analyseren van vector bevoegdheid van Aedes albopictus en drie verschillende Culex taxa voordeoverdracht van Zika-virus.

Gedwongen speekselvloed als een methode voor het analyseren van Vector bevoegdheid van muggen

Dit protocol beschrijft een microinjection methodologie die we hebben gestandaardiseerd en gebruikt jarenlang voor bepaalde hoeveelheden van nucleïnezuren rechtstreeks naar de Hemolymfe van muggen en huis vliegt. Dit protocol resulteert in minimale injectie sterfte en laat dosis gecorreleerd metingen van vruchtbaarheid.

Reproduceerbaar dsRNA Microinjection en Oviposition Bioassay in muggen en huis vliegt

Dit protocol beschrijft micro-injectieprocedures voor Culex quinquefasciatus embryo's die zijn geoptimaliseerd om te werken met CRISPR/Cas9 genbewerkingstools. Deze techniek kan efficiënt site-specifieke, erfelijke, kiembaanmutaties genereren die kunnen worden gebruikt voor het bouwen van genetische technologieën in deze onderbelichte ziektevector.

Embryo micro-injection technieken voor efficiënte site-specifieke mutagenese in Culex quinquefasciatus

Deze methodologie, die orale voeding en intrathoracale injectie-infectie omvatte, kon de invloed van midgut- en / of speekselklierbarrières op arbovirusinfectie effectief beoordelen.

Experimentele virale infectie bij volwassen muggen door orale voeding en micro-injectie

Gezien hun eenvoudige anatomie bieden Anopheles-testikels een goed cytologisch model voor het bestuderen van spermatogenese. Dit protocol beschrijft whole-mount fluorescentie in situ hybridisatie, een techniek die wordt gebruikt om dit biologische proces te onderzoeken, evenals het fenotype van transgene stammen die mutaties herbergen in de genen die betrokken zijn bij de productie van sperma.

Whole-Mount Fluorescentie In Situ Hybridisatie om Spermatogenese in de Anopheles-mug te bestuderen

Het artikel beschrijft de methoden en reagentia die nodig zijn om hybridisatiekettingreactie-RNA, whole-mount fluorescentie in situ hybridisatie (HCR, RNA, WM-FISH) uit te voeren om inzicht te krijgen in de ruimtelijke en cellulaire resolutie van chemosensorische receptorgenen in de muggenantenne en maxillaire palp.

Hybridisatie Kettingreactie RNA Whole-Mount Fluorescentie In situ Hybridisatie van chemosensorische genen in olfactorische aanhangsels van muggen

Microbiële gemeenschappen in muggen zijn veelbelovend voor vector biologische bestrijdingsstrategieën. De meeste symbionten zijn niet te kweken, waardoor metagenomische analyses nodig zijn. We beschrijven een methode om vrouwelijke muggen te ontleden en eierstokken, middendarm en speekselklieren te scheiden, kruisbesmetting te voorkomen, microbioomstudies op orgaanniveau te vergemakkelijken en het begrip van de rol van micro-organismen in de biologie van muggen te vergroten.

Dissectie van eierstokken, middendarm en speekselklieren van muggen voor microbioomanalyses op orgaanniveau

Dit protocol beschrijft een eenvoudige zelfklevende tape-gebaseerde aanpak voor de bemonstering van de tomaten en andere verse producten oppervlakken, gevolgd door een snelle volledige cel detectie...

Combinatie van Adhesive-tape-gebaseerde Sampling en fluorescentie In situ Hybridisatie voor snelle detectie van Salmonella Op Fresh Produce

Leer hybride in situ-hybridisatie voor genexpressie-analyse in speekselklieren, eierstokken en embryo's van vector muggen. Deze methode visualiseert transcriptlokalisatie voor functionele genomics-onderzoek.

Hybridisatie

Meer video's verkennen