Name: Spatio-temporele Manipulatie van kleine GTPase activiteit bij subcellulaire niveau en op de tijdschaal van seconden in levende cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Leer spatio-temporele manipulatie van kleine GTPase-activiteit op subcellulair niveau met UV-licht en foto-gekooide rapamycine. Deze methode maakt precieze controle van eiwitactiviteit in levende cellen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door NIH financiering van onderzoek (DK090868 en GM092930 aan TI). Er is een octrooi op een gekooide rapamycine analoog.

1. Transfectie van plasmide DNA <ol><li> Voeg plasmide DNA&#39;s, 0,5 ug membraan-tethered FRB (hierna LDR) en 0,5 ug FKBP-Tiam1 (T-cel lymfoom invasie en metastase-inducerende eiwit 1: Rac activator) getagd met fluorescerend eiwit tot 37,5 ui dH 2 O. Voeg 1 pi FuGENE HD. </li><li> Vortex en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Ondertussen gaat u verder met de stappen 1.3-1.8. </li><li> Was elk putje van een 8-well kamer met 50 pi poly-D-lysine. </li><li> Was het midden van elke goed met dH 2 O. </li><li> Trypsinize 80-85% confluent NIH-3T3 cellen en verdun tot 10 ml kweekmedium (DMEM met 10% FBS). </li><li> Verwijder 375 ul van de opschorting en centrifugeer bij 1750 omwentelingen per minuut gedurende 3 minuten. </li><li> Zuig de media, zorg dat u de pellet te verstoren. </li><li> Voeg 750 ul DMEM w / 10% FBS en resuspendeer. </li><li> Voeg celsuspensie aan dH 2 O / DNA / FuGENE HD-oplossing toe en meng voorzichtig. </li><li> Voeg 250pi cellen / DNA suspensie aan elk putje (vult zich 3 putten). </li><li> Incubeer de getransfecteerde cellen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 15-18 uur. </li></ol> 2. Voorbereiding van de CRB-Een oplossing <ol><li> Synthetiseren gekooide rapamycine-biotine adduct (CRB). Zie &quot;Synthetische schema van crb&quot; voor details. In het kort worden kooien en biotine groepen afzonderlijk bereid. De kooien groep is dan geconjugeerd aan rapamycine (LC lab), het product vervolgens gekoppeld aan de biotine vrijmaken door middel van klik reactie 7 tot en met crb veroorloven. </li><li> Bereid een 1 uM stockoplossing van crb in DMSO. </li><li> Los 1mg avidine in 250 ul PBS in een 0,5 ml eppendorfbuisje. </li><li> Voeg 1 ul van crb voorraad oplossing opgelost avidine. Meng door deze meermaals te keren. </li><li> Incuberen bij kamertemperatuur gedurende 15 min om CRB-avidine-conjugaat (CRB-A opleveren) Oplossing. </li><li> Uitsluiten niet-gebonden kleine moleculen en te zuiveren CRB-A met een grootte-uitsluiting kolom. </li></ol> 3. Microscopie en licht verlichting op subcellulaire niveau <ol><li> Serum verhongeren getransfecteerde cellen in DMEM zonder FBS gedurende 12 uur. </li><li> Zuig het medium uit de cellen en voeg 250 ul van de bereide 400 nM CRB-A (uit stap 2.6). </li><li> Om eiwitdynamica visualiseren in levende cellen op subcellulaire resolutie voor en na de lichtbehandeling, draaide disk microscopie gebruikt (Figuur 2a). UV-belichting werd bereikt door het koppelen van optiek voor UV-LED-licht (365 nm) met een epi-fluorescentie licht (Figuur 2b). </li><li> Metamorph software werd gebruikt om fluorescentie beelden van getransfecteerde cellen om de 15 seconden vast te leggen. </li><li> Bepaal de coördinaten en de grootte van een verlichting ter plaatse door middel van een glazen plaat bedekt met fluorescerende kleurstoffen opgewonden door UV-licht. De grootte kanworden gevarieerd door toepassing objectief met verschillende vergrotingen te selecteren en optische vezels met verschillende afmetingen kern. </li><li> Na het bepalen achtergrondniveaus membraan plooien, het bestralen UV licht aan de rand van cellen. De volgende twee stappen zijn om tegenover voorgaande lokale effecten. </li><li> Wereldwijd bestralen cellen met 365 nm licht dat door een kwiklamp. </li><li> Los Uncaged, dus originele rapamycine in DMSO en daarna in PBS (400 nM definitief), en voeg de oplossing voor de beeldvorming kamer aan de mondiale effecten te veroorzaken. </li></ol> 4. Representatieve resultaten Een voorbeeld van representatieve resultaten is weergegeven in figuur 3. UV-licht bestraling in een kleine regio in de buurt van een mobiele rand snel geïnduceerde vorming van gelokaliseerde ruches alleen in en nabij het bestraalde gebied. Om te bevestigen dat dit inderdaad lokale activiteit, we dan de hele wereld cellen bestraald met UV-of toegevoegd rapamycine het grootste deel media, zowel van de whilel veroorzaakt wereldwijde ruche vorming in het membraan. Voor een kwantitatieve analyse, we target cellen verdeeld in vier kwadranten, en telde de frequentie van ruches vorming in elk kwadrant op zowel lokaal als mondiaal na stimulatie onder verschillende omstandigheden met inbegrip van controles (figuur 4). Het is alleen deze combinatie van UV-straling, CRB-A, en passende FKBP-FRB constructies die de lokale plooien veroorzaakt. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig1.jpg" /> Figuur 1. Schematische voorstelling van ruimtelijk beperkt eiwit dimerisatie met behulp van gekooide rapamycine-avidine conjugaat (CRB-A) en UV-licht. UV-bestraling splitst de linker tussen rapamycine en biotine, waardoor het vrijkomen van chemische dimerizer (HE-Rapa, C40-O-(2-hydroxyethyl) rapamycine) en de bijproduct. De vrijgekomen dimerizer verspreidt dan in cellen en induceert dimerisatie tussen FKBP-POI (eiwit van belang) en plasma-membrane verankerd FRB slechts in de nabijheid van het bestraalde gebied (blauwe cirkel). Zonder de UV-straling, FKBP en FRB geen deelgenoten (Rode Kruis), vandaar de productie geen effect. (Copyright @ ACS2011) 6 <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig2.jpg" /> Figuur 2. Afbeelding van de aangepaste confocale fluorescentiemicroscoop. (A) vooraanzicht van de confocale microscoop (omgekeerde Axiovert 200 Zeiss). (B) Detail, bovenaanzicht van een koppelingselement voor EPI fluorescentie en UV licht. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig3.jpg" /> Figuur 3. Plaatsgebonden ruches vorming in een getransfecteerde NIH3T3 cel geïnduceerd door lokale UV-straling. Confocale fluorescentie beelden van een NIH3T3 fibroblast cel die is getransfecteerd met YFP-gelabeld FKBP-Tiam1 (Rac activator) en LDR (membraan-verankerd FRB) ondergingen bestraling in een afgesloten ruimte in de buurt van de rand met LED licht bij 365 nm 15 sec 210 sec vanaf in aanwezigheid van CRB-A-conjugaat in de bulk media. Deze behandeling werd gevolgd door de wereldwijde verlichting met kwik lamp gedurende 1 sec bij 1063 sec en wereldwijde toevoeging van rapamycine laatste 400 Nm bij 1.560 sec. De cel liet bijna geen plooien activiteit aan het begin (a) maar toonde ruimtelijk beperkt plooien na gelokaliseerde verlichting (gele cirkel) (b). De cel bleek wereldwijde ruche vorming na globale verlichting en de toevoeging van rapamycine (cd), wat aangeeft dat de plaatselijke ruches formatie werd veroorzaakt door ruimtelijk beperkt activatie van Rac. Schaal bar: 10 micrometer. (Copyright @ ACS2011) 6 <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig4.jpg" /> Figuur 4. Frequentie van plooien ontstaan ​​in kwadranten van getransfecteerde cellen NIH3T3. Lokale UV-bestraling met CRB-A en volgende globale UV-straling werden uitgevoerd op 13 cellen. CRB-A </sTrong&gt; toevoeging (geen UV bestraling) werden lokale UV bestraling met of zonder avidine uitgevoerd op 13 5 en 6 cellen. Geen van de waargenomen cellen toonde ruche formatie met CRB-A zonder UV-straling, of lokale UV-bestraling met of zonder avidine in bulk media. We verzamelden gegevens van de cellen met lage achtergrond ruche vorming maar had de capaciteit van rapamycine geïnduceerde vorming ruche welke wij na elke proef gecontroleerd door te controleren globale ruche vorming ten gevolge van de toevoeging van rapamycine (uiteindelijke 400 nM). Deze resultaten laten zien dat CRB-A en UV bestraling plaatselijk nodig voor lokale plooien vorming in de cellen. (Copyright @ ACS2011) 6 Afkortingen: FKBP: FK506-bindend eiwit FRB: FKBP-rapamycine-bindend eiwit Tiam1: T-cel lymfoom invasie en metastase-inducerende eiwit 1 (Rac GEF) LDR: Lyn-DSAG linker-FRB (Lyn: N-terminale 11 aminozuren van Lyn kinase) HE-Rapa: C40-O - (2-hydroxyethyl) rapamycine crb: gekooide rapamycine met biotine-groep CRB-A: crb geconjugeerd met avidine

<ol><li>Etienne-Manneville, S., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+GTPases+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rho GTPases in cell biology.</a> Nature. 420, 629-635 (2002).</li>
<li>Takai, Y., Sasaki, T., Matozaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+GTP-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Small GTP-binding proteins.</a> Physiol. Rev. 81, 153-208 (2001).</li>
<li>Kiyokawa, E., Aoki, K., Nakamura, T., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+regulation+of+small+GTPases+as+revealed+by+probes+based+on+the+principle+of+Forster+Resonance+Energy+Transfer+%28FRET%29%3A+Implications+for+signaling+and+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pharmacol.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal regulation of small GTPases as revealed by probes based on the principle of Forster Resonance Energy Transfer (FRET): Implications for signaling and pharmacology.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 51, 337-358 (2011).</li>
<li>Inoue, T., Heo, W. D., Grimley, J. S., Wandless, T. J., Meyer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inducible+translocation+strategy+to+rapidly+activate+and+inhibit+small+GTPase+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways.</a> Nat. Methods. 2, 415-418 (2005).</li>
<li>Komatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle-specific%2C+rapid+induction+of+molecular+activities+and+membrane+tethering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Organelle-specific, rapid induction of molecular activities and membrane tethering.</a> Nat. Methods. 7, 206-208 (2010).</li>
<li>Umeda, N., Ueno, T., Pohlmeyer, C., Nagano, T., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photocleavable+rapamycin+conjugate+for+spatiotemporal+control+of+small+GTPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am+.Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A photocleavable rapamycin conjugate for spatiotemporal control of small GTPase activity.</a> J. Am .Chem. Soc. 133, 12-14 (2011).</li>
<li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+Chemistry%3A+Diverse+Chemical+Function+from+a+Few+Good+Reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 2004-2021 (2001).</li>
<li>Kennedy, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nat. Methods. 7, 973-975 (2010).</li>
<li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461, 997-1001 (2009).</li>
<li>Wu, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+photoactivatable+Rac+controls+the+motility+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells.</a> Nature. 461, 104-108 (2009).</li>
<li>Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Induction of protein-protein interactions in live cells using light.</a> Nat. Biotechnol. 27, 941-945 (2009).</li>
<li>Fegan, A., White, B., Carlson, J. C., Wagner, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+controlled+protein+assembly%3A+techniques+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Chemically controlled protein assembly: techniques and applications.</a> Chem. Rev. 110, 3315-3336 (2010).</li>
<li>Suh, B. C., Inoue, T., Meyer, T., Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+chemically+induced+changes+of+PtdIns%284%2C5%29P2+gate+KCNQ+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rapid chemically induced changes of PtdIns(4,5)P2 gate KCNQ ion channels.</a> Science. 314, 1454-1457 (2006).</li>
<li>Varnai, P., Thyagarajan, B., Rohacs, T., Balla, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapidly+inducible+changes+in+phosphatidylinositol+4%2C5-bisphosphate+levels+influence+multiple+regulatory+functions+of+the+lipid+in+intact+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapidly inducible changes in phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate levels influence multiple regulatory functions of the lipid in intact living cells.</a> J. Cell. Biol. 175, 377-382 (2006).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

We beschreven een techniek die een nieuwe kooi samengestelde werken samen met de FKBP-FRB heterodimerisatie systeem om Rho GTPase activiteit te manipuleren op een precieze subcellulaire locatie op een tijdschaal van seconden. Er zijn drie beperkingen van deze aanpak. Ten eerste omdat de methode berust op het voorkomen of het laten diffunderen van dimerizer in de plasmamembraan het doel cellulaire locatie moet plasmamembraan of zijn omgeving. Verdere optimalisatie van de chemische structuur v...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens / apparatuur </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> Rapamycine </td><td> Tecoland </td><td> RAPA99 </td></tr><tr><td> FuGENE HD </td><td> Roche </td><td> 04709691001 </td></tr><tr><td> Avidine </td><td> Sigma </td><td> A9275-10MG </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D2650-5X5ML </td></tr><tr><td> Grootte-uitsluiting kolom </td><td> GE Healthcare </td><td> Spin Trap G-25 </td></tr><tr><td> Met glazen bodem 8-kamer goed </td><td> Thermo Scientific </td><td> 12-565-47 </td></tr><tr><td> Omgekeerde fluorescentiemicroscoop </td><td> Zeiss </td><td> Axiovert200M </td></tr><tr><td> UV-LED lichtbron </td><td> Rapp Opto Electronics </td><td> UVILED </td></tr><tr><td> Confocale draaiende schijf </td><td> Yokogawa Electric Corp </td><td> CSU10 </td></tr><tr><td> CCD camera </td><td> Hamamatsu Photonics </td><td> ORCA-ER </td></tr><tr><td> 100x objectief lens </td><td> Zeiss </td><td> Plan Apochromat </td></tr></tbody></table> Synthetische schema van CRB (Copyright ACS2011) 6 <a href="/files/ftp_upload/3794/3794scheme1_lg.jpg"><img src="/files/ftp_upload/3794/3794scheme1.jpg" alt="Schema 1" /></a> Synthetische voorwaarden: (a) BnBr, K 2 CO 3 DMF (b) f.HNO 3, AcOH (c) TFA (d) propargyl-Br, K 2 CO 3, DMF, (e) glycerol, cat. PTSA, tolueen (f) NaBH 3 CN, TiCl4, MeCN (g) 2 O Tf, Pyridine (h) methanol HCl (i) LiAlH4, THF (j) TsCl, pyridine, CH2 Cl 2 (k) NaN 3 DMF (l) 8, 2,6-di-t-butylpyridine, CH2 Cl 2 (m) 13 CUSO4, ascorbaat, 2-propanol, H2O, CH2 Cl 2.

spatio-temporele manipulatie van kleine gtpase activiteit bij subcellulaire niveau en op de tijdschaal van seconden in levende cellen

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Dynamische regulatie van de Rho familie van kleine guanosine triphosphatases (GTPases) met veel ruimte en tijd precisie essentieel is voor de verschillende cellulaire functies en gebeurtenissen 1, 2. Hun spatiotemporeel dynamische karakter is geopenbaard door de visualisatie van hun activiteit en lokalisatie in real-time 3. Om dieper inzicht in hun rol in diverse cellulaire functies op moleculair niveau te krijgen, moet verstoring van eiwit de activiteiten van de volgende stap zijn op een precieze subcellulaire locatie en timing. Om dit doel te bereiken, hebben we een methode ontwikkeld voor licht-geïnduceerde, spatio-temporeel gecontroleerde activatie van kleine GTPases door het combineren van twee technieken: (1) rapamycine-geïnduceerde FKBP-FRB heterodimerisatie en (2) een foto-kooien methode van rapamycine. Met het gebruik van rapamycine-gemedieerde FKBP-FRB heterodimerisatie, hebben we een methode ontwikkeld voor het snel induceerbaar activatie of inactivatie van kleine GTPases including Rac 4 Cdc42 4 RhoA 4 en Ras 5, waarbij rapamycine induceert translocatie van FKBP-gefuseerde GTPases of hun activatoren naar de plasmamembraan waar FRB verankerd. Voor de koppeling met deze heterodimerisatie systeem, hebben we ook een foto-kooien systeem van rapamycine analogen. Een foto-kooi verbinding is een klein molecuul waarvan de activiteit wordt onderdrukt met een photocleavable beschermende groep bekend als een kooi groep. Om heterodimerisatie activiteit volledig onderdrukken, hebben we een gekooide rapamycine dat gebonden is aan een macromolecuul dat de verkregen grote complex niet de plasmamembraan steken, waardoor vrijwel geen achtergrondactiviteit als chemisch dimerizer in cellen 6. Figuur 1 toont een schema van onze systeem. Met de combinatie van deze twee systemen, wij lokaal aangeworven a Rac activator aan de plasmamembraan op een tijdschaal van seconden en bereikt het licht-geïnduceerde Rac activatie aan de subcellulaire level 6.

Werkwijze voor tijdruimtelijke controle kleine GTPase activiteit licht beschreven. Deze methode is gebaseerd op rapamycine-geïnduceerde FKBP-FRB heterodimerisatie en foto-kooien systemen. Optimalisatie van het licht-bestraling kan de ruimtelijk-tijdelijk bestuurd activering van kleine GTPases op het subcellulaire niveau.

Spatio-temporele Manipulatie van kleine GTPase activiteit bij subcellulaire niveau en op de tijdschaal van seconden in levende cellen

Dynamische regulatie van de Rho-familie van kleine guanosinetrifosfatases (GTPases) met grote ruimtelijke en temporele precisie is essentieel voor diverse cellulaire ...

Deze video demonstreert een methode waarbij UV-licht wordt gebruikt om de activiteit van een eiwit aan het plasmamembraan te manipuleren. Hiervoor worden cellen cotransfecteerd met membraanverankerd FRB-eiwit en het met FKBP gefuseerde eiwit van belang. Een fotogecaged rapamycine-derivaat wordt aan het medium toegevoegd.Vervolgens wordt tijdens live-cell imaging UV-licht toegepast op een specifiek deel van de cel. De linker tussen rapamycine en biotine wordt gesplitst, waarbij de chemische dimerisator en het bijproduct vrijkomen; de vrijgegeven dimerisator diffundeert de cellen in en induceert dimerisatie tussen het met FKBP gelabelde eiwit van belang en het aan het plasmamembraan verankerde FRB in het bestraalde gebied. Zonder de UV-straling associëren FKBP en FRB niet, waardoor er geen effect optreedt.Analyse van de gegevens onthult een sterk gelokaliseerde rekrutering van het gefuseerde FKBP-eiwit van belang, gebaseerd op het fysiologische effect ervan. Het voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals farmacologische en genetische benaderingen, is de combinatie van snelheid van actie, doelspecificiteit en ruimtelijke resolutie. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van kanker bij metastase als gevolg van migratie door kankercellen.Daarom kan manipulatie van de activiteit van sleutelmigratiefactoren het preciese moleculaire mechanisme onthullen, wat een voorwaarde is voor de behandeling en genezing ervan. De procedure zal worden gedemonstreerd door Chris Paul Meyer, een promovendus, en Bob de Rose, een laborant uit mijn laboratorium. Begin dit protocol door het volgende in een steriele microcentrifugeebuis te combineren: plasmide-DNA, membraangebonden FRB, fluorescent gelabeld FKBP, TIA one en gedeïoniseerd water; voeg 1 µL a few gene HD toe aan het mengsel en vortex.Incubeer de buis 20 minuten bij kamertemperatuur. Voeg tijdens de incubatie 50 µL poly-L-lysine toe aan elke put van een glazen chamber slide met acht putten en incubeer dit gedurende één minuut om het oppervlak te coaten; aspireer vervolgens de oplossing en was het midden van elke put met 50 µL gedeïoniseerd water. Vervolgens wordt trypsine toegevoegd aan NIH 3T3-cellen met een confluentie van 80 tot 85%.Nadat de cellen zijn losgekomen, voegt u 10 milliliters DMEM toe met 10% FBS, brengt u 375 microliters van de suspensie over naar een steriele buis van 15 milliliter en centrifugeert u dit gedurende drie minuten bij 1.500 G. Aspireer na het centrifugeren voorzichtig het medium. Voeg 750 microliters DMEM toe met 10% FVS en resuspendeer.Resuspendeer het pellet door voorzichtig meerdere keren met de pipet op en neer te pipetteren. Voeg tenslotte de celsuspensie toe aan de transfectie-oplossing en roer voorzichtig met de pipetpunt; voeg vervolgens 250 microliters van de celtransfectiesuspensie toe aan elke put van de kamer. Schuif het geheel op zijn plaats en incubeer het.37 °C gedurende 15 tot 18 uur. Om cage-rapamycine, biotin-adduct te synthetiseren: begin met het bereiden van een stokoplossing van 1 mM CRB in DMSO in een steriele centrifugebuis; los in een aparte microcentrifugebuis van 1,5 mL één mg avadon op in 250 µL PBS.Vervolgens wordt het caging-gedeelte geconjugeerd aan rapamycine. Voeg 0,5 µL van de CRB-stoomoplossing toe aan het opgeloste AVID; meng dit door het buisje enkele keren om te keren en laat het daarna 15 minuten incuberen bij kamertemperatuur. Om CRB AVID als conjugaatoplossing te verkrijgen, ongebonden kleine moleculen te verwijderen en CRBA te zuiveren, wordt een G 25 size-exclusion kolom geëquilibreerd met 300 µL PBS.Herhaal dit vijf keer nadat de kolom is geëquilibreerd. Breng 125 µL CRBA-oplossing aan op het centrale bed van de kolom. Centrifugeer de oplossing vervolgens gedurende twee minuten bij 800 ×g. Verzamel de doorstroom bij kamertemperatuur in een 1,5 mL microcentrifugebuis na transfectie van de cellen.Vervang het medium door DMEM zonder FBS om de cellen te serumuithongeren en laat deze 12 uur incuberen. Zuig na de incubatie voorzichtig het medium af en voeg 250 µL van de bereide 1 µM CRBA-oplossing toe. Gebruik vervolgens, om de proteinedynamiek in levende cellen te visualiseren, een spinning disc confocale microscoop met UV-verlichting, waarbij de optica zijn gekoppeld aan een UV-LED-lichtbron van 365 nm.Met epifluorescentielicht. Bepaal de coördinaten en de grootte van een belichtingsspot met behulp van een glasplaat gecoat met fluorescerende kleurstoffen die door UV-licht worden geëxciteerd. Dit maakt een nauwkeurige afstelling van het te bestralen gebied mogelijk.Plaats de kamerdia met de cellen op de tafel met gebruik van een 100 x objectief en epifluorescentie. Stel de cellen scherp en zoek een cel. Begin met het afbeelden van de cellen nadat de achtergrondniveaus van het fysiologische effect zijn bepaald.Hierbij wordt membraanruffling gemeten door UV-licht uit te stralen in één gekozen kwadrant van de cel, waarbij uncaged rapamycine wordt opgelost in DMSO en vervolgens in PBS tot een uiteindelijke concentratie van 400 nanomolar. Voeg 100 microliter van de oplossing toe aan de beeldvormingskamer om globale effecten op te wekken. Leg elke 15 seconden fluorescentiebeelden vast gedurende 20 minuten om vast te stellen of gelokaliseerde activatie van RAC lokale rufflevorming kan induceren.NIH 3T3-cellen werden getransfecteerd met YFP-getagde RAC-activator FKbp, TIA1 en LDR, welke membraanverankerd is. FRB-gelokaliseerde bestraling aan de rand van de cel, aangegeven door de gele cirkel, werd gevolgd door globale illuminatie met een kwiklamp gedurende één seconde, beginnend bij 1063 seconden. Zoals hier te zien is, was er aan het begin vrijwel geen membraanruffling aanwezig.Echter, na lokale illuminatie werd ruimtelijk beperkte ruffling waargenomen na globale illuminatie en toevoeging van rapamycine, wat translocatie van FK bp TIA one naar het plasmamembraan veroorzaakt. De cel vertoonde globale ruffelvorming, wat aangeeft dat de eerder waargenomen lokale ruffelvorming werd veroorzaakt door ruimtelijk beperkte activatie van rack. Voor een kwantitatieve analyse werden doelcellen verdeeld in vier kwadranten en werd de frequentie van ruffelvorming in elk kwadrant bij zowel lokale als globale stimulatie bepaald, zoals te zien is in deze grafiek.Geen van de geobserveerde cellen vertoonde rimpelvorming met CRBA zonder uv-bestraling of lokale uv-bestraling, noch uv-bestraling met of zonder Aden in bulkmedium. Echter, wanneer CRBA werd toegevoegd en uv-bestraling werd uitgevoerd, was rimpelvorming te zien in ongeveer dezelfde mate, ruwweg 90% in alle kwadranten bij globale bestraling; wanneer alleen kwadrant één werd bestraald, was de frequentie van rimpelvorming 100% vergeleken met 30%, 25% en 30% in kwadranten twee tot en met vier. Deze resultaten geven aan dat gelokaliseerde uncaging van rapamycine kan worden gebruikt om zeer lokale fysiologische effecten in een enkele cel op te wekken.In dit geval is er sprake van membraanruffeling veroorzaakt door rack-activatie. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe spatiotemporele controle van de activiteit van kleine g TPAs door middel van licht kan worden bereikt. Deze methode kan worden toegepast op elk fysiologisch proces dat afhankelijk is van de translocatie van specifieke eiwitten naar het plasmamembraan.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat oplossingen, reagentia en cellen voor elke procedure vers moeten worden bereid. Vergeet niet dat werken met UV-licht extreem gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van een UV-bril, altijd moeten worden in acht genomen.

spatio-temporal-manipulation-small-gtpase-activity-at-subcellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Dit artikel beschrijft de procedures met betrekking tot overexpressie en analyse van kleine GTPases in gepolariseerd epitheliale cellen met behulp van micro-injectie techniek.

Het analyseren van de functie van kleine GTPases door micro-injectie van Plasmids in de gepolariseerde epitheelcellen

De kernsplijting gist, Schizosaccharomyces pombe is een uitstekend modelsysteem om cytokinese te studeren, het laatste stadium van de celdeling. Hier beschrijven we een microscopie benadering van verschillende cytokinetic gebeurtenissen in levende splijtingsproducten gistcellen te analyseren.

Spatiotemporele analyse van Cytokinetic Evenementen in Fission Yeast

We beschrijven hoe micro- en photomanipulation technieken zoals FRAP en photoactivation inschakelen de bepaling van de parameters van de beweeglijkheid en de spatio dynamiek van eiwitten in het migreren van cellen. Experimentele uitlezingen omvatten subcellular dynamiek en omzet van beweeglijkheid toezichthouders of van de onderliggende actine cytoskelet.

Micromanipulation technieken waardoor analyse van morfogenetische dynamiek en een omzet van Cytoskeletal regelgevers

Hier beschrijven we een protocol voor het onderzoek naar de prenylation en 5'-Guanosinetrifosfaat (GTP)-laden van Rho GTPase. Dit protocol bestaat uit twee gedetailleerde methoden, namelijk membraan fractionering en een GTPase-linked immunosorbent assay. Het protocol kan worden gebruikt voor het meten van de prenylation en de GTP laden van verschillende andere kleine GTPases.

Detectie van kleine GTPase Prenylation en GTP bindend gebruiken membraan fractionering en GTPase-linked Immunosorbent Assay

Eiwit-eiwitinteractie zijn kritisch voor biologische systemen, en studies over de bindende kinetiek inzicht verwerven in de dynamiek en de functie van eiwitcomplexen. Beschrijven we een methode die kwantificeert de kinetische parameters van een eiwit complex met behulp van fluorescentie resonantie-energie-overdracht en de techniek gestopt-flow.

Met behulp van In Vitro fluorescentie Resonance Energy Transfer te bestuderen van de dynamiek van eiwitcomplexen op de tijdschaal van een milliseconde

Mechanische krachten zijn belangrijk voor het beheersen van de Celmigratie. Dit protocol demonstreert het gebruik van elastische hydrogels die kunnen worden vervormd met behulp van een glazen micro pipet en een micro manipulator om cellen te stimuleren met een lokale stijfheids gradiënt om veranderingen in celstructuur en migratie teweeg te brengen.

Enkelvoudige cel Duro Taxis assay voor de beoordeling van de mechanische controle van cellulaire beweging en gerelateerde signalering van gebeurtenissen

Hier beschrijven we een protocol voor live celbeeldvorming van de corticale microtubuliercytoskelet bij de shoot apicale meristem en het toezicht op de reactie op veranderingen in de fysieke krachten.

Live Cell Imaging van Microtubule Cytoskeleton en Micromechanische Manipulatie van de Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor superresolutie live-cell imaging in intact weefsel. We hebben de voorwaarden gestandaardiseerd voor beeldvorming van een zeer gevoelige volwassen stamcelpopulatie in zijn inheemse weefselomgeving. Deze techniek omvat het balanceren van temporele en ruimtelijke resolutie om de directe observatie van biologische verschijnselen in levend weefsel mogelijk te maken.

Superresolutie live celbeeldvorming van subcellulaire structuren

Typische microtubuleremmers, die veel worden gebruikt in fundamenteel en toegepast onderzoek, hebben verstrekkende effecten op cellen. Onlangs ontstonden fototatinen als een klasse van fotoschakelbare microtubuleremmers, in staat tot onmiddellijke, omkeerbare, spatiotemporaal nauwkeurige manipulatie van microtubuli. Dit stapsgewijze protocol beschrijft de toepassing van fototatinen in een 3D live pre-implantatiemuismyo.

Spatiotemporale subcellulaire manipulatie van het microtubulecytoskelet in het levende pre-implantatiemuismyo met behulp van photostatinen

Hier wordt een op TIRF-microscopie gebaseerde in vitro reconstitutietest gepresenteerd om tegelijkertijd de dynamiek van twee microtubulipopulaties te kwantificeren en te vergelijken. Er wordt een methode beschreven om tegelijkertijd de collectieve activiteit van meerdere microtubule-geassocieerde eiwitten op verknoopte microtubulibundels en enkele microtubuli te bekijken.

Gelijktijdige visualisatie van de dynamica van crosslinked en enkele microtubuli in vitro door TIRF-microscopie

Dit protocol beschrijft de toepassing van een gemanipuleerd blauw-licht-geactiveerd allosterisch schakelaar (LightR) domein voor omkeerbare spatiotemporele controle van eiwitactiviteit. Door gebruik te maken van Src-tyrosinekinase als model, biedt deze studie een uitgebreid protocol voor het ontwikkelen en karakteriseren van lichtgereguleerde Src (LightR-Src). Het demonstreert de veelzijdigheid van deze aanpak in alle enzymklassen.

Spatiotemporele controle van eiwitactiviteit door optogenetische allosterische regulatie

Leer spatio-temporele manipulatie van kleine GTPase-activiteit op subcellulair niveau met UV-licht en foto-gekooide rapamycine. Deze methode maakt precieze controle van eiwitactiviteit in levende cellen mogelijk.

Spatio-temporele Manipulatie van kleine GTPase activiteit bij subcellulaire niveau en op de tijdschaal van seconden in levende cellen (Video) | JoVE Journal

Spatio-temporele Manipulatie van kleine GTPase activiteit bij subcellulaire niveau en op de tijdschaal van seconden in levende cellen

Meer video's verkennen