Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) met behulp van Drosophila Weefsel

Deze procedure genereert chromatin immunoprecipitatie-gegevens uit gedissecteerd vliegweefsel om de chromatinestatus in vivo in drosophila-weefsel nauwkeurig weer te geven. In dit geval worden honderden testes handmatig geoogst via dissectie. Chromatin immunoprecipitatie-assays worden uitgevoerd met gebruik van een antilichaam tegen het eiwit van belang.

Voer een kwantitatieve R-T-P-C-R-analyse uit om de verrijking van de specifieke genomische regio in het gezuiverde chip-DNA vast te stellen. Als alternatief kan high-throughput sequencing van het chip-monster een genoombreed profiel genereren. Uiteindelijk biedt chip-analyse van gedissecteerd weefsel een representatie van de chromatine-toestand in cellen onder hun fysiologische omstandigheden.

Dit protocol is geoptimaliseerd voor de analyse van weefsels die direct uit het organisme zijn geïsoleerd. Om chromatine-toestanden en epigenetische informatie onder reële fysiologische omstandigheden te verkrijgen, demonstreren we het gebruik van ChIP in drosophila om naar de crumpton-toestand te kijken. Dit protocol kan worden toegepast op andere organismen, zoals muis of zebravis.

Een visuele demonstratie van dit protocol is essentieel om DNA van onvoldoende kwaliteit, kwaliteit en hoeveelheden te verkrijgen om te gebruiken voor een chip of de generatie van sequencing-bibliotheken voor high-throughput sequencing. Dissecteer eerst het weefsel van belang, in dit geval ongeveer 200 paren drosophila-testes, in koude PBS met protease-remmer en 100 micrograms per milliliter PMSF. Nadat het weefsel twee keer is gespoeld, wordt het opnieuw gesuspendeerd in 200 microliters van dezelfde PBS-oplossing met remmers.

Fixeer het monster vervolgens met 5,5 µL voorverwarmd 37% formaldehyde. Incubeer 15 minuten bij 37 °C. Laat het weefsel op ijs bezinken, waarbij u elke vijf minuten vortexet.

Spoel twee keer met 450 µL PBS met remmers. Bewaar de monsters bij -20 °C. Combineer de 200 oph testes-monsters in een Eppendorf-buisje van 1,75 mL.

Zuig de buffer af en resuspendeer de monsters in 200 µL lysisbuffer. Dissocieer het weefsel volledig met een blauwe homogenisator, waarbij wordt gegarandeerd dat er geen aggregaten achterblijven; incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur.

Fragmenteer vervolgens het monster met een microchip-sonificator en laat het 50 seconden op ijs rusten. Herhaal dit vier tot vijf keer om de optimale fragmentgrootte voor het ChIP-doel te verkrijgen. Verdun vervolgens met 1,8 milliliters ripper-buffer voor een voorraad chromatine-extract. Voor een succesvolle ChIP-analyse is het essentieel om de grootte van de DNA-fragmenten empirisch te bepalen.

Voor het vervolg van het chip-experiment moet er gel-elektroforese worden uitgevoerd. Neem 50 µL van de input-controlesample. Voeg twee µL van vijf molar natriumchloride toe en incubeer dit gedurende de nacht bij 65 °C.

Om de cross-linking ongedaan te maken, gaat u verder met het conjugeren van het antilichaam aan de proteïne A-beads in een 1,5 milliliter Fendor-buis. Voeg 40 µL proteïne A-beads en 600 µL PBS toe en rol dit gedurende twee minuten bij 4 °C.

Breng vervolgens de beads aan op de magneet en verwijder het supernatant. Voeg nu 100 µL PBS en het gewenste antilichaam toe. Incubeer dit gedurende één uur bij kamertemperatuur.

Nadat de beads met een magneet zijn geoogst, wordt één milliliter weefselchromatine-extract toegevoegd. Laat dit gedurende de nacht roteren bij vier degrees celsius. Plaats vervolgens het chip-monster op een magneet en verwijder het supernatant.

Was de geoogste beads met millilitersen wasbuffer bij 4 °C gedurende 10 minuten per wasbeurt, en resuspendeer de beads vervolgens in 100 µL TEA-buffer. Om de cross-links van de eiwit-DNA-complexen ongedaan te maken, voegt u 3 µL 10% SDS en 5 µL Proteinase K (20 mg/mL) toe en incubeert u dit bij 65 °C gedurende de nacht.

Pellet de kraaltjes met een magneet. Draag het supernatant dat DNA bevat over naar een nieuwe buis. Was de kraaltjes één keer en voeg de supernatants die DNA bevatten samen.

Zuiver vervolgens het DNA met een fenol-chloroformextractie en breng de bovenste waterige fase over naar een nieuwe buis. Precipiteer het DNA met 20 µg/mL lineair acrylamide of glycogeen, 20 µL 3 M natriumacetaat en 500 µL 100% Ethanol.

Meng goed en incubeer bij -80 °C gedurende 10 minuten. Pelleteer het DNA door centrifugatie. Verwijder het supernatant en was het pellet eenmaal met 300 µL 70% ethanol na aan de lucht hebben gedroogd.

Resuspendeer de DNA-pellets in 50 µL TE-buffer. Bewaar de gefragmenteerde DNA-monsters bij -20 °C. Bereid een seriële verdunning van genomisch DNA voor de standaardcurve.

Stel in een 96-well plaat, met gebruik van templates van verdunde genomisch DNA input-controle of gechipt DNA, een qPCR-reactie van 20 µL in dubbeltoestelling op; centrifugeer de 96-well plaat in een mini-plaatcentrifuge. Analyseer de monsterplaat in een realtime PCR-systeem om de gegevens te valideren. Verifieer eerst de aanwezigheid van een enkele piek in het thermische dissociatieplot, wat duidt op een enkel amplicon uit de PCR.

Plot vervolgens de standaardcurve. Gebruik de gegevens van de reeks verdunde genomische DNA om de formule te berekenen die de DNA-hoeveelheid bepaalt op basis van de drempelcyclus (Ct). Bepaal daarnaast de lineaire fase van de exponentiële amplificatie van de PCR voor elke primerset.

Als de CT-waarde van het chip-DNA en de input-controlemonsters binnen het lineaire bereik van de CT-waarde liggen, wordt dan de verrijking van het chip-DNA ten opzichte van de input berekend. De verdunningsfactor voor end-reparaties is 0,1 tot 5 µg chip-DNA in reacties van 50 µL die T4 DNA-polymerase en T4 polynucleotidekinase bevatten. Incubeer gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur volgens de instructies van de fabrikant.

Zuiver vervolgens het DNA met een MinLu reaction cleanup kit. Voeg daarna overhangs toe aan het 3'-uiteinde met DNA polymerase, een groot CLA NOW-fragment en DATP, en incubeer dit gedurende 30 minuten bij 37 °C. Leid de reactie opnieuw door een spincolumn om het DNA te zuiveren en te concentreren.

Ga over tot ligatie met de adapter-oligo. Meng deze van Illumina met T four DNA Ligase en incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur. Leid het monster vervolgens door de MinLu reaction cleanup kit.

Elueer het DNA in 20 µL. Scheid vervolgens het DNA-monster via elektroforese met behulp van het elektroforeseapparaat. Isoleer de band van 200 tot 400 baseparen in de gel en zuiver deze met de KYOGEN gel-extractiekit.

Amplificeer nu een library met paired-end primers, fusion HF en pH enzymen van Illumina gedurende 20 PCR-cycli. Isoleer vervolgens DNA-fragmenten van 200 tot 400 baseparen op een standaard 2%AOSE-gel voor high-throughput sequencing in de software van Ellen. Aligneer alle reads met het drosophila-genoom, waarbij maximaal twee mismatches met de referentiesequentie zijn toegestaan.

Behoud uniek toegewezen reads voor verdere analyse in het geval van meerdere identieke reads. Behoud maximaal drie kopieën om de mogelijkheid van biases door PCR-amplificatie te verminderen. Gebruik vervolgens een Python-script om de output van de GA-pipeline om te zetten in browser-extensieve databestanden.

Stel een venstergrootte van vier baseparen en een DNA-fragmentgrootte van 160 baseparen in. Classificeer de drosophila-genen in stille en tot expressie gebrachte genen op basis van RPKM. Wijs genen met een RPKM gelijk aan nul aan als digitaal getal.

Classificeer genen met een RPKM groter dan één als een stille groep, en verdeel de overige genen in een tot expressie gekomen groep met drie subgroepen van lage, matige en hoge expressieniveaus. Vergelijk tot slot de histonmodificatie en de genexpressieniveaus met behulp van een Python-script dat eerder is beschreven in basal 2007, de bag of marbles. Mutante testes vertonen een defect in de overgang van proliferatieve spermatogonia naar differentiërende spermatocyten.

Dit chip QPCR-experiment maakt gebruik van BAM-testikels als bron voor ongedifferentieerde kiemcellen om de chromatinestatus te onderzoeken van sleutelgenen die vereist zijn voor spermadifferentiatie, specifiek de verrijking van histonmodificaties histone three lysine 27 methyl three of histone three lysine four methyl three. De verrijking van de differentiatiegenen wordt bepaald door normalisatie ten opzichte van een constitutief tot expressie gebracht gen, cycling a. De differentiatiegenen male specific transcription factor 87 Don Juan en fuzzy onion, die niet tot expressie komen in BAM-testikels, zijn sterk verrijkt met de repressieve histone three lysine 27 methyl three histonmodificatie.

Bovendien zijn ze verstoken van het actieve histon H3K4me3-modificatie. Een chromatinesignatuur die we monovalent noemen, in tegenstelling tot de valentie met zowel histon H3K4me3 als histon H3.

Lysine 27 trimethylering is verrijkt bij differentiatiegenen in embryonale stamcellen. ChIP-sequencedata met gebruik van dezelfde set antilichamen. Bevestig het ChIP-qPCR-resultaat getoond in figuur 1A: genomische regio's van alle drie de geteste terminale differentiatiegenen zijn sterk verrijkt met histon 3 lysine 27 trimethylering, maar niet met histon 3 lysine 4 trimethylering.

In tegenstelling hiermee vertoont het constitutief tot expressie gebrachte cyclin aging een hoog gehalte aan histon 3 lysine 4 trimethyl, maar een laag gehalte aan histon 3 lysine 27 trimethyl nabij de transcriptiestartplaats. Deze figuur toont ChIP-seq-gegevens van twee histonmodificaties nabij de transcriptiestartplaatsen van vier klassen differentieel tot expressie gebrachte genen. Histon 3 lysine 27 trimethyl is verrijkt stroomafwaarts van de transcriptiestartplaatsen, wat omgekeerd gecorreleerd is met het genexpressieniveau.

De stille genen vertonen het hoogste niveau van histon 3 lysine 27 trimethylering; sterk tot expressie gebrachte genen vertonen geen binding van histon 3 lysine 27 trimethylering, wat consistent is met de repressieve rol van histon 3 lysine 27 trimethylering op genexpressie. Omgekeerd vertoonde verrijking van de histon 3 lysine 4 trimethylering rond de transcriptiestartplaatsen de tegenovergestelde correlatie met het genexpressieniveau, wat consistent is met de actieve rol van histon 3 lysine 4 trimethylering op genexpressie.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in twee tot drie dagen correct worden uitgevoerd. Vergeet niet veiligheidsmaatregelen te nemen bij het gebruik van fenol, chloroform en formaldehyde. We hopen dat dit protocol u voldoende inzicht heeft gegeven in het gebruik van chromatine-immunoprecipitatie om het chromatinelandschap in in vivo weefsel te bestuderen.