Radioactieve In situ Hybridisatie voor het detecteren van Divers genexpressiepatronen in Tissue

Het algemene doel van het volgende experiment is om regio's van specifieke genexpressie te identificeren en de timing en niveaus van genexpressie te karakteriseren om bij te dragen aan het begrip van de genfunctie. Dit wordt bereikt door het weefsel dat in de procedure wordt gebruikt snel te oogsten en te prepareren om de integriteit van het weefsel te waarborgen. Als tweede stap wordt het weefsel behandeld om de achtergrondbinding van riboprobes te verminderen.

Vervolgens worden de ribo-probes gehybridiseerd met het weefsel en wordt de binding van de RIBA-probe gevisualiseerd. Door gebruik te maken van röntgenfilm of een lichtgevoelige emulsie worden resultaten verkregen die de locatie en het niveau van genexpressie tonen op basis van röntgenbeelden of donkerveld- en helderveldmicroscopie en -analyse. Bij het gebruik van Image J-software zijn er enkele kritieke stappen die nauwkeurig moeten worden uitgevoerd en waarbij veel mensen fouten maken, waaronder het voorkomen van achtergrondruis.

Er zijn een aantal stappen die kunnen leiden tot achtergrondruis, zoals een slechte saturatie of hybridisatie bij een onjuiste temperatuur. Een andere oorzaak is RNA-contaminatie, wat uw RNA-probe kan afbreken. Het is daarom essentieel om ervoor te zorgen dat alles vrij blijft van RNases.

Ten derde moet u er bij het dompelen van de coupes in de emulsie zeker van zijn dat er geen lichtlekken zijn in uw donkere kamer of dat de emulsie wordt blootgesteld aan licht tijdens alle fasen van dat proces, dat drie weken kan duren. Deze techniek zal worden gedemonstreerd door Hun Chen, een postdoc in mijn laboratorium. Nadat een vers brein is geoogst en is afgespoeld in 1× PBS, bed laar het brein in OCT tissue tech-medium door het brein onder te dompelen in een mal die het medium bevat bij kamertemperatuur.

Zorg ervoor dat de hersenen in de juiste positie zijn georiënteerd voor het coupesnijden. Spray vervolgens ethanol over het droogijs en vries het weefsel in door het blok in het mengsel van ethanol en droogijs te plaatsen. Snijd het bevroren weefsel met behulp van een cryostaat in coupes van 10 tot 12 micron dik, waarbij u erop let dat er geen ethanol in het blok terechtkomt, en monteer deze op super plus slides voor hersen- en embryo-weefsel.

De optimale snijtemperatuur ligt tussen -18 °C en -20 °C. Bewaar de coupes in een objectglaaskas bij -80 °C. Verplaats de objectglazen van de opslag bij -80 °C naar een metalen rek op droogijs.

Plaats vervolgens, terwijl u in een gecertificeerde zuurkast werkt, het rek in een oplossing van 4% paraformaldehyde die vooraf is opgewarmd tot drie tot vijf graden Celsius boven kamertemperatuur. Incubeer vijf minuten bij kamertemperatuur. Verwijder na incubatie het rek uit de paraformaldehyde en was de coupes door het rek 15 keer in PBS te dippen. Herhaal deze wasstap tweemaal, waarbij elke keer een verse PBS-oplossing wordt gebruikt.

Dompel de coupes vervolgens gedurende 10 minuten in vers bereide acetyleringsbuffer om aspecifieke binding van de RIBA-sonde te verminderen. Was de coupes daarna zoals voorheen, maar gebruik deze keer tweevoudig SSPE als wasoplossing. Dehydrateer het weefsel via een serie van 70, 95 en 100% ethanol gedurende twee minuten in elke oplossing.

Laat de objectglaasjes vervolgens gedurende ten minste 10 tot 15 minuten drogen in de zuurkast. Bereken na het synthetiseren van de RIBA-probe, volgens de instructies in het geschreven protocol, het benodigde volume aan RIBA-probe en hybridisatieoplossing voor alle objectglaasjes. Warm het hybridisatiemengsel voor de Ribo-probe vijf minuten voor op tot 65 °C.

Pipetteer 100 µL van de hybridisatieoplossing voor de Ribo-probe om de Ribo-probe te denatureren en verdeel dit over het dekglas. Gebruik vervolgens een tweede glazen dekglas om de oplossing gelijkmatig over het weefsel en het dekglas te verspreiden. Plaats de objectglas horizontaal en met de bovenzijde naar boven in een metalen rek. Zodra alle objectglazen klaar zijn, wordt het rek langzaam ondergedompeld in een oliebad van 65 °C gedurende minimaal vier uur en maximaal 16 uur.

De olie vormt een luchtdichte afsluiting rond de dekglasjes na de incubatie; verwijder alle overtollige olie van het metalen rek waarin de objectglazen zich bevinden. Plaats het rek vervolgens in een glazen of metalen bak met chloroform in een zuurkast. Herhaal de wasstap met een tweede bak met verse chloroform.

Doop vervolgens het rek in een oplossing van 0,1% betta me cap ethanol plus twee keer SSPE-oplossing om de dekglasjes los te maken en overtollige hybridisatieoplossing op te lossen. Breng de objectglazen daarna over naar een tweede oplossing van verse 0,1%betta me cap TER ethanol plus twee keer SSPE-oplossing. Plaats de onbedekte objectglazen in een nieuw rek in een tray met 0,1%beta macca TER ethanol in twee keer SSPE en laat dit één uur incuberen bij kamertemperatuur om overtollige ongebonden RNA-sondes te verwijderen.

Breng vervolgens het rek met coupes over naar voorverwarmde 2× SSPE plus 50% formamide-oplossing bij 65 °C, met beta-ME en ethanol tot een eindconcentratie van 0,1%, en incubeer gedurende één uur bij 65 °C. Gooi na de incubatie deze en alle voorgaande waterige wasoplossingen, alsook de dekglasjes, weg als radioactief afval. Was de coupes vervolgens tweemaal in voorverwarmde 0,1× SSPE bij 65 °C gedurende telkens 30 minuten.

Dehydrateer het weefsel vervolgens via een reeks van 70%, 95% en 100% ethanol gedurende twee minuten in elke oplossing. Droog de objectglazen tot slot gedurende ten minste 30 minuten in een zuurkast. Bepaal eerst of er een radioactief signaal in het weefsel aanwezig is.

Plaats de gedroogde objectglazen in een filmcassette in een donkere kamer onder gebruik van een veiligheidslamp en leg de röntgenfilm over de objectglazen. Zorg ervoor dat de objectglazen naar de emulsiezijde van de film zijn gericht en sluit vervolgens de cassette. Stel de objectglazen gedurende één tot zeven dagen bloot aan de film, afhankelijk van de verwachte abundantie van de transcripten.

Nadat de belichting is voltooid, wordt de röntgenfilm ontwikkeld in standaard ontwikkelaar en fixer. Het hybridisatiesignaal verschijnt als zwarte gebieden op de film, resulterend uit belichte zilverkorrels in de emulsie, om de cellulaire resolutie te bepalen en het signaal op het weefsel zelf te kunnen zien. De objectglazen worden gedoopt in fotografische emulsie en vervolgens tegengekleurd.

Indien de preparaten moeten worden tegengekleurd met kristalviolet, moeten de coupes worden gedeliquideerd volgens de instructies in het geschreven protocol. Giet op dit punt, terwijl u in de donkere kamer werkt, gedestilleerd water in een buis. Schep uc NTB-emulsie uit en verdun de emulsie met gedestilleerd water in een verhouding van één-op-één.

Nadat de emulsie gedurende 20 tot 30 minuten is gesmolten in een waterbad van 42 °C, wordt deze overgebracht naar een glazen dompelcontainer in een waterbad van 42 °C gedurende 20 tot 30 minuten. Het niveau van de verdunde emulsie moet nu alle secties op een objectglas bedekken wanneer het objectglas erin wordt gedompeld. Als er veel objectglazen zijn, kan extra emulsie nodig zijn.

Dompel de objectglazen nu in de verdunde emulsie in een waterbad van 42 °C en droog de gedompelde objectglazen vervolgens gedurende de nacht in een gesloten, lichtdichte container in de donkere kamer, of twee tot drie uur in een oven bij 37 °C met de lampen uit. Plaats de objectglazen na het drogen in een objectglasdoos. Dicht de randen af met zwart isolatietape en bedek deze vervolgens met aluminiumfolie.

Bewaar de doosjes bij vier graden Celsius gedurende enkele dagen tot weken; wanneer ze klaar zijn voor ontwikkeling, laat de coupes opwarmen tot kamertemperatuur. Verwijder vervolgens, terwijl u in de donkere kamer werkt, het rek met de coupes uit de doosjes en ontwikkel deze in de codec D 19 ontwikkelaar bij 16 graden Celsius gedurende drie tot vijf minuten. Was de ontwikkelde coupes vervolgens gedurende één minuut in kraanwater bij kamertemperatuur.

Incubeer de objectglazen vervolgens twee keer in fixeeroplossing bij 19 graden Celsius gedurende zes minuten per keer; tijdens de tweede fixatie mogen de kamerlampen worden ingeschakeld. Was de objectglazen nu gedurende ten minste 30 minuten onder stromend water bij kamertemperatuur. Schraap vervolgens met een scheermesje de emulsie van de achterkant van het objectglas terwijl deze nog nat is.

Tegenkleur ten slotte met 0,3% cresylviolet, en dehydrateer en monteer de coupes vervolgens indien nodig volgens de instructies in het schriftelijke protocol. Verwijder daarna eventueel overtollige emulsie op de achterzijde van de coupes door deze te bevochtigen met water en af te schrapen met een scheermesje. Spoel de coupes in een 80% ethanoloplossing en veeg ze één tot twee keer voorzichtig af om resten en stof te verwijderen.

Maak foto's onder donkerveld- of helderveldverlichting. De stappen voor het afschrapen en reinigen moeten mogelijk twee tot drie keer worden herhaald om goede beelden zonder stofdeeltjes te verkrijgen, die in donkerveld onder een dissectiemicroscoop gemakkelijk zichtbaar zijn. De volgende afbeeldingen zijn voorbeelden van autoradiografie van in situ hybridisatie vanaf röntgenfilms.

Deze röntgenfilmopname toont een sagittale doorsnede van de gehele kop van de zebravisvink op embryonale dag 10, die is gehybridiseerd met een antisense riboprobe tegen Fox P1. De zwarte belichte korrels op de film tonen de expressie van boodschapper-RNA; zoals binnen de vierhersenen te zien is, is Fox P1 boodschapper-RNA hier verrijkt in het mesopalium, het striatum en de dorsale thalamus. De röntgenfilmopname toont een doorsnede van dezelfde zebravisvink die is gehybridiseerd met de antisense riboprobe tegen Cuper.

TF twee Co.TF twee is verrijkt in het palam alium en meer ventraal in de thalamus. De volgende afbeeldingen zijn voorbeelden van autoradiografie van in situ hybridisatie van emulsiedip-preparaten. Deze donkerveldopname, gemaakt onder een dissectiemicroscoop, toont een sagittale doorsnede van de gehele kop van een zebravis op dag zes na het uitkomen, die is gehybridiseerd met een antisense RIBA-sonde voor Fox P een.

De witte blootgestelde zilerkorrels in de emulsie boven het weefsel tonen de expressie van messenger-RNA. De rode kleur stelt de kressel-violet kleuring voor. De schaalbalk representeert één millimeter.

Hier toont de afbeelding een sectie van dezelfde zebra-vink die is gehybridiseerd met een antisense riboprobe tegen TF2. De volgende afbeeldingen vergelijken antisense- en sense-labeling, wat verschillende patronen laat zien via autoradiografie op röntgenfilms van sagittale kopsecties van zebra-vinken op embryonale dag 12. De stippellijn geeft de contour van de gehele hersenen aan en de C markeert het cerebellum.

Er kan worden gezien dat de antisense-streng van PAC six tot expressie komt in de hersenen, in het bijzonder in de ventriculaire zone. Deze aangrenzende sectie, gehybridiseerd met de sense-streng van pack six, vertoont geen achtergrondexpressie in het gehele hoofd van het embryo, maar wel een duidelijke expressie in de pigmentlaag van het netvlies, net als bij de antisense-streng. De volgende afbeeldingen tonen in C twee signalen van genexpressie en met emulsie behandelde coupes van de hersenen van een goudgorsemmer tijdens late embryonale stadia, weergegeven in brightfield- en darkfield-weergaven.

Deze brightfield-opname toont de expressie van D one B op embryonale dag 10. Bij een normale belichting van de emulsie is het label, dat zwart verschijnt, bij deze vergroting nauwelijks zichtbaar. Deze opname toont een identieke sectie en vergroting als in de vorige afbeelding, maar is overgeschakeld naar het dark-field-zicht, waarbij de labeling in het striatum en de thalamus in het wit zichtbaar is.

Deze brightfield-afbeelding toont de expressie van slit3 op embryonale dag 12. Na overbelichting van de emulsie is de zwarte markering duidelijk zichtbaar. SC geeft de positie van het ruggenmerg aan en CB geeft de positie van het cerebellum aan.

Rostraal is naar links georiënteerd. De hier getoonde afbeelding is van dezelfde sectie en vergroting, maar is weergegeven in donkerveldweergave, waarbij de labelings in het ruggenmerg in wit zichtbaar zijn en overeenkomen met de lichtveldafbeelding. De volgende afbeeldingen tonen de zilverkorrelresolutie op cellulair niveau.

Hier wordt de labeling van Fox P1 messenger-RNA in de voorhersenen van de zebravisvink getoond; zilverkorrels verschijnen als zwarte stippen boven cellen die zijn gekleurd met kristalviolet. Deze afbeelding toont een hoge abundantie aan expressie over individuele cellen in het mesoalium van de volwassen zebravisvink. Deze afbeelding toont een lage abundantie aan expressie over individuele cellen in het aangrenzende alium van dezelfde sectie.

Hi Fox. P one messenger RNA-expressie in cellen wordt waargenomen in het mesoalium op embryonale dag 12.

De embryonale cellen die hier te zien zijn, zijn kleiner en dichter op elkaar gepakt in vergelijking met de volwassen cellen in de twee voorgaande afbeeldingen. Tot slot toont deze afbeelding een lage expressie over de cellen in het aangrenzende alium van dezelfde sectie. Na het volgen van deze procedure kunnen andere methoden, zoals immunochemie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals in welk celtype het doelgen wordt tot expressie gebracht.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de in situ hybridisatie uitvoert. Vergeet niet dat werken met radioactieve reagentia uiterst gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals persoonlijke beschermingsmiddelen, tijdens deze procedure altijd moeten worden getroffen.