Profilering Thiol Redox Proteome Met behulp van Isotope Tagging massaspectrometrie

Het algemene doel van dit experiment is om de effecten van pseudomona siro PV tomato op redoxgereguleerde eiwitten in tomatenplanten te observeren. Inoculeer eerst tomatenplanten met pseudomona siro PV PV tomato om pathogeeninfectie en eiwitrespons op te wekken. Vervolg met kleuring met DIAM benzine om veranderingen in reactieve zuurstofspecies te observeren.

Voer vervolgens cystein-TMT-labeling uit om redox-gereguleerde cysteïnen in eiwitten te onderzoeken. De verkregen resultaten kunnen veranderingen tussen behandelde en controlemonsters meten. Hallo, ik ben Chen van de afdeling biologie en de proteomics-faciliteit hier aan de University of Florida.

Het voordeel van onze CTMT-labeling ten opzichte van bestaande methoden, zoals isotoopgecoate vinnenlabels (ook bekend als ASCA), is de mogelijkheid tot multiplexing bij het op grote schaal analyseren van redox-responsieve eiwitten. Hoewel deze demonstratie inzicht zal geven in de redox-gereguleerde eiwitten van tomaten als reactie op een pathogene infectie, kan het experiment worden toegepast op andere systemen, zoals joof, muizen cu en andere planten en gecontroleerde stresscondities. We kwamen voor het eerst op het idee voor deze methode nadat we een sterke variatie tussen ICAD-experimenten waarnamen omdat er slechts twee labels beschikbaar zijn.

Een VIR-demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de labelings- en verrijkingsstappen moeilijk aan te leren zijn. Experimentele variaties tussen gelabelde monsters moeten worden geminimaliseerd en het verwijderen van regio's moet worden beperkt om een efficiënte labeling te garanderen. Laten we beginnen. Kweek twee verpotte tomatenkiemplanten van vergelijkbare grootte in potten met een diameter van vier inch voor de inoculumcultuur.

Een lawn van Pseudomonas syringae op een KBM-plaat. Schraap de bacteriën in 20 milliliter water en bereid een bacterie-inoculum van ongeveer 10⁶ colony forming units per milliliter. Dompel de vier weken oude planten gedurende 30 seconden in de bacteriële inoculatie-oplossing in één liter inoculatiebuffer.

Dek vervolgens onmiddellijk af met doorzichtige plastic zakken. Oogst na de gewenste inoculatietijd het volledig ontwikkelde blad, plaats de epidermale zijde naar boven in 1 mg/mL DAB-kleurstof en infiltreer vacuüm gedurende 15 minuten. Incubeer de bladeren vervolgens gedurende de nacht in het donker bij kamertemperatuur.

Kook nu de gekleurde bladeren 10 minuten lang in 95%ethanol en bewaar deze in 75%ethanol. Maal de geoogste bladeren met een vijzel tot een fijn poeder in vloeibare stikstof. Voer vervolgens fenolextracties uit zoals beschreven in de bijbehorende tekst.

Precipiteer vervolgens de met fenol geëxtraheerde eiwitten met vijf volumes koude 0,1 molaire ammoniumacetaat in 100% methanol. Oogst de eiwitten door centrifugatie en voer pellet-wassingen uit. Resuspendeer de monsters vervolgens in 1,5 milliliters koude 70% ethanol en breng deze over naar een microcentrifugebuis van twee milliliter.

Gooi na centrifugatie de ethanol-supernatant weg en droog het pellet kort in een speed vac. Los de monsters op in een denaturerende eiwitextractiebuffer; verzamel na centrifugatie om een pellet te vormen de supernatant en meet de eiwitconcentratie volgens de handleiding van de fabrikant. Begin voor elk van de zes massatags met 100 µg eiwitmonster in een gelijk volume vers bereide, 200 mM iodoacetamide-alkyleringsbuffer om de vrije thiolgroepen te blokkeren; incubeer gedurende een uur bij 37 °C. Voeg vervolgens, om de eiwitten te precipiteren, 1 mL koude, 80% acetone toe en bewaar dit gedurende de nacht bij -20 °C.

Pellet het eiwit door centrifugatie en voer drie wasbeurten uit met 80% acetone. Nadat de monsters aan de lucht zijn gedroogd op ijs, resuspendeert u het pellet in 50 µL lysisbuffer. Voeg vervolgens 0,5 µL 100 mM TCEP toe om de disulfidebindingen te reduceren en incubeer dit gedurende één uur bij kamertemperatuur.

Solubiliseer de tags door 20 µL acetonitril aan de reagensbuizen toe te voegen. Vortex en centrifugeer kort. Om overtollig TCEP te verwijderen, laadt u 50 µL monster op een MicroCon three KD-kolom. Voeg 50 µL lysisbuffer toe en centrifugeer 15 minuten bij 10.000 ×g en 4 °C.

Om het monster te verzamelen, verwijdert u de kolom, plaatst u deze omgekeerd in een schone buis en centrifugeert u deze. Controleer indien nodig de pH van het monster. Stel de pH bij naar een waarde tussen zeven en acht met één molair zoutzuur.

Voeg vijf µL van het TMT-reagens toe en laat de reactie twee uur incuberen bij kamertemperatuur, voeg de monsters samen en voeg een gelijk volume Laly-monsterbuffer toe, kook vijf minuten en scheid op een precast 12% polyacrylamidegel. Nadat de gel drie keer is gespoeld met gefilterd water, wordt deze een uur gekleurd met Coomassie blauw en overnight ontkleurd in water op basis van de proteïnebandconcentraties. Verdeel 12 fracties per gellane. Snijd elke fractie in stukjes van 1 mm en plaats deze in een 1,5 mL buisje.

Dompel de gelstukjes volledig onder in 0,1 M ammoniumbicarbonaat in 50% acetonitril. Bedek de stukjes vervolgens gedurende 15 minuten met 100% acetonitril. Verwijder de vloeistof en droog de stukjes met een speed vac.

Voeg vervolgens een gelijk volume tripsine-oplossing toe en plaats het op ijs om te rehydrateren. Incubeer daarna gedurende 12 tot 16 uur bij 37 °C voor tripsine-digestie. Verwijder vervolgens het vloeibare eiwitextract uit de geïncubeerde monsters.

Stop de reactie en verwijder alle resterende proteïnedigest door de gelstukjes te bedekken met 5% mierenzuur, 50% acetonitril. Schud de gelstukjes vervolgens gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Draag het supernatant over naar de buisjes met geëxtraheerd proteïnemonster na nog twee extracties.

Droog de monsters in 0,5 milliliter buisjes met een speed vac. Bereid een 50% slurry van anti-TMT-hars in TBS voor, met een concentratie die proportioneel is aan de intensiteit van de respectievelijke eiwitband. Was de hars drie keer met één kolomvolume 1x TBS en voeg vervolgens 200 microliters TBS toe aan elk monster.

Overbreng het vervolgens naar anti-TMT-hars en agiteer dit gedurende twee uur bij kamertemperatuur, gevolgd door overnight rocken bij vier graden Celsius. Laad elke sample op een kolom. Voer kolomwasbeurten uit van telkens 200 µL.

Elueer vervolgens elk monster drie keer met 200 µL 50% elutiebuffer en droog onder vacuüm. Suspendeer de monsters in 12 µL 3% acetonitril met 0,1% mierenzuur en injecteer vijf µL direct op een HPLC-kolom. Elueer peptiden met een gradiënt van toenemend acetonitril, zoals beschreven in de bijbehorende tekst.

Gebruik massaspectrometrie om peptiden te detecteren in een top-twee-bij-drie workflow. Begin met een enkele ms-stap. Verwerf vervolgens drie Ms.Ms-spectra met fragmentatie door higher energy C trapped dissociation, gevolgd door drie.

Ms.MS met botsing-geïnduceerde dissociatie voor proteïne-identificatie. Analyseer de massaspectrometriegegevens met een vertakte workflow. Implementeer een reporter-ijzerquantiseerder om de ratio te kwantificeren.

Verwerk daarnaast het MSM MS-spectrum via de spectrumselector-, spectrumnormalisatie- en spectrumgroeperingsknooppunten en query de gegevens tegen de SeaQuest-zoekmachine. Deze afbeelding toont voorbeelden van een gecontroleerd tomatenplantblad links en een met Pseudomonas geïnoculeerd blad rechts nadat de bladeren met DAB zijn gekleurd. Het DES-kleuringsproces maakt het mogelijk dat de histochemische kleuring tekenen van reactieve zuurstofverbindingen in het bladweefsel laat zien.

Zoals verwacht vertoont de controle geen significante kleuring, terwijl de bladeren die behandeld zijn met pseudomonas positief kleuren voor de productie van waterstofperoxide. Dit voorbeeld toont de output van proteoom-ontdekkingsgegevens, waarbij de piekareaal van een differentieel redox-gereguleerd eiwit voor elk monster absolute kwantificering mogelijk maakt. Het piekareaal tussen de controle- en de geïnoculeerde monsters geeft de relatieve hoeveelheden aan.

Hier is de redoxregulatie van een eiwit tussen een controle- en een geïnoculeerd monster vergelijkbaar. Pieken van gelijke intensiteit suggereren de aanwezigheid van disulfidebindingen die niet gereguleerd worden door een verandering in de behandeling. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze binnen één week correct worden uitgevoerd.

Denk eraan om de monsters koud te houden en de etiketten georganiseerd te houden. Neem daarnaast voorzorgsmaatregelen bij het gebruik van fenol, zoals het dragen van handschoenen en het werken in de zuurkast volgens deze procedure. Andere maatregelen, zoals specifieke massaspectrometrie-analyse van post-translationele modificaties, kunnen worden uitgevoerd om andere systeemmodificaties te bepalen, zoals onic acid en glutenyllering.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het uitvoeren van de DIB standing CTMD-activatie en de redox 16-kwalificatie.