Spatio-temporele Manipulatie van kleine GTPase activiteit bij subcellulaire niveau en op de tijdschaal van seconden in levende cellen

Deze video demonstreert een methode waarbij UV-licht wordt gebruikt om de activiteit van een eiwit aan het plasmamembraan te manipuleren. Hiervoor worden cellen gecot getransfecteerd met een aan het membraan verankerd FRB-eiwit en het geïnteresseerde FK BP-gefuseerde eiwit. Een foto-verkapt rapamycinederivaat wordt aan het medium toegevoegd.

Tijdens live celbeeldvorming wordt vervolgens UV-licht toegepast op een specifiek gebied van de cel. De verbinding tussen rapamycine en biotine wordt afgebroken waardoor chemische dimeriseerachterblijft en het vrijgekomen dimeriseermiddel verspreidt zich in de cellen en induceert dimerisatie tussen het FKBP-gelabelde eiwit van belang en het FRB dat aan het plasmamembraan verankerd is in het bestraalde gebied. Zonder UV-straling associëren FKBP en FRB niet, waardoor er geen effect optreedt.

Analyse van de gegevens onthult een sterk gelokaliseerde rekrutering van het geïnteresseerde FKBP-gefuseerde eiwit op basis van het fysiologische effect. Het voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals een farmacologische en genetische aanpak, is de combinatie van snelheid van actie, doelspecificiteit en ruimtelijke resolutie. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van kanker metastasen als gevolg van migratie door kankercellen.

Daarom kan manipulatie van de activiteit van belangrijke migratiefactoren het precieze moleculaire mechanisme onthullen, wat een voorwaarde is voor de behandeling en genezing ervan. De procedure zal worden gedemonstreerd door Chris Paul Meyer, een afgestudeerde student en Bob de Rose, een technicus uit mijn laboratorium. Begin dit protocol door de volgende ingrediënten te combineren in een steriele microcentrifugebuis: plasmide, DNA, membraan verankerd FRB FLUORESCEERTAGGEERIJK FKBP, TIA een en gedeïoniseerd water. Voeg een microliter van enkele gen HD toe aan het mengsel en vortex.

Incubeer de buis gedurende 20 minuten op kamertemperatuur. Voeg tijdens de incubatie 50 microliter poly de lycine toe aan elke put van een glazen achtputtenkamer en incubeer gedurende één minuut om het oppervlak te coaten, aspteer vervolgens de oplossing en was het midden van elke put met 50 gedeïoniseerd water. Vervolgens trypsineer 80 tot 85%confluente NIH drie T drie cellen.

Nadat de cellen loslaten, voeg 10 milliliter DMEM met 10%FBS toe, breng 375 microliter van de suspensie over naar een steriele 15 milliliter buis en centrifugeer gedurende drie minuten bij 1.500 G. Na het centrifugeren aspireer voorzichtig het medium. Voeg 750 microliter DMEM met 10%FVS en Resus toe.

Suspendeer het pellet door voorzichtig meerdere keren op en neer te pipetteren. Voeg vervolgens de celsuspensie toe aan de transfectieoplossing en roer voorzichtig met de pipettip, voeg 250 microliter van de celtransfectiesuspensie toe aan elke put van de kamer. Schuif en incubeer het.

37 graden Celsius gedurende 15 tot 18 uur. Om cage rapamycine te synthetiseren, biotin adduct. Begin met het bereiden van een 1 millimolair stockoplossing van CRB in DMSO in een steriele fugebuis. In een aparte 1,5 milliliter microcentrifugebuis lost u één milligram avadon op in 250 microliter PBS.

Vervolgens om de cagering te koppelen aan rapamycine. Voeg 0,5 microliter van de CRB stockoplossing toe aan opgelost AVID in en meng door om en om te keren en vervolgens gedurende 15 minuten op kamertemperatuur te incuberen. Om CRB AVID in conjugaat oplossing te verkrijgen, scheidt u ongebonden kleine moleculen en zuivert u CRBA door een G 25 grootte-exclusiekolom te gelijkmaken met 300 microliter PBS.

Herhaal vijf keer nadat de kolom is geëquilibreerd. Laad 125 microliter CRBA-oplossing op het middelste bed van de kolom. Draai vervolgens de oplossing gedurende twee minuten bij 800 G neer. Verzamel de doorstroming in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis bij kamertemperatuur na transfectie van de cellen.

Verwissel het medium naar DMEM zonder FBS om de cellen te serumstarven, incubeer gedurende 12 uur. Na de incubatie aspireer voorzichtig het medium en voeg 250 microliter van de bereide 1 micromolar CRBA-oplossing toe. Gebruik vervolgens een spinning disc confocale microscoop met UV-verlichting om optica te koppelen voor UV LED-licht bij 365 nanometer.

Met epifluorescentielicht. Definieer de coördinaten en grootte van een verlichtingsvlek door een glazen plaat te gebruiken die is bedekt met fluorescente kleurstoffen die worden aangestuurd door UV-licht. Dit maakt fijnafstemming van het te bestralen gebied mogelijk.

Plaats de kamerschijf met de cellen op de stage met behulp van een 100 x objectief en epifluorescentie. Breng de cellen scherp en zoek een cel. Voor beeldvorming begint u met het beeldvormen van de cellen nadat de achtergrondniveaus van het fysiologische effect zijn bepaald.

Hier wordt membraanruffling gemeten. Irradieer met UV-licht in een gekozen kwadrant van de cel, los ontkapte, dus originele rapamycine op in DMSO en vervolgens in PBS tot een eindconcentratie van 400 nanomolair. Voeg 100 microliter van de oplossing toe aan de beeldvormingskamer om globale effecten te induceren. Vang elke 15 seconden gedurende 20 minuten fluorescentiebeelden om te bepalen of lokale activering van RAC lokale ruwe vorming kan induceren.

NIH drie T drie cellen werden getransfecteerd met YFP-gelabelde RAC activator FK bp, TIA een en LDR, wat een membraan verankerd is. FRB gelokaliseerde bestraling aan de rand van de cel, aangegeven door de gele cirkel, werd gevolgd door globale belichting met een kwiklamp gedurende één seconde, beginnend bij 1063 seconden. Zoals hier te zien is, was er aan het begin bijna geen membraanruffling aanwezig.

Echter, na lokale belichting ruwe vorming ruwe vorming werd waargenomen na globale belichting en toevoeging van rapamycine, wat zorgt voor translocatie van FK bp TIA een naar het plasmamembraan. De cel vertoonde globale ruwe vorming, wat aangeeft dat de eerder waargenomen lokale ruwe vorming werd veroorza