Name: Een gepolijste en gewapend verdund-schedel Venster voor de lange termijn beeldvorming van de hersenen van muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Leer een gepolijste en versterkte dunne schedelvenstertechniek voor langetermijnbildvorming van de muizencortex. Deze methode maakt stabiele in vivo beeldvorming mogelijk zonder hersenontsteking.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de American Heart Association (Post-doctorale beurs te Ays) en de National Institutes of Health (MH085499, EB003832 en OD006831 naar DK). Wij danken Beth Friedman en Pablo Blinder voor commentaar op het manuscript.

1. Voorbereiding voor Chirurgie i <ol><li> Maak de chirurgische instrumenten door sonicatie in een mengsel van Maxizyme en Chirurgische Melk in een ultrasone reiniger. Autoclaaf de chirurgische instrumenten voor elk experiment. </li><li> Zorg ervoor dat alle benodigde reagentia en disposables beschikbaar zijn. Een lijst van reagentia en disposables wordt gegeven in tabel 2. Reagentia en disposables die in contact komen met zichtbare weefsel moet steriel zijn, indien mogelijk. </li><li> Laten verdoving. Typische anesthetica voor overleving studies worden in Tabel 1. Zorg voor chirurgische vlak van anesthesie door te controleren op het ontbreken van teen knijpen reflex. De optimale leeftijd van de muis is 3 tot 6 weken oud zijn. De schedels van jonge muizen zijn zachter en moeilijker te dun. Oudere muizen hebben dikkere schedel dat er meer zullen bloeden tijdens het dunner procedure. </li><li> Zet het dier in een stereotaxisch frame 1. Een lijst van chirurgische instrumenten in Tabel 2. </li><li> Houd de lichaamstemperatuurtuur bij 37 ° C met behulp van een feedback gereguleerd rectale sonde en warmte pad. </li><li> Breng oogzalf voor de ogen om vocht vast te houden. </li><li> Scheer de hoofdhuid met een kleine elektrische scheermes. </li><li> Reinigen hoofdhuid met Betadine, gevolgd door deppen met 70% (v / v) isopropanol. </li><li> Indien gewenst, controleer dan of hartslag en ademhaling zijn binnen een normale bereik met behulp van een saturatiemeter. Voor een muis, deze nummers moet het centrum ongeveer 10 en 2 Hz, respectievelijk. </li><li> Warm een hoeveelheid van steriel gefiltreerd kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) tot 37 ° C (125 mM NaCl, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, 3,1 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, pH 7,4) (alle chemicaliën uit Sigma) 2. </li></ol> 2. Montage van een Hoofd Kader <ol><li> Verwijder de hoofdhuid over het gehele dorsale schedel oppervlak met een pincet en chirurgische schaar. Snijd de huid zijkanten aan de randen van de tijd spieren aan weerszijden van de schedel en naerior naar de spieren van de nek (afb. 1A). </li><li> Gebruik een scalpel de dunne periosteum uit het oppervlak van de schedel. </li><li> Maak de schedel met een vochtige katoenen getipt applicator en droog de schedel oppervlak met een stroom van lucht uit een stof kan. Breng vervolgens een dun laagje cyanoacrylaat lijm op de hele schedel oppervlak. Laat de lijm goed drogen. Deze lijmlaag wordt vereist voor een goede hechting van de tand cement in opeenvolgende stappen. De cyanoacrylaatlijm niet te worden gesteriliseerd. </li><li> Voeg een metalen connector de schedel oppervlak uit de buurt van het gewenste venster. Voor de narcose preparaten, kan een kleine moer worden bevestigd aan de schedel met een schar van cyanoacrylaat lijm, die later kunnen worden vastgeschroefd in de imaging-setup met een bout (afb. 1B, 1L en 1N). Sluit de achterzijde van de moer met tape om ervoor te zorgen dat de lijm niet de draden in te voeren tijdens de gehechtheid aan de schedel. De moer en tape worden gesteriliseerd<html> de autoclaaf voor chirurgie. </li><li> Voor wakker beeldvorming voorbereidingen, sluit een meer rigide aangepaste connector met twee bevestigingspunten (afb. 1M en 1N). Boor twee gaten in de schedel boven de contralaterale corticale halfrond met een ½ mm boor bramen, en dan worden twee # 000 zelftappende schroeven. Deze schroeven zal helpen verankeren het hoofd te monteren aan de schedel. Breng slechts een volledige omwenteling van de schroef om te voorkomen uitoefenen van druk op de onderliggende cortex. Vervolgens bevestigt u de op maat gemaakte metalen kruis bar met een klein beetje van cyanoacrylaat lijm over de kleine hersenen. Laat de cyanoacrylaat lijm goed drogen. Deze metalen connector vermindert de mate van vrijheid en vereenvoudigt verplaatsing van dezelfde beeldvorming veld in longitudinale studies. Een brede dwarsbalk geeft voldoende ruimte voor plaatsing van de elektroden en het stimuleren van vibrissae. Gedetailleerde plannen voor het genereren van de aangepaste kop mount en gehechtheid apparaat zijn online beschikbaar (SICS / links.html &quot;&gt; http://physics.ucsd.edu/neurophysics/links.html). De schroeven en dwarsbalk moet worden gesteriliseerd in de autoclaaf voorafgaand aan de operatie. </li><li> De gehele oppervlak schedel, exclusief de locatie van het venster met een laag tandheelkundige cement (Fig. 1C en 1D). Zorg ervoor dat alle blootgestelde randen van de huid worden gedekt door cement. De componenten van de tandheelkundige cement hoeven niet te worden gesteriliseerd. </li></ol> 3. Het genereren van een gepolijste en versterkt verdund-schedel (poorten) Window <ol><li> Zorg ervoor dat de boor bramen scherp zijn en voorkomen dat opnieuw te gebruiken. Met behulp van een lage snelheid op de tandartsboor, dunne een 2 mm bij 2 mm regio over de somatosensorische cortex met een ½ mm braam. Schakelen tussen het bevochtigen van de schedel met ACSF en dan het drogen van de schedel oppervlak met een zachte stroom van lucht uit een gas stofdoek, nat voor koeling, en droog te verdunnen. Dit vereist dunner door het trabeculair laag van de schedel, die kunnen bloeden, maar kan controll wordened door te spoelen met ACSF (fig. 1E). De schedel begint te buigen onder de lichte druk van de boor als het ~ 50 um, en de pial vaartuigen moeten zichtbaar zijn door natte bot (fig. 1F). Bij deze dikte zullen witte plekken in het bot zichtbaar enkele seconden onmiddellijk na het droge schedel oppervlak bevochtigd. </li><li> Op dit punt dunne het bot verder. Gebruik een langzamere boor snelheid, dat wil zeggen, 1000 rpm, waarbij de schedel oppervlak scheert met slechts een lichte aanraking. Gebruik kleine gecontroleerde bewegingen, terwijl de boor als een pen en enige kracht toe te passen in de laterale richting. Het bot moet 10 tot 15 urn worden op ~ op de uiteindelijke dikte (fig. 1G). Wanneer het bot voldoende dun is, zal de kleine witte vlekken in het bot niet meer zichtbaar zijn wanneer de droge schedel oppervlak wordt bevochtigd. </li><li> Poets het venster regio met tin oxide poeder. Bevestig een vooraf gemaakte boor die is gedrenkt in siliconen aquarium kit en metgetrokken, waardoor een taps toelopende zweep (inzet, Fig. 1H). De siliconen zweep moet bereid zijn minstens een dag voor de operatie, en gesteriliseerd met 70% isopropanol voor gebruik. Leg een klein snufje poeder op het raam, samen met een daling van ACSF (fig. 1H). Schud de mest over het venster voor maximaal tien minuten zachtjes aanraken van het punt van de bewegende zweep om de schedel oppervlak. Spoel weg tin oxide poeder goed uit het raam met behulp van ACSF en droog het bot met een zachte luchtstroom. Oppervlakte onregelmatigheden en aanhanger botsplinters achtergelaten door het boren in de vorige stappen dient te worden verwijderd na het polijsten (fig. 1H en 1I). De tinoxidepoeder niet te worden gesteriliseerd. </li><li> Afgesneden stukjes niet. 0 afdekglas iets kleiner dan de grootte van het venster. Gebruik een schrijver om voorzichtig gescheiden horizontale en verticale lijnen scoren in het deksel slip met een rechte rand. Plaats vervolgens het deksel slip in een petrischaal en knock de schotel tegen een tafelrand om het glas stukken te scheiden. De gehele petrischaal kan dan worden geautoclaveerd de steriliteit te verzekeren. </li><li> Plaats een juiste maat dekglas de buurt van de gedroogde venster. Breng een kleine schar van cyanoacrylaat lijm over de ruit met de punt van een gebroken houten wattenstaafje applicator, en snel druk op de voorgesneden stuk dekking van glas boven op de lijm. Zorg dat er geen luchtbellen onder het dekglas. Duw het deksel glas tegen de schedel oppervlak, en houd een paar seconden (fig. 1J en 1O). Laat de lijm goed drogen meer dan 15 minuten. Overtollig cyanoacrylaatlijm kan worden verwijderd van het bovenvlak van het deksel glas met een scalpel na het drogen. De randen van het dekglas met tandheelkundige cement en vormen een enigszins verhoogd tot en water te houden voor de onderdompeling lens (Fig. 1K en 1O). </li></ol> 4. Herstel <ol><li> Plaats het dier in een warme kooi na de operatie. Controleer dedier regelmatig tot het herstelt volledig van anesthesie. </li><li> Indien het preparaat bedoeld de meer dan een dag voorzien buprenorfine (0,03 pg per g knaagdier) analgesie. We typisch beeld van het dier ten minste een dag na de eerste implantatie. </li></ol> 5. Imaging Voorbereiding <ol><li> Stabiliseer het dier op een optische breadboard voor beeldvorming, met behulp van het frame als een hoofdsteun (afb. 1L en 1M). Een bevestigingssysteem inrichting kan worden gemaakt van in de handel verkrijgbaar optomechanische componenten van Qioptiq of Thorlabs. Onze afzonderlijke plaat kan worden getransporteerd tussen chirurgische en twee-foton beeldvorming suites met het dier en alle fysiologische monitoring apparaten gemonteerd als een eenheid 3. </li><li> Als de bloedstroom beeldvorming gewenst injecteren 0,05 ml 5% (w / v) fluorescerende dextran kleurstof opgelost in steriele zoutoplossing hetzij via de staartader of infraorbitale ader het bloed serum (Fig. 2A en 2C te labelen 2H </strong&gt;) 4-7. Dit moet gebeuren onder algemene verdoving. Infraorbitale veneuze toediening kan makkelijker zijn voor beginners, zoals dextran oplossingen meer viskeus. De staart ader kan moeilijk zijn te vinden in het donker gekleurde muizen, en de ader heeft de neiging in te storten na een mislukte injectie. Voor de beeldvorming vasculatuur met groene emissie, gebruik dan een fluoresceïne-isothiocyanaat dextran. Voor rode emissie, gebruik maken van een Texas Red dextran. Met een hoog molecuulgewicht dextranen wordt de kleurstof in omloop enkele uren. Als alternatief kunnen dieren endogene fluorescerende labels direct afgebeeld op de juiste twee foton excitatiegolflengte. De dextran oplossing kan bevroren monsters voor toekomstig gebruik. </li><li> Voorzichtig het raam oppervlak schoon met een vochtige katoenen getipt applicator. </li><li> Bij langdurig beeldvorming van verdoofde preparaten, injecteren steriele Ringer&#39;s lactaat-oplossing intraperitoneaal op een volume van 3 il per gram om de 2 uur aan het lichaam van vocht en energie-eisen te handhaven. &lt;/ Li&gt; <li> Bij beeldvorming dieren in de wakkere staat, te beperken hoofdsteun naar een paar uur op een tijd om stress te verminderen. Breng het dier naar de kooi tussen de beeldvorming sessies voor voedsel en water. </li></ol> 6. Representatieve resultaten Een succesvolle venster kunt beeldvorming tot een diepte van 250 pm onder de pial oppervlak voor een aantal maanden. Deze methode is gebruikt om in vivo capillaire bloedstroom 4, 8, microglia activatie 8, 9, en dendritische structuur te onderzoeken binnen het corticale parenchym 8. In een voorbeeld maken we gebruik van twee-foton beeldvorming van de corticale vaatstelsel van een verdoofde Thy1-geel fluorescerend eiwit (YFP) muis laten zien, na het bloedserum wordt aangeduid door middel van intraveneuze injectie van Texas Red dextran (Fig. 2A). Dural schepen zijn vaak zichtbaar iets boven de corticale oppervlak in de dura mater (fig. 2C, pijl). Grote pial arteriolen en venulen lie de corticale oppervlak (fig. 2D). Indringende schepen tak van dit oppervlak netwerk en duik in de cortex, waar ze vertakken tot een dichte capillaire bed dat de corticale weefsel voedt (fig. 2E tot 2H). Dendritische cilinders van diepe YFP uiten corticale neuronen, een signaal endogene om deze muis te lijn, gelijktijdig kunnen worden afgebeeld in een tweede kanaal 10 (Fig. 2B tot 2H). De tweede harmonische signaal van het bot werd verzameld in een derde kanaal, en kan worden gebruikt om de dikte van de verdunde schedel na verzameling beeld stapels (Fig. 2A 2C) te meten. Corticale vasculaire dynamiek hoge mate beïnvloed door anesthetica 11. In een tweede voorbeeld, tonen we een video van spontane vasoactivity verzameld door twee-foton microscopie van een gewende wakker muis. Prominente vasomotorische oscillaties in het lumen diameter worden gezien met een pial arteriole, maar niet met een naburig venule. Dezebasale reeks vasoactivity vermindert met urethaan anesthesie 4. Om spontane en opgewekte veranderingen in de bloedstroom te kwantificeren maken we gebruik van aangepaste lijn scanning technieken om zowel de vasculaire diameter en rode bloedcellen snelheid van individuele vaartuigen vast te leggen. Gedetailleerde middelen op kwantitatieve bloedstroom beeldvorming met behulp van twee-foton microscopie zijn 3, 12. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3742/3742fig1.jpg" /> Figuur 1. Procedure voor een ports venster. (A K) afbeeldingen van opeenvolgende stappen van de procedure voor het genereren een ports venster. Zie de tekst voor gedetailleerde instructies. β = bregma en λ = lambda. (L) Bout en moer systeem voor het vastzetten van het hoofd tijdens beeldvorming van verdoofd preparaten. (M) op maat bewerkt dwarsbalk hoofd houder voor wakker preparaten. In dit voorbeeld werd een connector ook geïmplanteerd herhaalde electrocorticogram opnamen. (N)Schematische weergave van dorsaal aanzicht van de kop berg en de positie van verschillende onderdelen. De moer wordt gebruikt in het paneel L is bedoeld als alternatief voor de dwarsbalk met behulp van in het paneel M. Two # 000 zelftappende schroeven worden toegevoegd met het kruis bar houder voor extra stabiliteit met wakker beeldvorming voorbereidingen. (O) Schematische weergave dwarsdoorsnede van een ports venster. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3742/3742fig2.jpg" /> Figuur 2. Twee-foton beeldvorming van bloedvaten en neuronale structuur in de muis cortex. Alle beelden werden verzameld door middel van een ports venster in een Thy1-YFP muis op 2 dagen na implantatie venster 10. Maximale projectie 150 pm van weefsel in het frontale oriëntatie met de verdunde schedel ten opzichte van de vasculatuur (A) en dendrieten (B). Het bot (blauw) werd gedetecteerd door het verzamelen van de tweede harmonische fluorescentie bij 450 nm emissie met 900 nm excitatie <sup&gt; 8. De vasculatuur (rood) is gelabeld door intraveneus geïnjecteerd 70 kDa Texas Red dextran 6. De dendritische velden van de neuronen (groen) zijn endogene aan de Thy1-YFP transgene muizen lijn. (CH) maximale projecties meer dan 50 micrometer van weefsel in de horizontale richting op verschillende dieptes onder de pia. Data is van dezelfde afbeelding stapel getoond in panelen A en B. Dural vaartuigen mogen zichtbaar zijn net boven het corticale oppervlak (pijl in C). Afkortingen ACSF = kunstmatige cerebrospinale vloeistof Poorten = gepolijst en versterkte uitgedund schedel venster YFP = geel fluorescerend eiwit i Zorg ervoor dat de beschreven procedures worden door de lokale Institutional Animal Care en gebruik Comite.

<ol><li>Cetin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nature Protocols. 1, 3166-3173 (2006).</li>
<li>Kleinfeld, D., Delaney, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributed+representation+of+vibrissa+movement+in+the+upper+layers+of+somatosensory+cortex+revealed+with+voltage+sensitive+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Distributed representation of vibrissa movement in the upper layers of somatosensory cortex revealed with voltage sensitive dyes.</a> Journal of Comparative Neurology. 375, 89-108 (1996).</li>
<li>Driscoll, J. D. Quantitative two-photon imaging of blood flow in cortex. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDriscoll%2C+JD+%22Imaging+in+Neuroscience+and+Development%22">Imaging in Neuroscience and Development</a>. Yuste, R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 927-937 (2011).</li>
<li>Drew, P. J., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuating+and+sensory-induced+vasodynamics+in+rodent+cortex+extends+arteriole+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Fluctuating and sensory-induced vasodynamics in rodent cortex extends arteriole capacity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 108, 8473-8473 (2011).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+2-Photon+Imaging+of+Blood+Flow+in+the+Neocortex+through+a+Cranial+Window%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window.</a> J. Vis. Exp. (12), e678-e678 (2008).</li>
<li>Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+reversible+changes+in+dendritic+spine+structure+in+vivo+gated+by+the+degree+of+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rapid reversible changes in dendritic spine structure in vivo gated by the degree of ischemia.</a> Journal of Neuroscience. 25, 5333-5338 (2005).</li>
<li>Takano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-mediated+control+of+cerebral+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-mediated control of cerebral blood flow.</a> Nature Neuroscience. 9, 260-267 (2006).</li>
<li>Drew, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nature Methods. 7, 981-984 (2010).</li>
<li>Marker, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thin-skull+window+technique+for+chronic+two-photon+in+vivo+imaging+of+murine+microglia+in+models+of+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation.</a> Journal of Visualized Experiments. (43), e2059-e2059 (2010).</li>
<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Martin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+neural-hemodynamic+coupling+and+the+hemodynamic+response+function+in+the+awake+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Investigating neural-hemodynamic coupling and the hemodynamic response function in the awake rat.</a> Neuroimage. 32, 33-48 (2006).</li>
<li>Shih, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+as+a+tool+to+study+blood+flow+and+neurovascular+coupling+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Kobat, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+multiphoton+microscopy+using+longer+wavelength+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation.</a> Optics Express. 17, 13354-13364 (2009).</li>
<li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature Protocols. 4, 1128-1144 (2009).</li>
<li>Xu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nature Neuroscience. 10, 549-551 (2007).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308, 1314-1318 (2005).</li>
<li>Davalos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nature Neuroscience. 8, 752-758 (2005).</li>
<li>Ascenzi, A., Fabry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+for+dissection+and+measurement+of+refractive+index+of+osteons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biophysical+and+Biochemical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Technique for dissection and measurement of refractive index of osteons.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 6, 139-142 (1959).</li>
<li>Stosiek, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).</li>
<li>Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+cortex+revealed+by+optical+imaging+of+intrinsic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals.</a> Nature. 324, 361-364 (1986).</li>
<li>Dunn, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+cerebral+blood+flow+using+laser+speckle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of cerebral blood flow using laser speckle.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21, 195-201 (2001).</li>
<li>Villringer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+perfusion+of+the+rat+brain+cortex%3A+An+in+vivo+confocal+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Capillary perfusion of the rat brain cortex: An in vivo confocal microscopy study.</a> Circulation Research. 75, 55-62 (1994).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248, 73-76 (1990).</li>
<li>Srinivasan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography+for+the+quantitative+study+of+cerebrovascular+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography for the quantitative study of cerebrovascular physiology.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 31, 1339-1345 (2011).</li>
<li>Hu, S., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+imaging+and+characterization+of+the+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic imaging and characterization of the microvasculature.</a> Journal of Biomedical Optics. 15, 011101-011101 (2010).</li>
<li>Flecknell, P. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlecknell%2C+PA+%22Laboratory+animal+anesthesia%22">Laboratory animal anesthesia</a>. , Academic Press. San Diego. (1987).</li>
</ol>

Niets bekend te maken.

Twee-foton imaging door een ports raam vereist transmissie via de verdunde bot en de duur, dat het laserlicht verzwakt en voegt optische aberraties op grotere diepte 8. Ondanks dit nadeel kan beeldvorming diepte van 250 pm onder het oppervlak pial worden bereikt met 900 nm excitatie. Grotere diepten beeldvorming kan in principe mogelijk meer excitatiegolflengten 13. Een groot voordeel van deze methode is de afwezigheid van corticale ontsteking die tijdelijk zou kunnen bestaan ​​in methoden met voll...

<table border="1"><tbody><tr><td> Agent </td><td> Route van levering </td><td> Dosis voor muis </td><td> Duur </td><td> Opmerkingen </td><td> Bron </td><td> Ref Ref </td></tr><tr><td> Pentobarbital (Nembutal) </td><td> IP </td><td> 90 mg / g </td><td> 15-60 min </td><td> Smalle veiligheidsmarge. Werk om de juiste dosering van de anesthesie langzaam. Supplement 10% van de inductie-dosis nodig is. </td><td> 036093; Butler Schein </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Ketamine (Ketaset) gemengd met xylazine (Anased) </td><td> IP </td><td> 60 pg / g (K) 10 pg / g (X) (mengsel in dezelfde injectiespuit) </td><td> 20-30 min </td><td> Xylazine wordt mede geïnjecteerd als een spierverslapper en pijnstiller. Toeslag alleen Ketamine op 50% van inductiedosis zoals vereist. </td><td> (K) 010177, (X) 033.198; Butler Schein </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Isofluraan (Isothesia) </td><td> Inademing </td><td> 4% betekenen alveolaire concentratie (MAC) voor de inleiding; 1-2% MAC voor onderhoud </td><td> 4-6 uur. </td><td> Geldt mengsel van 70% zuurstof en 30% lachgas. Langdurige anesthesie leidt tot langzamer herstel. </td><td> 029403; Butler Schein </td><td> 26 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Anesthetica aanbevolen om te overleven studies. <table border="1"><tbody><tr><td> ITEM </td><td> BEDRIJF </td><td><strong&gt; catalogus # / MODEL </td></tr><tr><td> Betadine </td><td> Butler Schein </td><td> 6906950 </td></tr><tr><td> Buprenorfine (Buprenex) </td><td> Butler Schein </td><td> 031919 </td></tr><tr><td> Fluoresceïne isothiocyanaat dextran, 2 MDa molecuulgewicht </td><td> Sigma </td><td> FD2000S </td></tr><tr><td> Isopropylalcohol </td><td> Visser </td><td> AC42383-0010 </td></tr><tr><td> Ringer-lactaat oplossing </td><td> Butler Schein </td><td> 009846; </td></tr><tr><td> Lidocaine oplossing, 2% (v / v) </td><td> Butler Schein </td><td> 002468 </td></tr><tr><td> Zoutoplossing </td><td> Butler Schein </td><td> 009861 </td></tr><tr><td> Chirurgische Milk </td><td> Butler Schein </td><td&gt; 014.325 </td></tr><tr><td> Texas Red dextran, 70 kDa moleculair gewicht </td><td> Invitrogen </td><td> D1864 </td></tr><tr><td> Maxizyme </td><td> Butler Schein </td><td> 035646 </td></tr><tr><td> DISPOSABLES </td></tr><tr><td> Carbide bramen, 1/2 mm formaat tip </td><td> Fine Science Tools </td><td> 19007-05 </td></tr><tr><td> Cottoned tip applicators </td><td> Fisher Scientific </td><td> 23-400-100 </td></tr><tr><td> Dekglas, nee. 0 dikte </td><td> Thomas Wetenschappelijk </td><td> 6661B40 </td></tr><tr><td> Cyanoacrylaatlijm </td><td> ND Industries </td><td> 31428 H04308 </td></tr><tr><td> Gas stofdoek </td><td> Newegg </td><td> N82E16848043429 </td></tr><tr><td> Grip cementpoeder </td><td> Dentsply </td><td> 675571 </td></tr><tr><td> Grip cement oplosmiddel </td><td> Dentsply </td><td> 675572 </td></tr><tr><td> Insuline spuit, 0,3 ml volume met 29,5 naald </td><td> Butler Schein </td><td> 018384 </td></tr><tr><td> Moer en bout aan het hoofd vast </td><td> Digikey </td><td> Nut, H723-ND, bout, R2-56X1/4-ND </td></tr><tr><td> Opthalmic zalf </td><td> Butler Schein </td><td> 039886 </td></tr><tr><td> Scalpelmesjes </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-460-448 </td></tr><tr><td> Schroeven, zelftappende # 000 </td><td> JI Morris Company </td><td> FF000CE125 </td></tr><tr><td> Silicone aquarium kit </td><td> Perfecto Manufacturing </td><td> 31001 </td></tr><tr><td> Tin oxide poeder </td><td> Mama&#39;s Mineralen </td><td> EQT-TINOX </td></tr><tr><td> UITRUSTING </td></tr><tr><td> Glas schrijver </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-675 </td></tr><tr><td> Het ontleden van microscoop </td><td> Carl Zeiss </td><td> OPMI-1 FC </td></tr><tr><td> Elektrisch aangedreven boor </td><td> Foredom of Osada </td><td> K.1020 (Foredom) of EXL-M40 (Osada) </td></tr><tr><td> Elektrisch scheerapparaat </td><td> Wahl </td><td> Series 8900 </td></tr><tr><td> Tang, Dumont nee. 55 </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11255-20 </td></tr><tr><td> Terugkoppeling gereguleerde warmte pad </td><td> FHC </td><td> 40-90-8 (rectaal thermistor, 40-90-5D-02; heet pad, 40-90-2-07) </td></tr><tr><td> Isofluraan vaporizer </td><td> Ohmeda </td><td> IsoTec4 </td></tr><tr><td> Pulsoximeter </td><td> Starr Life Sciences </td><td> MouseOx </td></tr><tr><td> Schroevendraaier, miniatuur </td><td> Garret Wade </td><td> 26B09.01 </td></tr><tr><td> Stereotaxisch frame </td><td> Kopf Instrumenten </td><td> Model 900 (met de muis anesthesie masker en niet-ruptuur oor bar) </td></tr><tr><td> Chirurgische schaar, stompe einde </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14078-10 </td></tr><tr><td> Ultrasone reiniger </td><td> Fisher Scientific </td><td> 15-335-30 </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Lijst van specifieke reagentia, disposables en apparatuur.

een gepolijste en gewapend verdund-schedel venster voor de lange termijn beeldvorming van de hersenen van muizen

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo beeldvorming van corticale functie vereist optische toegang tot de hersenen, zonder verstoring van de intracraniële omgeving. We presenteren een methode om een ​​gepolijste en versterkte verdund schedel (poorten) venster te vormen in de muis schedel die enkele millimeters in diameter overspant en is stabiel voor maanden. De schedel verdund 10 tot 15 urn dik een draagbare boor optische helderheid bereiken en vervolgens bedekt met cyanoacrylaatlijm en een dekglas: 1) voorzien stijfheid, 2) remmen been hergroei en 3) te verminderen lichtverstrooiing onregelmatigheden op het botoppervlak. Omdat de schedel niet wordt doorbroken, is een ontsteking die het proces wordt bestudeerd van invloed kunnen zijn sterk verminderd. Imaging tot een diepte van 250 pm onder de corticale oppervlak kan worden bereikt met behulp van twee-foton laser scanning microscopie. Dit venster is zeer geschikt voor cerebrale doorbloeding en cellulaire functie te bestuderen in zowel onder narcose en wakker preparaten. Het biedt verder de opprima gelegenheid om cel-activiteit met behulp van optogenetics te manipuleren of de bloedstroom in gericht schepen verstoren door bestraling van circulerende fotosensitizers.

We presenteren een methode om een ​​beeldvorming raam in de muis schedel die millimeter overspant en is stabiel gedurende maanden zonder ontsteking van de hersenen vormen. Deze methode is zeer geschikt voor longitudinale studies van de bloedstroom, cellulaire dynamiek en cel / vasculaire structuur met behulp van twee-foton microscopie.

Een gepolijste en gewapend verdund-schedel Venster voor de lange termijn beeldvorming van de hersenen van muizen

In vivo beeldvorming van de corticale functie vereist optische toegang tot de hersenen zonder verstoring van de intracraniale omgeving. Wij presenteren een methode om ...

Het algemene doel van deze procedure is het creëren van een stabiel, dun schedelvenster over de cortex van de muis om herhaalde beeldvorming mogelijk te maken zonder de intracraniële omgeving te verstoren. Dit wordt bereikt door eerst een hoofdhoudersysteem te bevestigen, waardoor de kop stabiel onder het beeldvormingsapparaat kan worden vastgezet. Vervolgens wordt de schedel voorzichtig dun gemaakt in een gebied over het dorsale oppervlak van de hersenen, waarna het oppervlak met fijn schuurmiddel wordt gepolijst.Dek het venster vervolgens af met een kleine hoeveelheid cyanoacrylaatlijm en een dekglas om het venster te verstevigen. De laatste stap is het voorbereiden van het dier voor beeldvorming met de tweefotonmicroscoop. In vivo wordt tweefotonmicroscopie uiteindelijk gebruikt om fijne structuren zoals arteriolen, haarvaten en neuronale dendrieten weer te geven, die gedurende weken tot een diepte van 250 micrometers in de cortex kunnen worden afgebeeld.Het belangrijkste voordeel van deze techniek voor het maken van een craniale window is dat de schedel boven de cortex ongemoeid blijft. Eerst maken we de schedel dunner om optische helderheid te verkrijgen, en vervolgens verstev

a-polished-reinforced-thinned-skull-window-for-long-term-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We beschrijven een methode voor het herhaaldelijk het visualiseren van muriene microglia en circulerende...

Een dunne-schedel Window Techniek voor chronische Twee-foton In vivo Imaging Murine Microglia in modellen van ontstekingsprocessen

In deze video en aanvullende materialen, tonen we een protocol voor...

Chronische Imaging van de muis visuele cortex met behulp van een verdunde-schedel Voorbereiding

Door het combineren van een gepolijste en versterkte dunne-schedel (poorten) craniale venster en glioblastoma (GBM) cel injectie, kunnen we zien glioom initiatie en groei van geïnjecteerd GBM cellen in de hersenen van een levende muis lengterichting.

Imaging glioom Initiatie<em&gt; In Vivo</em&gt; Door middel van een gepolijst en versterkte Thin-schedel Schedel Window

This video presents a surgical procedure to implant cranial window in a mouse model for stable optical access to different regions of the brain.

Implantation of Cranial Imaging Window in Mouse Model: A Surgical Procedure to Implant Glass-based Coverslip for Stable Optical Access to Regions of Murine Brain

Acuut hersenletsel is een ernstige verwonding die geen adequate behandeling tot op heden. Multifoton microscopie maakt het bestuderen van lengterichting van het proces van acuut hersenletsel ontwikkeling en indringende therapeutische strategieën bij knaagdieren. Twee modellen van acuut hersentrauma bestudeerd met in vivo twee-foton beeldvorming van de hersenen worden gedemonstreerd in dit protocol.

Acute Brain Trauma in Muizen gevolgd door Longitudinale Twee-foton Imaging

Dit manuscript beschrijft een procedure om de herinrichting van de cerebrovasculature volgen tijdens amyloïde plaque accumulatie in vivo met behulp van longitudinale twee-foton microscopie. Een uitgedunde schedel bereiden voor de visualisatie van fluorescente kleurstoffen om de progressie van cerebrovasculaire schade te beoordelen in een muizenmodel van de ziekte van Alzheimer.

lengte-<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging van de Cerebrovasculature: Relevantie voor CNS ziekten

Dit protocol beschrijft een chronische craniale venster implantatie techniek die kan worden gebruikt voor longitudinale beeldvorming van neuro-glio-vasculaire structuren, interacties, en functie in zowel gezonde als zieke omstandigheden. Het dient als een aanvullend alternatief voor de transcraniële beeldvormingsbenadering die, hoewel vaak de voorkeur, een aantal kritische beperkingen bezit.

Nauwkeurige brain mapping om repetitieve in vivo beeldvorming van neuro-immuundynamica in muizen uit te voeren

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de implantatie van een chronisch schedelvenster voor de longitudinale beeldvorming van hersencellen in wakkere, hoofdbezorgde muizen.

Implantatie van een schedelvenster voor herhaalde in vivo beeldvorming bij wakkere muizen

Het huidige protocol beschrijft het maken van een groot (6 x 3 mm2) schedelvenster met behulp van voedselwikkel, transparante siliconen en afdekglas. Dit schedelvenster maakt in vivo wide-field en twee-foton calcium imaging experimenten in dezelfde muis mogelijk.

In vivo Wide-Field en Two-Photon Calcium Imaging van een muis met behulp van een groot craniaal venster

Intravitale microscopie om temporele en ruimtelijke hemodynamische en inflammatoire gebeurtenissen in de pial microcirculatie te volgen.

Intravitale Microscopie van de hersenen van muizen microcirculatie met behulp van een gesloten Cranial Window

Leer een gepolijste en versterkte dunne schedelvenstertechniek voor langetermijnbildvorming van de muizencortex. Deze methode maakt stabiele in vivo beeldvorming mogelijk zonder hersenontsteking.

Een gepolijste en gewapend verdund-schedel Venster voor de lange termijn beeldvorming van de hersenen van muizen

Meer video's verkennen