Name: Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) met behulp van Drosophila Weefsel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Leer chromatine immunoprecipitatie (ChIP) met Drosophila-weefsel voor het analyseren van chromatintoestanden in vivo. Deze methode maakt genoombrede profilering van eiwit-DNA-interacties mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen graag Dr Keji Zhao&#39;s lab (NIH / NHLBI) bedanken voor hun hulp bij het verstrekken van sequencing resultaten. Wij zouden ook graag de UCSC genome project bedanken voor het gebruik van Genome Browser om in kaart gebracht sequencing leest te visualiseren. Dit werk werd ondersteund door de R00HD055052 NIH Pathway to Independence Award en R01HD065816 van NICHD, de Lucile Parkard Foundation en de Johns Hopkins University start-up financiering voor XC

(De hele chip procedure duurt ongeveer twee dagen. Voorbereiding van ChIP bibliotheken voor high-throughput sequencing duurt nog eens 2-3 dagen.) 1. Ontleden en Bereid weefsel voor ChIP Experiment (~ 1 miljoen cellen) <ol><li> Ontleden weefsel van belang (bijvoorbeeld 200 paar van Drosophila testes) in koude PBS + 1x proteaseremmer (los 1 pellet van protease inhibitor cocktail in 1,5 ml 1x PBS om 7x voorraad oplossing te verkrijgen) + PMSF (uiteindelijke concentratie 100 ug / ml). Spoel tweemaal weefsel en hersuspenderen weefsel in 200 pi van dezelfde PBS oplossing met remmers. </li><li> Om het monster vast te stellen, toe te voegen 5,5 ul 37% formaldehyde (warm formaldehyde in 37 ° C waterbad gedurende 1 min voor het gebruik). Incuberen bij 37 ° C gedurende 15 minuten, elke 5 minuten vortex daartussen. </li><li> Plaats het monster op het ijs voor het weefsel om zich te vestigen voor 2 minuten. Spoel 2x met 450 ul PBS (met proteaseremmers en PMSF). Sample kan nu winkeld bij -20 ° C. Herhaal dissectie een paar keer om genoeg materiaal voor ChIP te verkrijgen. </li></ol> 2. Bereid Supernatant met eiwit-DNA Vervoeging voor Chip Assay <ol><li> Meng voldoende monster van stap 1.3 1,75 mL Eppendorf buis. </li><li> Verwijder de PBS uit weefselmonster. Voeg 200 ul lysisbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM CaCl2, 0,2% Triton X-100 of NP-40, 5 mM butyraat en 1x proteinase inhibitor cocktail). Voeg verse PMSF stockoplossing lysis buffer (PMSF eindconcentratie van 0,5 mM). Meng met blauwe homogenisator (Fisher Cat # 749521 tot +1.590) tot weefsels volledig distantiëren zonder aggregatie, incuberen bij RT (kamertemperatuur) gedurende 10 minuten. </li><li> Sonicatie: gebruik microtip ultrasoonapparaat (Misonix HS-XL200) aan de macht 20. Sonificeer 10 sec en rust op het ijs voor 50 sec. Herhaal 4-5 keer (optimale sonicatie tijd moet empirisch worden bepaald, zoals langere sonicatie zal opleveren kleinere fragmenten. Voor chip met behulp van antilichamen tegen histone wijzigingen, normaal gesproken hebben we ultrasone trillingen chromatine tot ongeveer 200-300 bp; voor transcriptie factor of chromatine toezichthouder (bijvoorbeeld de Polycomb-eiwitten), hebben we normaal gesproken ultrasone trillingen chromatine tot 200-1000 bp. Echter, de optimale fragmentgrootte empirisch worden getest. Let op: ALTIJD DE BUIS KEEP ON ICE, zelfs tijdens sonicatie OM monster te voorkomen opwarming van! </li><li> Verdun monster door toevoeging 1,8 ml RIPA buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,1% SDS, 0,1% Na-deoxycholaat, 1% Triton X-100 met proteaseremmers en PMSF bij dezelfde concentratie als beschreven eerder). Sla 40 pl als input controle door 2 pi 5M NaCl en incuberen bij 65 ° C geroerd (O / N) crosslink keren. </li><li> Om antilichaam geconjugeerd aan korrels, voeg 40 ul Proteïne A puimsteen 1,5 ml eppendorfbuisje en voeg 600 pi PBS en gesteente bij 4 ° C gedurende 2 minuten toepassing korrels magneet en verwijderen supernatant. Voeg 100 ul van PBS en het antilichaam van belang (hoeveelheid antilichaam moet worden bepaald empirmatisch). Incubeer bij kamertemperatuur 1 uur of 4 ° C gedurende 4 uur. </li><li> Verwijder supernatant van de kralen door de magneet en voeg 1 ml chromatine uittreksel uit stap 2.4 tot de kralen. Draai bij 4 ° CO / N. </li><li> Breng ChIP monster tot magneet en te verwijderen supernatant. Was de kralen met de volgende buffer bij 4 ° C gedurende 10 minuten: 2x met 1 ml RIPA buffer [1,89 mL &#39;RIPA buffer&#39; + 315 pl 7x proteaseremmers + 20 pL PMSF]; 2x met 1 ml RIPA buffer + 0,3 M NaCl [1,89 mL RIPA buffer + 220 uL 3 M NaCl]; 2x met 1 ml LiCl buffer (0,25 M LiCl, 0,5% NP40, 0,5% NaDOC); 1x met 1 ml 1 x TE + 0,2% Triton X-100; 1x met 1 ml 1x TE. </li><li> Om crosslink keren de korrels te resuspenderen in 100 ul TE buffer + 3 pi 10% SDS + 5 pi proteinase K (20 mg / ml). Incubeer bij 65 ° CO / N. </li><li> Breng kralen om magneet en over te dragen supernatant in een nieuwe buis. DE BOVENSTAANDE bevat uw DNA-monster. Was kralen met 100 pi TE + 0,5 MNaCl en combineren van de twee supernatant. </li><li> Fenol-chloroform halen het DNA-monster. Voeg 200 ul Fenol: Chlorofrom: IAA (25:24:1) mix en vortex. Spin op 14k gedurende 5 minuten bij RT. Als alternatief kan DNA worden gehaald met behulp van PCR Qiagen zuivering kit. </li><li> Breng de bovenstaande / waterlaag in een nieuwe buis en voeg lineaire acrylamide tot een eindconcentratie van 20 ng / ml (U 1 pi van glycogeen bij 20 mg / ml per 1 ml van de bovenstaande kunnen ook worden gebruikt. Glycogeen wordt gebruikt daaropvolgende qPCR of PCR analyse terwijl lineaire acrylamide gebruikt voor sequentie assays.) Voeg 20 ul van 3M NaOAc en 500 ul 100% EtOH. Meng goed en incubeer bij 80 ° C gedurende 10 minuten. Spin bij maximale snelheid gedurende 20 minuten bij 4 ° C. </li><li> Verwijder supernatant en was met 300 pl 70% EtOH. Drogen aan de lucht en resuspendeer monster in 50 ul TE-buffer. Voorbeeld nu worden opgeslagen bij -20 ° C. Monster kan worden gebruikt voor de kwantitatieve PCR (qPCR) assay (figuur 1). </li></ol> 3a. Analyseer ChIP-ed DNA met behulp van qPCR <ol><li> Verdun genomisch DNA in de volgende concentratie met een standaard curve maken: onverdunde, 1/10, 1/100, 1/1000, 1/5000. </li><li> Voor elke primerpaar, opgericht qPCR in twee exemplaren in een 96-wells plaat met genomisch DNA uit stap 3a.1, inputcontrole en Chip-ed DNA: 10 pi 2x SYBR PCR-mix (Fermentas, K0222); 1 pi 10 pM voorwaartse primer; 1 pi 10 pM reverse primer; x ul ChIP-ED-DNA (controle op, of genomisch DNA); y ul nuclease vrij H2O de reactie volume op 20 pL. </li><li> Spin down van de 96-wells plaat met Mini plaat Spinner (LABNET). </li><li> Voer qPCR met de ABI 7300 real-time PCR-systeem (of andere real-time PCR-systemen) met behulp van de volgende voorwaarde: Stap 1: 50 ° C gedurende 2 minuten, 1 cyclus; Fase 2: 95 ° C gedurende 10 min, 1 cyclus; Fase 3: 95 ° C gedurende 15 s 60 ° C gedurende 1 min., 40 cycles; Fase 4 (dissociatie fase): 95 ° C gedurende 15 s 60 ° C gedurende 1 minuut, 95 ° C gedurende 15 s. </li><li> Controleer de dissociatie curve: een piek bij de thermische dissociatie plot suggereert een amplicon van de PCR-reactie. Meer dan een piek geeft niet-specifieke product met primerpaar dient de qPCR zij niet worden gebruikt. </li><li> Bepaal de lineaire fase van exponentieel van PCR-reactie voor elke primer set door berekening van de formule DNA hoeveelheid opgelost volgens Ct (cyclus drempelwaarde) waarde, gebaseerd op de standaard curve met de reeks verdunde genomisch DNA in 3a. 1. </li><li> Als de Ct-waarde van CHIP-ED-DNA en input controle zijn binnen het lineaire gebied van de Ct-waarde, de berekening van de verrijking van CHIP-ed-DNA versus input, volgens de verdunningsfactor van CHIP-ED-DNA en input controle in 2.4. </li></ol> 3b. Amplify ChIP-ed DNA voor high throughput sequencing. <ol><li> End-reparatie van ChIP-ed DNA-mix (GebruikEpicentre DNA END-Repair kit), opgericht op het ijs: 1-34 ul genomisch DNA van stap 2,12 (0,1 tot 5 ug) 5 pi 10x End reparatie buffer 5 pi 2,5 mM dNTP mix 5 pi 10 mM ATP x il H 2 O om de reactie volume aan te passen tot 49 pl 1 pi einde Repair enzymmengsel (T4 DNA polymerase + T4 polynucleotidekinase) Incubeer 45 minuten bij kamertemperatuur. Zuiver reactie met gebruikmaking van Qiagen MinElute Reactie Cleanup kit. Elueren in 30 pi elutiebuffer (EB). </li><li> Voeg een-overhangende aan het 3 &#39;uiteinde: 30 pl geëlueerde DNA van stap 3B.1 5 pi 10x NEB buffer # 2 10 pi 1 mM dATP 2 pi dH 2 O 3 pi 5 U / pl Klenow fragment (3 &#39;→ 5&#39; exo-) Gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Zuiver reactie met gebruikmaking van MinElute ReactionCleanup kit. Elueren in 10 pi EB. </li><li> Solexa linker ligatie: 10 ul van geëlueerde DNA van stap 3B.2 10 pl DDH 2 O 2.5 &amp;mu; l 10x T4 DNA-ligase buffer 1 pi Adapter oligo mix van Illumina (1/10-diluted uit voorraad) 2,5 pi T4 DNA ligase (400 eenheden / pl) Incubeer gedurende 1 uur bij RT. Zuiver reactie met gebruikmaking van MinElute ReactionCleanup kit. Elueren in 20 pi EB. Voorbeeld nu worden opgeslagen bij -20 ° C. </li><li> Voer de geëlueerde DNA-monster uit stap 3B.3 het gebruik van de E-gel apparaat. Isoleren 300-500 bp band in de gel en zuiveren met de Qiagen gelextractiekit (deze stap maakt het ~ 125 bp zelf geligeerde linkers van de adapter oligo ligatie). Elueren in 12 pi EB. </li><li> Amplify bibliotheek met behulp van gepaarde-end (PE) primers van Illumina: 10,5 pi geëlueerde DNA van stap 3B.4 12,5 pl van master mix (2X Phusion HF, Finnzymes) 1 pi PE1 PCR primer 1 1 pi PE2 PCR primer 2 PCR staat: 98 ° C gedurende 30 sec (98 ° C 10 sec, 65 ° C 30 sec, 72 ° C 30 sec), 20 cycli herhaald 72 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Monsters van stap 3B.5 kan worden gebruikt voor ChIP-seq na het selecteren van de juiste maat DNA (300-500 bp) met de standaard 2% agarose gel. Voorbeeld nu worden opgeslagen bij -20 ° C. Het beste is om elke chip monster isoleren op een enkele gel om besmetting te voorkomen. Monsters kunnen worden ingediend voor high-throughput sequencing. </li></ol> 3c. Solexa pijplijn analyse <ol><li> De 25 bp sequentie leest werden verkregen uit de Illumina Genome Analyzer (GA) pijpleiding. </li><li> Alle maal gelezen werden afgestemd op de Drosophila genoom (dm3) met behulp van de eland (Efficient Local Alignment van Nucleotide Data)-software, waarmee maximaal twee mismatches met de referentie sequentie. </li><li> Uniek in kaart gebracht maal gelezen werden weerhouden voor downstream-analyse. Bij meerdere identieke gelezen, werden tot drie kopieën gehandhaafd om de mogelijkheid vertekening van PCR-amplificatie verminderen. </li><li> De output van de GA Pipeline werd omgezet naar de browser uitbreidbaar gegevens (BED) bestanden. </li><li> Voor het genereren vande pruik bestanden voor het uploaden naar de UCSC browser voor visualisatie, gebruikten we een python scrip die is in een eerdere publicatie 3 beschreven met 4 basispunten als grootte van het venster en 160 bp als het DNA-fragment grootte. </li><li> Om Drosophila genen in te delen in stil en expressie genen, hebben we gebruik gemaakt van een digitaal getal genoemd RPKM (leest / per kilobase samengevoegd exon regio / per miljoen in kaart gebrachte leest). Genen RPKM = 0 werden als stil groep genen RPKM ≥ 1 werden ingedeeld in de uitdrukking groepen die in drie groepen worden ingedeeld als genen lage, middelmatige en hoge expressie, en elke groep over hetzelfde aantal genen. </li><li> Om de histon-eiwitten niveau en de genexpressie vergelijken, gebruikten we een python script die is beschreven in een eerdere publicatie 3. </li></ol> 4. Representatieve resultaten Voorbeelden van ChIP-qPCR resultaten met behulp van bam (zak knikkers) mutant<html> testes worden getoond in Figuur 1 4. In bam testes, is er een storing in de overgang van proliferatieve spermatogonia te differentiëren spermatocyten 5, 6. We maken gebruik van bam testes als bron voor ongedifferentieerde kiemcellen, die zijn verrijkt met dit weefsel type. Differentiatie genen die nodig zijn voor sperma differentiatie, zoals man-specifieke transcriptie factor 87 (mst87F), Don Juan (dj) en fuzzy ui (FZO) worden niet uitgedrukt in bam testes. Deze genen zijn sterk verrijkt met de repressieve H3K27me3 histon-eiwitten 7 (Figuur 1A), maar zijn verstoken van de actieve H3K4me3 histon-eiwitten 8 (figuur 1B), een chromatine handtekening noemden we &#39;monovalent&#39; 7. Verrijking van een van beide H3K27me3 of H3K4me3 wordt bepaald door normalisatie tot een constitutief tot expressie Cycline A (CycA) gen 4. inhoud &quot;&gt; ChIP-seq analyse met behulp van dezelfde set van antilichamen (dwz repressieve H3K27me3 en actieve H3K4me3) met bam mutant testes (figuur 2) gevalideerd qPCR resultaten weergegeven in figuur 1. Voor de drie geteste terminale differentiatie genen mst87F, dj en FZO worden de genomische gebieden hoog verrijkt met H3K27me3 maar H3K4me3 (Figuur 2A-2C). daarentegen de constitutief tot expressie CycA gen aanmerkelijke H3K4me3 weinig H3K27me3 binding nabij de transcriptie start site (TSS) (Figuur 2D). Bovendien is de ChIP profielen van H3K27me3 en H3K4me3 de buurt van de TSSs van vier klassen van genen differentieel tot expressie komen overeen met de functie van elke histon-eiwitten. Zoals getoond in figuur 3A is verrijkt H3K27me3 stroomafwaarts van de TSSs omgekeerd evenredig met niveau van genexpressie. De stille genen hebben de hoogste H3K27me3 terwijl dehoog tot expressie genen hebben geen H3K27me3 bindend. Deze gegevens in overeenstemming met de repressieve van H3K27me3 op genexpressie. Daarentegen verrijking van H3K4me3 rond de TSSs heeft de tegenovergestelde verband met gen expressie (figuur 3B), consistent met de actieve rol H3K4me3 op genexpressie. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3745/3745fig1.jpg" /> Figuur 1. QPCR analyse van ChIP-ED-DNA met behulp van antilichamen tegen zowel de repressieve H3K27me3 histon-eiwitten (A) of actieve H3K4me3 histon-eiwitten (B) in niet-gedifferentieerde cel-verrijkte bam mutant testes. (A) in BAM testes, differentiatie genen (Mst87F, dj, FZO) zijn verrijkt met de H3K27me3 repressieve histon-eiwitten. (B) Differentiatie genen zijn uitgeput met H3K4me3 actieve markering. Het niveau van ChIP DNA (ChIP DNA / ingang) op de target-gen (Mst87F, dj of FZO) werd voor het eerst genormaliseerd naar de lev<html> el van CHIP DNA bij de controle CycA gen. Fout balken geven de standaardafwijking van drie onafhankelijke biologische repliceert. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3745/3745fig2.jpg" /> Figuur 2. UCSC genoom browser snapshots van H3K27me3 en H3K4me3 verrijking over de hele genomische regio&#39;s van (A) Mst87F (B) dj en (C) FZO, (D) CycA genen. De omcirkelde H3K27me3 verrijkte regio in (D) geeft de chromatine status van een overlappende gen CG7264, die laag uitgedrukt in bam testes (RPKM = 1), maar zeer uitgedrukt in wild-type testes (RPKM = 130) 8 (chip-seq gegevens 7). Probes in kwantitatieve PCR analyse van ChIP resultaten in Figuur 1 zijn voorzien onderaan elk veld. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3745/3745fig2large.jpg" target="_blank">klik hier grotere figuur zien</a> . tp_upload/3745/3745fig3.jpg &quot;/&gt; Figuur 3. ChIP-seq profielen met behulp van H3K27me3 en H3K4me3 in bam testes 7. De vier groepen genen (7509 genen) werden ingedeeld op basis van hun genexpressie niveaus op basis van RNA-seq resultaten 8. De vertegenwoordiger klassen van genen worden uitgezet voor de verrijking van een bepaalde histon-eiwitten, met behulp van sequenties van 3kb stroomopwaarts tot 3kb stroomafwaarts van de transcriptie start sites (TSSs). Dit genereert een profiel van verrijking van (A) H3K27me3 (K27) en (B) H3K4me3 (K4) chip-seq analyses in elke groep. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3745/3745fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken</a> .

<ol><li>Kharchenko, P. V., Alekseyenko, A. A., Schwartz, Y. B., Minoda, A., Riddle, N. C., Ernst, J., Sabo, P. J., Larschan, E., Gorchakov, A. A., Gu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+the+chromatin+landscape+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila melanogaster.</a> Nature. 471, 480-485 (2011).</li>
<li>Filion, G. J., van Bemmel, J. G., Braunschweig, U., Talhout, W., Kind, J., Ward, L. D., Brugman, W., de Castro, I. J., Kerkhoven, R. M., Bussemaker, H. J., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+protein+location+mapping+reveals+five+principal+chromatin+types+in+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells.</a> Cell. 143, 212-224 (2010).</li>
<li>Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T. Y., Schones, D. E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129, 823-837 (2007).</li>
<li>Chen, X., Lu, C., Prado, J. R., Eun, S. H., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+changes+at+differentiation+gene+promoters+as+they+become+active+in+a+stem+cell+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sequential changes at differentiation gene promoters as they become active in a stem cell lineage.</a> Development. 138, 2441-2450 (2011).</li>
<li>Gonczy, P., Matunis, E., DiNardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bag-of-marbles+and+benign+gonial+cell+neoplasm+act+in+the+germline+to+restrict+proliferation+during+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">bag-of-marbles and benign gonial cell neoplasm act in the germline to restrict proliferation during Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 124, 4361-4371 (1997).</li>
<li>McKearin, D. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bag-of-marbles%3A+a+Drosophila+gene+required+to+initiate+both+male+and+female+gametogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">bag-of-marbles: a Drosophila gene required to initiate both male and female gametogenesis.</a> Genes Dev. 4, 2242-2251 (1990).</li>
<li>Gan, Q., Schones, D. E., Eun, S. H., Wei, G., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monovalent+and+unpoised+status+of+most+genes+in+undifferentiated+cell-enriched+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Monovalent and unpoised status of most genes in undifferentiated cell-enriched Drosophila testis.</a> Genome Biol. 11, 42-42 (2010).</li>
<li>Gan, Q., Chepelev, I., Wei, G., Tarayrah, L., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+alternative+splicing+and+chromatin+structure+in+Drosophila+gonads+revealed+by+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of alternative splicing and chromatin structure in Drosophila gonads revealed by RNA-seq.</a> Cell Res. 7, 763-783 (2010).</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

De veelzijdigheid van ChIP analyses die in dit protocol kan worden gebruikt op verschillende weefsels, die een kans om de chromatine staat te studeren in een biologisch relevante systeem biedt. ChIP experimenten met gekweekte cellen systemen geschikt uitvoeren omdat grote hoeveelheden cellen kunnen gemakkelijk worden verkregen. Echter, gekweekte cellen niet noodzakelijk cellen in een meercellige omgeving. Door het ontwikkelen van deze techniek met behulp van ontleed weefsel van levende dieren, kunnen we in op vele vrage...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Compleet Mini proteaseremmer cocktail </td><td> Roche </td><td> 11836153001 </td><td></td></tr><tr><td> Formaldehyde (37%) </td><td> Supelco </td><td> 47083-U </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td> Sigma </td><td> 78830 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes pellet stamper </td><td> Fischer Scientific </td><td> K749521-1590 </td><td></td></tr><tr><td> PCR Purification Kit </td><td> Qiagen </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> Lineaire polyacrylamide </td><td> Sigma </td><td> 56575-1 ml </td><td></td></tr><tr><td> Glycogeen </td><td> Qiagen </td><td> 158930 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR groen / ROX qPCR Master Mix </td><td> Fermentas </td><td> K0223 </td><td></td></tr><tr><td> Mini plaat spinner </td><td> LABNET </td><td> Z723533 </td><td></td></tr><tr><td> Real-time PCR-systeem </td><td> Applied Biosystem </td><td> 4351101 </td><td></td></tr><tr><td> Kleine Volume Ultrasone Processor </td><td> Misonix </td><td> HS-Excel 2000 </td><td> Model gestaakt </td></tr><tr><td> Dynabeads, Proteïne A </td><td> Invitrogen </td><td> 100-01D </td><td></td></tr><tr><td> Dynamag magneet </td><td> Invitrogen </td><td> 123-21D </td><td></td></tr><tr><td> Fenol: Chlorofrom: IAA </td><td> Invitrogen </td><td> 15593-049 </td><td></td></tr><tr><td> Epicentre DNA END-Repair Kit </td><td> Epicentre Biotechnologie </td><td> ER0720 </td><td></td></tr><tr><td> MinElute Reaction Cleanup Kit </td><td> Qiagen </td><td> 28204 </td><td></td></tr><tr><td> Klenow fragment (3 &#39;→ 5&#39; exo-) </td><td> New England Biolabs </td><td> M0212S </td><td></td></tr><tr><td> T4 DNA ligase </td><td> Promega Corporation </td><td> M1794 </td><td></td></tr><tr><td> Adapter oligonucleotiden </td><td> Illumina </td><td> PE-400-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Gekoppelde-End Primer 1.0 en 2.0 </td><td> Illumina </td><td> 1001783 1001 784 </td><td></td></tr><tr><td> E-Gel Electorphoresis systeem </td><td> Invitrogen </td><td> G6512ST </td><td></td></tr><tr><td> 2X Phusion HF Mastermix </td><td> Finnzymes </td><td> F-531 </td><td></td></tr></tbody></table>

chromatine immunoprecipitatie (chip) met behulp van drosophila weefsel

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Epigenetica blijft een zich snel ontwikkelende veld dat bestudeert hoe de chromatine staat bijdraagt ​​aan de differentiële genexpressie in verschillende celtypen in verschillende ontwikkelingsstadia. Epigenetische regelgeving draagt ​​bij aan een breed spectrum van biologische processen, met inbegrip van cellulaire differentiatie tijdens de embryonale ontwikkeling en homeostase in de volwassenheid. Een kritische strategie in epigenetische studies is om te onderzoeken hoe verschillende histon modificaties en chromatine factoren genexpressie reguleren. Om dit aan te pakken, wordt chromatine immunoprecipitatie (ChIP) veel gebruikt om een ​​momentopname van de vereniging van specifieke factoren met DNA in de cellen van belang te verkrijgen. ChIP techniek maakt gebruik gewoonlijk gekweekte cellen als uitgangsmateriaal, dat kan worden verkregen in overvloed en homogeniteit reproduceerbaar te genereren. Er zijn echter verschillende nadelen: eerst het milieu cellen groeien in petrischaal verschilt van die in vivo, kan dusgeen afspiegeling van de endogene chromatine toestand van de cellen in een levend organisme. Ten tweede kunnen niet alle soorten van cellen gekweekt ex vivo. Er is slechts een beperkt aantal cellijnen, waarvan mensen genoeg materiaal ChIP assay verkrijgen. Hier beschrijven we een methode om ChIP experiment met behulp van Drosophila weefsels te doen. Het uitgangsmateriaal wordt ontleed weefsel van een levend dier kan dus nauwkeurig de endogene chromatine weerspiegelen. Het aanpassingsvermogen van deze methode met veel verschillende soorten weefsels kunnen de onderzoekers om veel meer biologisch relevante vragen met betrekking tot epigenetische regulatie in vivo 1, 2 aan te pakken. De combinatie van deze methode met high-throughput sequencing (ChIP-volgende) zal verder kunnen de onderzoekers om een ​​epigenomisch landschap te verkrijgen.

Onlangs high-throughput sequencing technologie is sterk toegenomen gevoeligheid van chromatine immunoprecipitatie (ChIP) experiment en gevraagd de toepassing ervan met behulp van gezuiverde cellen of weefsel ontleed. Hier hebben we een methode om af te bakenen ChIP techniek te gebruiken met<em&gt; Drosophila</em&gt; Weefsel waarin de endogene chromatine toestand in een goed gekarakteriseerd biologisch systeem te pakken.

Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) met behulp van Drosophila Weefsel

Epigenetica blijft een snel berkembang veld dat bestudeert hoe de chromatinestatus bijdraagt aan differentiële genexpressie in verschillende celtypen bij ...

Deze procedure genereert chromatin immunoprecipitatie-gegevens uit gedissecteerd vliegweefsel om de chromatinestatus in vivo in drosophila-weefsel nauwkeurig weer te geven. In dit geval worden honderden testes handmatig geoogst via dissectie. Chromatin immunoprecipitatie-assays worden uitgevoerd met gebruik van een antilichaam tegen het eiwit van belang.Voer een kwantitatieve R-T-P-C-R-analyse uit om de verrijking van de specifieke genomische regio in het gezuiverde chip-DNA vast te stellen. Als alternatief kan high-throughput sequencing van het chip-monster een genoombreed profiel genereren. Uiteindelijk biedt chip-analyse van gedissecteerd weefsel een representatie van de chromatine-toestand in cellen onder hun fysiologische omstandigheden.Dit protocol is geoptimaliseerd voor de analyse van weefsels die direct uit het organisme zijn geïsoleerd. Om chromatine-toestanden en epigenetische informatie onder reële fysiologische omstandigheden te verkrijgen, demonstreren we het gebruik van ChIP in drosophila om naar de crumpton-toestand te kijken. Dit protocol kan worden toegepast op andere organismen, zoals muis of zebravis.Een visuele demonstratie van dit protocol is essentieel om DNA

chromatin-immunoprecipitation-chip-using-drosophila-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De differentiatie van ESC samenvalt met cel-type specifieke veranderingen in de structuur en samenstelling van het chromatine. De detectie van deze veranderingen geeft waardevolle inzichten in de mechanismen die stemcellness en celdifferentiatie te definiëren. Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) vormt een waardevolle methode om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen stamcellen differentiatie ontleden.

Chromatine immunoprecipitatie van menselijke embryonale stamcellen

Deze video protocol illustreert de squash techniek die gebruikt wordt in de Johansen laboratorium voor te...

De voorbereiding van Drosophila polytheen Chromosoom Pompoenen voor antilichaam Labeling

Demonstreren we een chromatine immunoprecipitatie (ChIP) methode om factor interacties op weefsel-specifieke genen te identificeren tijdens of na het begin van weefsel-specifieke genexpressie in muis embryonale weefsel. Dit protocol moet worden breed toepasbaar voor de studie van weefsel-specifieke gen activatie als het zich voordoet tijdens de normale embryonale ontwikkeling.

Chromatine immunoprecipitatie assay for Tissue-specifieke genen met behulp van een vroeg stadium muizenembryo&#39;s

Chirp is een nieuwe en snelle techniek om genomische bindingsplaatsen van niet-coderende RNA's lang (lncRNAs) in kaart te brengen. De methode maakt gebruik van de specificiteit van anti-sense oligonucleotiden tegels aan de lijst van lncRNA-gebonden genomische locaties mogelijk te maken.

Chromatine Isolatie door RNA-zuivering (Chirp)

Drosophila weefsels bevatten vaak een heterogeen mengsel van celtypen. Om genexpressie in bepaalde celtypes van een bepaald weefsel te onderzoeken, kan kernen genetisch gemerkt en vervolgens geïsoleerd met behulp van een op affiniteit gebaseerde benadering. Geïsoleerde kernen kan worden gebruikt voor verdere toepassingen zoals genexpressie analyse en chromatine immunoprecipitatie.

-Affiniteit gebaseerde Isolatie van Tagged Kernen uit<em&gt; Drosophila</em&gt; Tissues voor de analyse van genexpressie

De vraag hoe chromatine toezichthouders en chromatine staten van invloed op het genoom in vivo is de sleutel tot ons begrip van hoe vroeg lot van de cel beslissingen worden genomen in het zich ontwikkelende embryo. ChIP-Seq-de meest populaire benadering van chromatine functies onderzoeken op mondiaal niveau wordt hier geschetst voor Xenopus embryo.

Genoom-brede Snapshot van chromatine regelgevers en staten in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryo&#39;s van Chip-Seq

Hier beschrijven we een chromatine immunoprecipitation (ChIP) en ChIP-seq de protocol van de voorbereiding van de bibliotheek voor het genereren van wereldwijde epigenomic profielen van lage-overvloed kip embryonale monsters.

Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) Protocol voor lage-overvloed embryonale monsters

Dit werk beschrijft een protocol voor het genereren van hoge resolutie in situ Hi-C bibliotheken van strak geënsceneerd pre gastrulatie Drosophila melanogaster embryo's.

Generatie van genoom-brede chromatine conformatie Capture bibliotheken uit strak geënsceneerde vroege Drosophila embryo 's

Deze methode is ontworpen om de vorming van PRC2-gemedieerde chromatine-domeinen in cellijnen te volgen, en de methode kan worden aangepast aan vele andere systemen.

Een methode om de Novo vorming van Chromatin domeinen te bestuderen

Dit protocol is bedoeld om heterochromatine aggregaten in Drosophila polytene cellen te visualiseren.

Immunofluorescente kleuring voor visualisatie van heterochromatine geassocieerde eiwitten in drosophila speekselklieren

Expansie-ondersteunde iteratieve fluorescentie in situ hybridisatie (EASI-FISH) is een robuuste techniek die expansiemicroscopie combineert met fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) om de expressie van meerdere genen in dik weefsel te detecteren. Dit protocol schetst recente vorderingen in de methode en de aanpassing ervan voor het labelen van het intacte Drosophila centrale zenuwstelsel..

Multiplex detectie van genexpressie in de intacte Drosophila hersenen met behulp van expansie-ondersteunde iteratieve fluorescentie in situ hybridisatie

Leer chromatine immunoprecipitatie (ChIP) met Drosophila-weefsel voor het analyseren van chromatintoestanden in vivo. Deze methode maakt genoombrede profilering van eiwit-DNA-interacties mogelijk.

Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) met behulp van Drosophila Weefsel

Meer video's verkennen