Een gepolijste en gewapend verdund-schedel Venster voor de lange termijn beeldvorming van de hersenen van muizen

Het algemene doel van deze procedure is het creëren van een stabiel, dun schedelvenster over de cortex van de muis om herhaalde beeldvorming mogelijk te maken zonder de intracraniële omgeving te verstoren. Dit wordt bereikt door eerst een hoofdhoudersysteem te bevestigen, waardoor de kop stabiel onder het beeldvormingsapparaat kan worden vastgezet. Vervolgens wordt de schedel voorzichtig dun gemaakt in een gebied over het dorsale oppervlak van de hersenen, waarna het oppervlak met fijn schuurmiddel wordt gepolijst.

Dek het venster vervolgens af met een kleine hoeveelheid cyanoacrylaatlijm en een dekglas om het venster te verstevigen. De laatste stap is het voorbereiden van het dier voor beeldvorming met de tweefotonmicroscoop. In vivo wordt tweefotonmicroscopie uiteindelijk gebruikt om fijne structuren zoals arteriolen, haarvaten en neuronale dendrieten weer te geven, die gedurende weken tot een diepte van 250 micrometers in de cortex kunnen worden afgebeeld.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek voor het maken van een craniale window is dat de schedel boven de cortex ongemoeid blijft. Eerst maken we de schedel dunner om optische helderheid te verkrijgen, en vervolgens verstevigen we de schedel met cyanoacrylaatlijm en het dekglas. Deze methode zou nuttig kunnen zijn voor het bestuderen van diverse fluorescente transgene muizen in geanestheseerde of OIC-toestanden.

Om deze procedure te starten, autoclaveert u de benodigde chirurgische instrumenten en anestheseert u een muis van ongeveer drie tot zes weken oud volgens de methoden in het bijbehorende manuscript. Controleer de reflex door in de teen te knijpen om er zeker van te zijn dat de muis zich in het chirurgische anesthesievlak bevindt. Zet vervolgens de muis vast in een stereotaxisch frame.

Houd de lichaamstemperatuur van de muis op 37 °C. Maak hiervoor gebruik van een feedback-gereguleerde rectale probe en een warmtemat. Breng oogzalf aan op de ogen om vochtvast te houden.

Scheer vervolgens de hoofdhuid met de kleine elektrische scheerapparaat. Maak daarna de hoofdhuid schoon met Betadine, gevolgd door het afvegen met 70% isopropylalcohol. Warm vervolgens een aliquot steriel kunstmatig cerebrospinaal vocht op tot 37 °C onder een microscoop.

Verwijder de hoofdhuid over het gehele dorsale schedeloppervlak met een chirurgische schaar. Trim de huid lateraal tot aan de randen van de temporalisspieren aan weerszijden van de schedel en posterieur aan de nekspieren. Gebruik vervolgens een scalpelblad om het dunne periosteum van het schedeloppervlak te verwijderen.

Droog en reinig vervolgens de schedel. Breng daarna een dunne laag cyanoacrylaatlijm aan op het oppervlak van de schedel. Laat de lijm volledig drogen.

Deze lijmlaag is vereist voor een goede hechting van het tandheelkundige cement. In de volgende stappen: boor voor de voorbereiding van de beeldvorming bij het wakkere dier gaatjes en draai twee zelfborende schroeven nummer 0 0 0 in het contralaterale schedeloppervlak.

Bevestig vervolgens een starre, op maat gemaakte connector met twee bevestigingspunten aan de schedel. Dit vermindert de vrijheidsgraden aanzienlijk en vereenvoudigt de herpositionering van hetzelfde beeldveld in longitudinale studies. Een brede dwarsbalk biedt bovendien voldoende ruimte voor de plaatsing van elektroden en de stimulatie van vibratie.

Bedek vervolgens het gehele schedeloppervlak, met uitzondering van de locatie van het venster, met een laag tandheelkundig cement; zorg ervoor dat alle blootgestelde randen van de huid door het cement worden bedekt. Controleer vóór het dunner maken van de schedel of de boorkoppen scherp zijn en vermijd het hergebruiken ervan. Gebruik een tandheelkundige boor op lage snelheid om een gebied van 2 mm bij 2 mm boven de somatosensorische cortex dunner te maken met een boorkop van 0,5 mm.

Dun vervolgens het droge schedeloppervlak telkens slechts enkele seconden lang uit, waarbij de schedel periodiek met CSF wordt bevochtigd om oververhitting te voorkomen. Dun vervolgens het bot verder uit. Schakel de boor daarna over naar een lagere snelheid en schaaf het schedeloppervlak met slechts lichte aanrakingen.

De boor moet het oppervlak benaderen onder een hoek van ongeveer 30 graden ten opzichte van de verticale as. Ga door met het dunner maken van het bot voorbij de vasculaire laag tot in de tweede botlaag. Boven het oppervlak van de hersenen.

Houd de boor met kleine, gecontroleerde bewegingen vast en oefen alleen kracht uit in laterale richting. Wanneer het bot ongeveer 50 microns dik is, zouden de peelvaten duidelijk zichtbaar moeten zijn door het natte bot. Bij deze diepte worden kleine witte vlekken in het bot gedurende enkele seconden zichtbaar.

Direct nadat het droge schedeloppervlak is bevochtigd, moet de uiteindelijke botdikte ongeveer 10 tot 15 micron zijn. Wanneer het bot voldoende dun is, zullen de kleine witte vlekken in het bot niet langer zichtbaar zijn wanneer het droge schedeloppervlak wordt bevochtigd. Polijst het venster nu met tinoxidepoeder.

Gebruik een klein plukje poeder van ongeveer een kwart van de grootte van het venster en meng een slurry van poeder met een CSF met behulp van een kant-en-klare boor met een siliconen zweep. Polijst het oppervlak gedurende 10 minuten, spoel het tinoxidepoeder grondig van het venster af en droog het bot. Dit proces moet helpen om eventuele ruwe randen die door de boor tijdens de uitdunningsprocedure zijn achtergelaten, te verminderen.

Snijd vervolgens een paar vierkante stukjes dekglas nummer nul met een afmeting die iets kleiner is dan de afmeting van het venster. Gebruik een kraspen om de gescheiden horizontale en verticale lijnen in het dekglas voorzichtig aan te krassen. Glijd met een rechte rand over de lijnen zonder het glas te breken.

Plaats vervolgens het dekglas in een petrischaal. Scheid de glasstukken door de schaal tegen de rand van een tafel te tikken. Breng daarna met de houten punt van een afgebroken wattenstaafje een kleine hoeveelheid Sano ACRL-lijm op het venster aan.

Plaats snel een voorgesneden stukje dekglas bovenop de lijm. Voorkom dat er luchtbellen onder het dekglas ontstaan nadat de lijm gedurende 15 minuten volledig is gedroogd. Verwijder overtollige cyanoacrylaatlijm van het bovenoppervlak van het dekglas met een scalpelblad.

Kit de randen van het venster af met tandcement. Vorm vervolgens een licht verhoogde kuil om water vast te houden voor de diplens aan het einde. Plaats het dier in een warme kooi totdat het volledig is hersteld van de anesthesie.

Stabiliseer in deze stap het dier op een optische broodplaat voor beeldvorming en gebruik het frame als hoofdsteun. Onze aparte plaat kan het dier en alle fysiologische monitoringsapparatuur, gemonteerd als één geheel, transporteren tussen de chirurgische locatie en de locatie voor tweefotonen-beeldvorming. Indien beeldvorming van de bloedstroom gewenst is, injecteer dan 0,05 milliliters van 5% fluorescent dextraankleurstof via de infraorbitale vene om het bloedserum te labelen.

Dit moet onder algemene anesthesie worden uitgevoerd en de kleurstof blijft gewoonlijk enkele uren in de circulatie. Injecteer lactaatringeroplossing intraperitoneaal in een volume van 3 µL per gram elke twee uur om de lichaamsvloeistoffen en energiebehoefte op peil te houden. Laat de muis ontwaken door de toediening van isofluraan te staken.

Eén uur na het ontwaken is de muis klaar voor beeldvorming. Sluit de kooi over de microscoop om lichtcontaminatie te voorkomen. Getoond. Hier is een voorbeeld van de corticale vasculatuur van een dijbeen bij een YFP-muis, gelabeld door intraveneuze injectie van dextran geconjugeerd Texas red; dural vaten zijn vaak zichtbaar vlak boven het corticale oppervlak in de dura mater.

Grote peelarteriën en -venen liggen op het corticale oppervlak. Penetrerende vaten vertakken zich vanuit dit oppervlakkige netwerk en dringen de cortex binnen, waar ze zich vertakken in een dicht capillair bed dat het corticale weefsel voedt. Deze video toont de vasculatuur aan het peeloppervlak bij een wakkerte muis.

Spontane oscillaties in de arteriële diameter kunnen worden waargenomen wanneer het dier zich in een rusttoestand bevindt. Deze methode zou nuttig kunnen zijn voor het bestuderen van een breed scala aan fluorescente transonische dieren, zowel in geanestheseerde als in wakkere toestand.