Name: Radioactieve In situ Hybridisatie voor het detecteren van Divers genexpressiepatronen in Tissue (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 38 s
Description: Leer radioactieve in situ hybridisatie voor kwantitatieve detectie van mRNA-expressie in weefsels van gewervelden. Deze methode visualiseert ruimtelijke expressiepatronen met röntgenfilm en microscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen graag alle Jarvis lab leden die het protocol verbeterd door de jaren heen bedanken.

<ol><li>Clayton, D. F., Huecas, M. E., Sinclair-Thompson, E. Y., Nastiuk, K. L., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probes+for+rare+mRNAs+reveal+distributed+cell+subsets+in+canary+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Probes for rare mRNAs reveal distributed cell subsets in canary brain.</a> Neuron. 1, 249-261 (1988).</li>
<li>Wada, K., Sakaguchi, H., Jarvis, E. D., Hagiwara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+glutamate+receptors+in+avian+neural+pathways+for+learned+vocalization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of glutamate receptors in avian neural pathways for learned vocalization.</a> J. Comp. Neurol. 476, 44-64 (2004).</li>
<li>Haesler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP2+expression+in+avian+vocal+learners+and+non-learners%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners.</a> J. Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).</li>
<li>Jarvis, E. D., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor-driven+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Motor-driven gene expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 4097-4102 (1997).</li>
<li>Holzenberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+expression+of+insulin-like+growth+factor+II+in+the+songbird+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective expression of insulin-like growth factor II in the songbird brain.</a> J. Neurosci. 17, 6974-6987 (1997).</li>
<li>Mahmood, R., Mason, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-situ+hybridization+of+radioactive+riboprobes+to+RNA+in+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections.</a> Methods Mol. Biol. 461, 675-686 (2008).</li>
<li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).</li>
<li>Acloque, H., Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+analysis+of+chick+embryos+in+whole-mount+and+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization analysis of chick embryos in whole-mount and tissue sections.</a> Methods Cell Biol. 87, 169-185 (2008).</li>
<li>Moorman, A. F., Houweling, A. C., de Boer, P. A., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+nonradioactive+detection+of+mRNA+in+tissue+sections%3A+novel+application+of+the+whole-mount+in+situ+hybridization+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Sensitive nonradioactive detection of mRNA in tissue sections: novel application of the whole-mount in situ hybridization protocol.</a> J. Histochem. Cytochem. 49, 1-8 (2001).</li>
<li>Horita, H., Wada, K., Rivas, M. V., Hara, E., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dusp1+immediate+early+gene+is+regulated+by+natural+stimuli+predominantly+in+sensory+input+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">The dusp1 immediate early gene is regulated by natural stimuli predominantly in sensory input neurons.</a> J. Comp. Neurol. 518, 2873-2901 (2010).</li>
<li>Braissant, O., Wahli, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+in+situ+hybridization+protocol+using+non-radioactively+labelled+probes+to+detect+abundant+and+rare+mRNAs+on+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemica%22%5BJournal%5D)">A simplified in situ hybridization protocol using non-radioactively labelled probes to detect abundant and rare mRNAs on tissue sections.</a> Biochemica. 1, 10-16 (1998).</li>
<li>Kubikova, L., Wada, K., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+receptors+in+a+songbird+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Dopamine receptors in a songbird brain.</a> J. Comp. Neurol. 518, 741-769 (2010).</li>
<li>Wada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+neuroethological+approach+for+identifying+and+characterizing+a+cascade+of+behaviorally+regulated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A molecular neuroethological approach for identifying and characterizing a cascade of behaviorally regulated genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15212-15217 (2006).</li>
<li>Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+brains+and+a+new+understanding+of+vertebrate+brain+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution.</a> Nat. Rev. Neurosci. 6, 151-159 (2005).</li>
<li>Hoke, K. L., Ryan, M. J., Wilczynski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+cues+shift+functional+connectivity+in+the+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Social cues shift functional connectivity in the hypothalamus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 10712-10717 (2005).</li>
<li>Burmeister, S. S., Jarvis, E. D., Fernald, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+behavioral+and+genomic+responses+to+social+opportunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid behavioral and genomic responses to social opportunity.</a> PLoS. Biol. 3, e363(2005).</li>
<li>Jarvis, E. D., Schwabl, H., Ribeiro, S., Mello, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+gene+regulation+by+territorial+singing+behavior+in+freely+ranging+songbirds%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Brain gene regulation by territorial singing behavior in freely ranging songbirds.</a> Neuroreport. 8, 2073-2077 (1997).</li>
<li>Jarvis, E. D., Scharff, C., Grossman, M. R., Ramos, J. A., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((For+whom+the+bird+sings%3A+context-dependent+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">For whom the bird sings: context-dependent gene expression.</a> Neuron. 21, 775-788 (1998).</li>
<li>Feenders, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mapping+of+movement-associated+areas+in+the+avian+brain%3A+a+motor+theory+for+vocal+learning+origin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Molecular mapping of movement-associated areas in the avian brain: a motor theory for vocal learning origin.</a> PLoS One. 3, e1768(2008).</li>
<li>Chen, C. C., Fernald, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributions+of+two+gonadotropin-releasing+hormone+receptor+types+in+a+cichlid+fish+suggest+functional+specialization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Distributions of two gonadotropin-releasing hormone receptor types in a cichlid fish suggest functional specialization.</a> J. Comp. Neurol. 495, 314-323 (2006).</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

Radioactieve in situ hybridisatie van mRNA-expressie wordt veel gebruikt voor meerdere doeleinden, waaronder voor het bestuderen van regionale weefsel organisatie, celtypen, en de hersenen functionele activiteit 2-5,10,12-14. De later te gebruiken is op genen waarvan de mRNA expressie in de hersenen is afhankelijk van meer neurale activiteit, ook wel activiteit-afhankelijke genen of onmiddellijke vroege genen. Met deze toepassingen, is onze methode is toegepast op meerdere soorten, waaronder bij vogels, zoogdieren (bijvoorbeeld mens), vissen en amfibieën, in meerdere weefsels, zoals hersenen, huid en spieren en meerdere leeftijden, inclusief jongen / pasgeborenen, jongeren , volwassenen, en hier in zijn geheel embryo secties 2,3,5,15-17. De speciale kenmerken van ons protocol zijn onder andere: (1) Het produceert een evenwicht tussen anatomische specificiteit en kwantitatieve specificiteit. Om de expressie van genen te kwantificeren op de x-ray film, we digitale foto&#39;s van de beelden (. Ex: Fig 1A en 1B) te nemen, gebruik maken van de Photoshop (Adobe) histogram functie om de pixel dichtheid te meten in de regio&#39;s van belang en trek de achtergrondniveaus op de film buitenkant van het weefsel, maar nog steeds op de glasplaatje 2,4. Om uitdrukking te kwantificeren op cellulair niveau, nemen we beelden van zilverkorrels meer dan cellen onder een sterke vergroting (40-100X; Figuur 4). Daarna de drempel en meet functies beeld J gebruik door Wayne Rasband bij NIH het aantal zilverkorrels tellen in het beeld van aftrekken van de achtergrond aantal in een soortgelijk gebied zonder cellen op het glaasje, gedeeld door het aantal cellen, een waarde van expressie per cel. 4,18 (2) relatief hoge doorvoer zijn, zodat verwerking van 100-200 dia gelijktijdig door de nauwe dekglaasje afdichting die door de minerale oliebad te verkrijgen. Standaard in-situ hybridisatie methoden langer duren om de dia&#39;s met parafilm, nagellak en andere middelen, waar de dia&#39;s nemen veel ruimte af te dichten, (3) Het is zeergevoelig voor lage abundantie transcripten te wijten aan dextransulfaat en Denhardt&#39;s oplossing in de hybridisatiebuffer 2,13; (4) De imaging aanpak in donkerveld levert beelden met hoog contrast te wijten aan het nemen van foto&#39;s onder donkerveld belichting op een stereomicroscoop 4,5. Bovendien, Het maakt het mogelijk gevoelige detectie van kleine veranderingen in genexpressie, zoals de activiteit-afhankelijke genexpressie worden bepaald welke specifieke gebieden van de hersenen geactiveerd tijdens de perceptie en productie van specifiek gedrag 19. De beperkingen ten opzichte van niet-radioactieve protocollen dat deze duidelijker in de cellulaire resolutie en locatie van het mRNA in de cel en het werken met emulsie is zeer gevoelig voor manipulatie en licht. Het is mogelijk om onze methode combineren met andere methoden, zoals niet-radioactieve in situ hybridisatie mRNA expressie van meerdere genen in dezelfde weefsel 10,17,20 labelen. Het kan worden gecombineerd met immunocytochemiezowel RNA en eiwitexpressie label op hetzelfde monster om co-lokalisatie van de mRNA bepaalde celtypen 10. Het protocol aanpassingen noodzakelijk dat deze dubbele etikettering experimenten beschreven in de geciteerde referenties. In het kort, onze aanpak vergemakkelijkt inzicht in de timing en cellulaire locatie van genexpressie in om het begrijpen van regio organisatie, weefsel functionele activiteit, en de functie van een gen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Azijnzuuranhydride </td><td> VWR </td><td> MK242002 </td><td></td></tr><tr><td> Chloroform </td><td> VWR </td><td> BDH1109 </td><td></td></tr><tr><td> Cresyl violet-acetaat </td><td> Sigma </td><td> C5042 </td><td></td></tr><tr><td> Cryostaat </td><td> Thermo Scientific </td><td> Microm HM550 </td><td></td></tr><tr><td> Gedeïoniseerd formamide </td><td> Sigma </td><td> F9037 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> Promega </td><td> P1171 </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> ED </td><td></td></tr><tr><td> Inbedding van schimmel </td><td> VWR </td><td> 15160-215 </td><td></td></tr><tr><td> Fisher merk Superfrost plus glijbaan </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-034-979 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Formaldehyde </td><td> VWR </td><td> BDH0506-4LP </td><td></td></tr><tr><td> Formamide </td><td> Sigma </td><td> F7508 </td><td></td></tr><tr><td> Geneclean samenstel </td><td> Q-gen Bio </td><td> 1001-200 </td><td></td></tr><tr><td> Kodak Biomax MR film </td><td> Sigma </td><td> Z350370 </td><td></td></tr><tr><td> Kodak NTB Emulsie </td><td> Carestream Health </td><td> 8895666 </td><td></td></tr><tr><td> Kodak Professional Developer D19 </td><td> Kodak </td><td> 1462593 </td><td></td></tr><tr><td> Kodak Professional Fixer </td><td> Kodak </td><td> 1971746 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercapto </td><td> Calbiochem </td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td> Minerale olie </td><td> VWR </td><td> IC15169491 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> VWR </td><td> SX0600-1 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> Sigma </td><td> 76240 </td><td></td></tr><tr><td> Poly A </td><td> Invitrogen </td><td> POLYA.GF </td><td></td></tr><tr><td> rATP </td><td> Promega </td><td> P1132 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> rCTP </td><td> Promega </td><td> P1142 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> rGTP </td><td> Promega </td><td> P1152 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> RNAsin </td><td> Promega </td><td> N2111 </td><td> 40Units/μl </td></tr><tr><td> S 35 UTP </td><td> PerkinElmer </td><td> NEG039C001MC </td><td></td></tr><tr><td> Safety-Los oplossing </td><td> Veiligheid Los Research Products International </td><td> 111177 </td><td></td></tr><tr><td> Natrium Acetaat </td><td> Sigma </td><td> S7899 </td><td> 3M </td></tr><tr><td> Dibasisch </td><td> Sigma </td><td> S3264 </td><td></td></tr><tr><td> Monobasisch </td><td> Sigma </td><td> S3139 </td><td></td></tr><tr><td> SP6RNA polymerase </td><td> Promega </td><td> P1085 </td><td></td></tr><tr><td> Kleuring metalen rek </td><td> Elektronen Microscopie Wetenschappen </td><td> 70312-54 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNA-polymerase </td><td> Promega </td><td> P2075 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek oktober </td><td> Sakura </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> 5x Transcriptie buffer </td><td> Promega </td><td> P1181 </td><td></td></tr><tr><td> Triethanolamine </td><td> VWR </td><td> IC15216391 </td><td></td></tr><tr><td> Tris-HCl (1 M, pH 8,0) </td><td> VWR </td><td> 101449-446 </td><td></td></tr><tr><td> tRNA </td><td> Roche </td><td> 10109509001 </td><td></td></tr></tbody></table> Oplossingen: <ol><li> Reagentia voor het maken van riboprobes: 1,5 pl DNA-template (0,2-0,3 ng / ul), 2 pl 5x geoptimaliseerde transcriptie buffer, 1 pi van 100mm DTT (wordt geleverd met Polymerase van Promega, mixen bij kamertemperatuur), 0,3 ul van RNAsin (40 eenheden / pl), 1,5 pi AGC ribonucleotide mengsel oplossing, 3,5 pi S 35 UTP en 1 pi RNA polymerase. Breng tot 10 ßl met nuclease-vrij water. </li><li> AGC ribonucleotide mix oplossing: Meng gelijke hoeveelheden van 10 mM ATP, GTP en CTP samen. </li><li> Natriumacetaatoplossing voor EtOH neerslag vrij S 35 UTP verwijderen: 40 pi RNase en DNase vrij water, 5 ul 3M natriumacetaat en 125 ul 100% EtOH. </li><li> Hybridisatiebuffer (10 ml stock): 5 ml 100% gedeïoniseerd formamide, 600 pi van 5M NaCl, 1 M Tris-HCl (pH = 8,0), 240 pi 0,5 M EDTA (pH = 8,0), 100 ul van oplossingen 100x Denhart&#39;s 100 pi 1 M DTT, 250 ul van 20mg/ml tRNA, 125 pi van 20 mg / ml poly A en 1 g natrium Dextran sulfaat. Voeg DEPC-behandeld water om het totale volume te brengen 10 ml. Schudden en incuberen bij 55 ° C totdat alle natrium dextransulfaat opgelost. Bewaar de hybridisatie buffer-20 ° C, wat goed is voor ~ 6 maanden. </li><li> 4% paraformaldehyde gebufferde oplossing toevoegen 40 g paraformaldehyde in 760 ml gedestilleerd water in een kolf aangewezen paraformaldehyde, warmte tot 50 ° C op een kookplaat roeren. Voeg 320 ul van 10N NaOH om de paraformaldehyde te ontbinden. Na het oplossen van (~ 10 min), voeg 100 ml van 10x PBS, en breng het volume met gedestilleerd water tot 1 liter. Roer en verwarm de oplossing tot paraformaldehyd is opgelost. De pH moet 7.4. </li><li> Acetylering buffer: 13,6 ml triethanolamine plus 2,52 ml azijnzuuranhydride in 1 liter gedestilleerd water. </li><li> 20x SSPE oplossing: 3M NaCl, 200 mM NaH 2 PO 4-H 2 O, en 200 mM EDTA in gedestilleerd water. Stel oplossing tot pH 7,4 met NaOH 10N. </li><li> 10x PBS buffer: 80 g NaCl, 2,0 g KCl, 14.4g van Na 2 HPO 4 en 2,4 g van KH 2 PO 4 in gedestilleerd water. Stel oplossing tot pH 7,0 en brengen totale volume een liter. </li><li> Tweede wasoplossing: 0,1% β-mercaptoethanol en 50% formamide in 2x SSPE </li><li> Cresyl violet-oplossing: 3% cresyl violet-acetaat in leidingwater (gedestilleerd water voorkomt een goede kleuring), &#39;s nachts opgelost onder roeren in een kolf bij kamertemperatuur. Filter met vacuüm zuigen door middel van een 1 mm Whatman filtreerpapier en Buchner trechter. </li></ol>

radioactieve in situ hybridisatie voor het detecteren van divers genexpressiepatronen in tissue

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Kennis van de timing, niveau cellulaire lokalisatie en celtype dat een gen uitgedrukt in draagt ​​voor ons begrip van de werking van het gen. Elk van deze voorzieningen kan worden uitgevoerd met in situ hybridisatie aan mRNA in de cellen. Hier vormen een radioactieve in situ hybridisatie werkwijze gemodificeerd uit Clayton et al. (1988). Die een succesvol in ons laboratorium werken jaren, in het bijzonder voor volwassenen gewervelde hersenen 2-5. De lange complementaire RNA (cRNA) probes aan de doelsequentie zorgt voor detectie van lage abundantie heeft transcripties 6,7. Integratie van radioactieve nucleotiden in de cRNA probes kunnen verdere detectiegevoeligheid van geringe hoeveelheden transcripts en kwantitatieve analyse, door lichtgevoelige röntgenfilm of emulsie bekleed op het weefsel. Deze detectiemethoden een langdurige staat van expressie van het doelwitgen. Vergeleken met niet-radioactieve probe methODS zoals DIG etiketteren, is de radioactieve probe hybridisatie methode geen meerdere amplificatie stappen met HRP-antilichamen en / of TSA kit lage hoeveelheden transcripten detecteren. Daarom is deze werkwijze verschaft een lineaire relatie tussen signaal intensiteit en gerichte mRNA bedragen voor kwantitatieve analyse. Het maakt het mogelijk verwerken van 100 tot 200 dia&#39;s tegelijk. Het werkt goed voor de verschillende ontwikkelingsstadia van embryo&#39;s. De meeste ontwikkelings-studies van de genexpressie te gebruiken gehele embryo&#39;s en niet-radioactieve benaderingen 8,9, voor een deel omdat embryonaal weefsel is kwetsbaarder dan volwassen weefsel, met minder cohesie tussen de cellen, waardoor het moeilijk is om grenzen tussen celpopulaties met weefselcoupes te zien. Daarentegen onze radioactieve benadering door het grotere aantal gevoeligheid kan hoger contrast te verkrijgen oplossing van genexpressie tussen weefsel gebieden maakt het gemakkelijker om grenzen tussen populaties zien. Met deze methode kunnen onderzoekers onthullen demogelijke betekenis van een nieuw geïdentificeerd gen, en verder voorspellen de functie van het gen van belang.

Dit protocol wordt met succes gebruikt om kwantitatief te detecteren niveaus en ruimtelijke patronen van mRNA-expressie in verschillende weefsels vormen over gewervelde soorten. De methode kan detecteren lage abundantie transcripties en maakt het verwerken van honderden dia&#39;s tegelijk. We presenteren dit protocol met behulp van expressie profilering van aviaire embryonale hersenen formatie als voorbeeld.

Radioactieve In situ Hybridisatie voor het detecteren van Divers genexpressiepatronen in Tissue

Kennis van de timing, het niveau, de cellulaire lokalisatie en het celtype waarin een gen tot expressie komt, draagt bij aan ons begrip van de functie van dat gen. ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om regio's van specifieke genexpressie te identificeren en de timing en niveaus van genexpressie te karakteriseren om bij te dragen aan het begrip van genfuncties. Dit wordt bereikt door het weefsel dat in de procedure wordt gebruikt snel te oogsten en voor te bereiden om de integriteit van het weefsel te behouden. Als tweede stap wordt het weefsel behandeld om de achtergrondbinding van riboprobes te verminderen.Vervolgens worden de ribo-probes gehybridiseerd met het weefsel en wordt de binding van de RIBA-probe gevisualiseerd. Door gebruik te maken van röntgenfilm of een lichtgevoelige emulsie worden resultaten verkregen die de locatie en het niveau van genexpressie tonen op basis van röntgenbeelden of donkerveld- en helderveldmicroscopie en -analyse. Bij het gebruik van Image J-software zijn er enkele kritieke stappen die correct moeten worden uitgevoerd, waarbij vaak fouten worden gemaakt; één daarvan is het voorkomen van achtergrondruis.Er zijn verschillende stappen die kunnen leiden tot achtergrondruis, zoals een gebrekkige saturatie of hybridisatie bij een onjuiste temperatuur. Een andere oorzaak is RNA-contaminatie, waardoor uw RNA-sonde degradeert. U moet daarom zorgvuldig te werk gaan om alles RNA-vrij te houden.En ten derde moet u ervoor zorgen dat er bij het dompelen van de coupes in de emulsie geen lichtlekken zijn in uw donkere kamer of blootstelling van de emulsie gedurende alle fasen van dat proces, dat drie weken kan duren. Hun Chen, een postdoc in mijn laboratorium, zal deze techniek demonstreren. Nadat een vers brein is geoogst en is afgespoeld met 1x PBS, wordt het brein ingebed in OCT-weefselmedium door het brein bij kamertemperatuur onder te dompelen in een mal die het medium bevat.Zorg ervoor dat de hersenen zo zijn georiënteerd als nodig is voor het doorsnijden. Besproei vervolgens het droogijs met ethanol en vries het weefsel in door het blok in het mengsel van ethanol en droogijs te plaatsen. Snijd het ingevroren weefsel met een cryostaat in secties van 10 tot 12 micron dik, waarbij u er alert op let dat er geen ethanol in het blok terechtkomt, en monteer deze op super plus slides voor hersen- en embryonaal weefsel.De optimale snijtemperatuur ligt tussen de -18 °C en -20 °C. Bewaar de coupes in een objectglasdoos bij -80 °C. Verplaats de objectglazen van de opslag bij -80 °C naar een metalen rek op droogijs.Plaats vervolgens, terwijl u in een gecertificeerde zuurkast werkt, het rek in een oplossing van 4% paraformaldehyde die vooraf is verwarmd tot drie tot vijf graden Celsius boven kamertemperatuur. Incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Verwijder na de incubatie het rek uit de paraformaldehyde en was de coupes door het rek 15 keer in PBS te dippen. Herhaal deze wasstap tweemaal, waarbij elke keer een verse PBS-oplossing wordt gebruikt.Dompel de slides vervolgens gedurende 10 minuten in vers bereide acetyleringsbuffer om aspecifieke binding van de RIBA-probe te verminderen. Was de slides daarna zoals voorheen, maar gebruik ditmaal tweevoudig SSPE als wassolution. Dehydrateer het weefsel via een serie van 70, 95 en 100% ethanol gedurende twee minuten in elke oplossing.Droog de objectglazen vervolgens gedurende ten minste 10 tot 15 minuten in de zuurkast. Na het synthetiseren van de RIBA-sonde, volgens de instructies in het geschreven protocol, berekent u het benodigde volume RIBA-sonde en hybridisatieluiding voor alle objectglazen. Warm het hybridisatiemengsel voor de Ribo-sonde vijf minuten voor op 65 °C.Om de Ribo-probe te denatureren, pipetteert u 100 µL van de Ribo-probe hybridisatieloplossing en verdeelt u deze over het dekglas. Gebruik vervolgens een tweede glazen dekglas om de oplossing gelijkmatig over het weefsel en het dekglas te verspreiden. Plaats de slide horizontaal en met de bovenkant naar boven in een metalen rek; zodra alle slides gereed zijn, dompelt u het rek langzaam onder in een oliebad van 65 °C voor minimaal vier uur en maximaal 16 uur.De olie vormt een luchtdichte afsluiting rond de dekglasjes na de incubatie; verwijder alle overtollige olie van het metalen rek waarin de preparaten zitten. Plaats het rek vervolgens in een glazen of metalen bak met chloroform in een zuurkast. Herhaal de wasbeurt met een tweede bak met verse chloroform.Doop vervolgens het rek in een oplossing van 0,1% beta-mercaptoethanol plus twee keer SSPE om de dekglasjes los te maken en overtollige hybridisatielosung op te lossen. Breng de dia’s vervolgens over naar een tweede oplossing van verse 0,1% beta-mercaptoethanol plus twee keer SSPE. Plaats de dia's zonder dekglas in een nieuw rek in een tray met 0,1% beta-mercaptoethanol in twee keer SSPE en laat dit één uur incuberen bij kamertemperatuur om overtollige ongebonden RNA-probes te verwijderen.Breng het rek met coupes vervolgens over naar voorverwarmde 2× SSPE plus 50% vormaline-oplossing bij 65 °C, met β-ME en ethanol tot een eindconcentratie van 0,1%, en incubeer dit gedurende één uur bij 65 °C. Gooi na de incubatie deze en alle voorgaande waterige wasoplossingen, evenals de dekglasjes, weg als radioactief afval. Was de coupes daarna twee keer in voorverwarmde 0,1× SSPE bij 65 °C gedurende telkens 30 minuten.Dehydrateer vervolgens het weefsel via een serie van 70%, 95% en 100% ethanol gedurende twee minuten in elke oplossing. Droog de objectglaasjes tenslotte gedurende ten minste 30 minuten in een zuurkast. Eerst om te bepalen of er een radioactief signaal in het weefsel aanwezig is.Plaats de gedroogde coupes in een filmcassette; werk in een donkere kamer met een veiligheidslamp en plaats de röntgenfilm over de coupes. Zorg ervoor dat de coupes naar de emulsiezijde van de film zijn gericht en sluit vervolgens de cassette. Stel de coupes één tot zeven dagen lang bloot aan de film, afhankelijk van de verwachte abundantie van de transcripten.Nadat de belichting is voltooid, wordt de röntgenfilm ontwikkeld in standaard ontwikkelaar en fixer. Het hybridisatiesignaal verschijnt als zwarte gebieden op de film als gevolg van belichte zilverkorrels in de emulsie om de cellulaire resolutie te bepalen en het signaal op het weefsel zelf te kunnen zien. De preparaten worden gedoopt in fotografische emulsie en vervolgens tegengekleurd.Als de coupes tegengekleurd moeten worden met kristalviolet, dan moeten de secties worden gedeliquidiseerd volgens de instructies in het geschreven protocol. Giet op dit punt, terwijl u in de donkere kamer werkt, gedestilleerd water in een buisje. Schep een hoeveelheid NTB-emulsie uit en verdun de emulsie met gedestilleerd water in een verhouding van één-op-één.Nadat de emulsie gedurende 20 tot 30 minuten is gesmolten in een waterbad van 42 °C, wordt deze overgebracht naar een glazen dompelcontainer in een waterbad van 42 °C gedurende 20 tot 30 minuten. Het niveau van de verdunde emulsie moet nu alle secties op een objectglas bedekken wanneer het objectglas erin wordt gedompeld. Indien er veel objectglazen zijn, kan extra emulsie nodig zijn.Dompel de objectglazen nu in de verdunde emulsie in een waterbad van 42 °C, en droog de gedompelde objectglazen vervolgens gedurende de nacht in een gesloten, lichtdichte container in de donkere kamer of in een oven bij 37 °C gedurende twee tot drie uur met de lichten uit. Breng de objectglazen na het drogen over naar een objectglbaksje. Dicht de randen af met zwart isolatietape en bedek het geheel vervolgens met aluminiumfolie.Bewaar de doosjes gedurende enkele dagen tot weken bij vier graden Celsius; wanneer ze ontwikkeld moeten worden, laat de dia's opwarmen tot kamertemperatuur. Verwijder vervolgens, terwijl u in de donkere kamer werkt, het rek met de dia's uit de doosjes en ontwikkel deze in de codec D 19 ontwikkelaar bij 16 graden Celsius gedurende drie tot vijf minuten. Was daarna de ontwikkelde dia's gedurende één minuut in kraanwater bij kamertemperatuur.Incubeer de coupes vervolgens twee keer in de fixeeroplossing bij 19 °C gedurende zes minuten per keer; tijdens de tweede fixatie mogen de kamerlampen worden ingeschakeld. Was de coupes nu in stromend water bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 minuten. Schraap vervolgens met een scheermesje de emulsie van de achterzijde van de coupe terwijl deze nog nat is.Tegenkleur ten slotte met 0,3% kristalviolet en dehydrateer vervolgens de preparaten en monteer deze indien nodig volgens de instructies in het geschreven protocol. Verwijder daarna eventuele overtollige emulsie op de achterzijde van de objectglazen door deze nat te maken met water en af te schrapen met een scheermesje. Spoel de objectglazen in een 80% ethanoloplossing en veeg ze één tot twee keer voorzichtig af om vuil en stof te verwijderen.Maak foto's onder donkerveld- of helderveldverlichting. De stappen voor het schrapen en reinigen moeten mogelijk twee tot drie keer worden herhaald om goede beelden zonder stofdeeltjes te verkrijgen, die onder een dissectiemicroscoop in donkerveld gemakkelijk zichtbaar zijn. De volgende afbeeldingen zijn voorbeelden van autoradiografie van in situ hybridisatie op röntgenfilms.Deze röntgenfilm toont een sagittale doorsnede van de gehele kop van een zebravisvink op embryonale dag 10, die is gehybridiseerd met een antisense riboprobe voor Fox P1. De zwarte belichte korrels op de film tonen de expressie van boodschapper-RNA; zoals binnen de vier hersenen te zien is, is Fox P1 boodschapper-RNA hier verrijkt in het mesopallium, striatum en de dorsale thalamus. De röntgenfilm toont een doorsnede van dezelfde zebravisvink die is gehybridiseerd met de antisense riboprobe voor Cupre.TF twee Co. TF twee is verrijkt in het gebied van het palam alium en meer ventrale thalamus. De volgende afbeeldingen zijn voorbeelden van autoradiografie van in situ hybridisatie vanuit emulsiedip-preparaten. Deze darkfield-afbeelding, gemaakt onder een dissectiemicroscoop, toont een sagittale doorsnede van de gehele kop van een zebravisch op dag zes na het uitkomen, die is gehybridiseerd met een antisense RIBA-probe voor Fox P one.De witte blootgelegde zilkerkorrels in de emulsie boven het weefsel tonen de expressie van messenger-RNA. De rode kleur representeert de kleuring met kresselviolet. De schaalbalk staat voor één millimeter.Hier toont de afbeelding een sectie van dezelfde zangvogel (zebra finch) die is gehybridiseerd met een antisense ribo-probe tegen coop TF two. De volgende afbeeldingen vergelijken antisense- en sense-labeling, wat verschillende patronen laat zien via autoradiografie op röntgenfilms van sagittale kopsecties van zebra finches op embryonale dag 12. De stippellijn geeft de contour van de gehele hersenen aan en de C markeert het cerebellum.Er is te zien dat de antisense-streng van PAC six tot expressie komt in de hersenen, in het bijzonder in de ventriculaire zone. Deze aangrenzende sectie, gehybridiseerd met de sense-streng van PAC six, vertoont geen achtergrondexpressie in de gehele kop van het embryo, maar wel een duidelijke expressie in de pigmentlaag van het netvlies, vergelijkbaar met de antisense-streng. De volgende afbeeldingen tonen in C twee signalen van genexpressie en emissiedip-preparaten van de hersenen van een goudgors tijdens late embryonale stadia, weergegeven in brightfield- en darkfield-weergaven.Deze brightfield-afbeelding toont de expressie van D one B op embryonale dag 10. Bij een normale belichting van de emulsie is het label, dat zwart verschijnt, bij deze vergroting nauwelijks zichtbaar. Deze afbeelding toont een identieke sectie en vergroting als in de vorige afbeelding, maar overgeschakeld naar dark field-weergave, waarbij de labeling in het striatum en thalamus in het wit wordt weergegeven.Deze bright-field afbeelding toont de expressie van slit3 op embryonale dag 12. Na overbelichting van de emulsie is de zwarte label duidelijk zichtbaar. SC markeert de positie van het ruggenmerg en CB markeert de positie van het cerebellum.Rostraal is naar links georiënteerd. Het hier getoonde beeld is een identiek coupesniveau bij dezelfde vergroting, maar weergegeven in donkerveldweergave, waarbij de labeling in het ruggenmerg in wit verschijnt en overeenkomt met het helderveldbeeld. De volgende afbeeldingen tonen de resolutie van de zilverkristallen op cellulair niveau.Hier wordt de labeling van Fox P1 messenger-RNA in de voorhersenen van de zebravisch getoond; zilverkristallen verschijnen als zwarte stippen boven cellen die zijn gekleurd met kristalviolet. Deze afbeelding toont een hoge expressie over individuele cellen in het mesoalium van de volwassen zebravisch. Deze afbeelding toont een lage expressie over individuele cellen in het aangrenzende alium van dezelfde sectie.Hi Fox. P1-messenger RNA-expressie in cellen wordt waargenomen in het meso-alium op embryonale dag 12.De embryonale cellen die hier te zien zijn, zijn kleiner en dichter op elkaar gepakt in vergelijking met de volwassen cellen in de voorgaande twee afbeeldingen. Tot slot laat deze afbeelding een lage expressie zien over cellen in het aangrenzende alium van dezelfde sectie. Na het volgen van deze procedure kunnen andere methoden, zoals immunochemie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals in welk celtype het doelgen tot expressie komt.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u de hybridisatie in het instituut uitvoert. Vergeet niet dat het werken met radioactieve reagentia uiterst gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals persoonlijke beschermingsmiddelen, tijdens deze procedure altijd moeten worden getroffen.

radioactive-situ-hybridization-for-detecting-diverse-gene-expression

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In situ hybridisatie voor de precieze lokalisatie van de transcripten in planten

This video describes a sequential hybridization strategy that involves hybridizing mRNA probes to specific target mRNA. Following probe hybridization, signal amplification is performed to enhance resolution via reduction of signal-to-noise ratio during RNA-CISH of histological samples.

Probe Hybridization and Signal Amplification in RNA In Situ Hybridization: A Technique for Detecting Specific RNA Sequences in Tissue Sections

This video presents the protocol for signal detection during RNA chromogenic in situ hybridization. This technique can be used to diagnose an active oncogenic infection visually in an intact tissue specimen.

RNA CISH Signal Detection: A Technique to Detect Chromogenic Signals During RNA In Situ Hybridization in Intact Tissue Specimens

Hier beschrijven we een geheel gemonteerde...

Hele Mount RNA TL<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s

Het lokaliseren van genexpressie naar specifieke celtypen kan een uitdaging zijn vanwege het ontbreken van specifieke antilichamen. Hier beschrijven we een protocol voor gelijktijdige driedubbele detectie van genexpressie door dubbele fluorescentie RNA in situ hybridisatie te combineren met immunokleuring.

De combinatie van Double Fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie met immunolabel voor detectie van de expressie van drie genen in de hersenen van muizen Secties

Het beschreven RNA in situ hybridisatie protocol staat toe de opsporing van RNA in hele Drosophila embryo's of ontleed weefsels. Met behulp van 96-wells microtiterplaat platen en tyramide signaal versterking, kunnen afschriften worden gedetecteerd op hoge resolutie, gevoeligheid en doorvoer, en tegen een relatief lage prijs.

Hoge resolutie fluorescentie In Situ hybridisatie in Drosophila embryo's en weefsels met behulp van Tyramide signaal versterking

Hier beschrijven we een in situ hybridisatie bepaling waarmee gevoelige en specifieke detectie van sequenties 50 nucleotiden met single-nucleotide resolutie op het niveau van eencellige zo kort. De assay, die kan worden uitgevoerd, handmatig of automatisch, kunt inschakelen visualisatie van splice varianten, korte reeksen en mutaties in het kader van het weefsel.

Visualiseren van genetische varianten, korte doelen en puntmutaties in het kader van de morfologische weefsel met een RNA In Situ hybridisatie Assay

Het protocol beschrijft een tandem-immunofluorescentiehybridisatietest met in formaline gefixeerd in paraffine ingebed weefsel om microRNA en gemultiplexte eiwitten tegelijkertijd te detecteren en te kwantificeren.

MicroRNA-amplificatie en -herkenning door middel van locked-nucleic-acid in situ hybridisatie als een nieuwe detectie- en kwantificeringsmethode

Deze procedure wordt beschreven hoe de primaire hematopoietische celculturen te zetten vanaf knaagdier beenmerg en wordt gevolgd door transfectie met de Gene Puiser MXCell elektroporatie systeem.

De vervaardiging van primaire hematopoietische cellen culturen uit Murine Bone Marrow voor Elektroporatie

Niet-radioactieve In situ Hybridisatie Protocol Toepasbaar voor Noorwegen Spruce en een bereik van plantensoorten

Leer radioactieve in situ hybridisatie voor kwantitatieve detectie van mRNA-expressie in weefsels van gewervelden. Deze methode visualiseert ruimtelijke expressiepatronen met röntgenfilm en microscopie.

Radioactieve In situ Hybridisatie voor het detecteren van Divers genexpressiepatronen in Tissue

Meer video's verkennen