Engineering en Evolutie van synthetische adeno-geassocieerd virus (AAV) gentherapievectoren via DNA Family Shuffling

Het algemene doel van het volgende experiment is het creëren van een zeer diverse bibliotheek van synthetische adeno-geassocieerde virale capsiden, waaruit partikels met een gewenste eigenschap kunnen worden geselecteerd. Dit wordt bereikt door eerst de capsidogenen van aav te fragmenteren, te kloneren en te selecteren via een gecontroleerde DNAse I-digestie, om hun daaropvolgende reassemblage in chimere sequenties via twee PCR-reacties mogelijk te maken. Als tweede stap wordt het resulterende PCR-product teruggekloneerd in een replicatie-competent aav-construct om een plasmidenbibliotheek te verkrijgen die ten minste 1 miljoen verschillende aav-capsidogenen bevat.

Vervolgens wordt deze plasmidenbibliotheek getransfecteerd in 2 9 3 T-cellen, samen met een adenoviraal helperplasmide, om een chimere virusbibliotheek te produceren die vervolgens kan worden geselecteerd op doelcellen of in dieren. De resultaten tonen de succesvolle moleculaire manipulatie en evolutie van nieuwe synthetische A A V-vectoren aan, gebaseerd op verbeterde of specifiekere expressie van het reportergen in gecultiveerde cellen of in volwassen muizen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals peptide display is dat DNA-familie-shuffling het potentieel heeft om gelijktijdig meerdere kenmerken van het AV-capside te veranderen en te verbeteren, van celbinding en intracellulair transport tot het uitpakken en de genexpressie in de nucleus.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de velden van gentherapie en virologie, zoals hoe een ideale vector kan worden verkregen voor een specifieke therapeutische toepassing of hoe de domeinen van een viraal kapsid die verantwoordelijk zijn voor een bepaalde eigenschap kunnen worden ontleed. De implicaties van deze techniek reiken tot de therapie van meerdere menselijke ziekten, waaronder infecties met virale pathogenen, omdat onze methode de moleculaire evolutie van AAV-vectoren mogelijk maakt die specifiek en krachtig virale doelcellen infecteren, zoals T-cellen voor hiv of hepatocyten voor hepatitisvirussen. Bovendien kan deze methode inzicht bieden in de biologie van AAV en kan zij worden gebruikt om AAV-vectoren voor gentherapie te verbeteren.

Het kan bovendien eenvoudig worden toegepast op andere genfamilies van fundamentele of toegepaste relevantie, zoals fluorescentie-coderende dosis, drie reporters, cellulaire enzymen of eiwitten die betrokken zijn bij RNA-interferentie. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we probeerden een goede vector te vinden om therapeutische genen in weefselfragmenten van volwassen muizen over te dragen, en we realiseerden ons dat alle natuurlijk voorkomende AV-serotypes nadelen hadden, zoals een hoge prevalentie in de menselijke populatie en bijgevolg een hoge incidentie van bestaande immuniteit of een slechte in vivo prestatie ondanks efficiënte transductie van hepatocyten in vitro. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de DNA-gebaseerde AV-capside-genfragmentatie en sommige stappen bij de productie van de virale bibliotheek moeilijk te leren zijn omdat ze ervaring en bewustzijn van de kritieke fasen vereisen, om zo de routinematige preparatie van voldoende hoeveelheden van de verschillende adeno-geassocieerde virale capside-genen te vergemakkelijken.

Voor DNA-shuffling worden deze genen in eerste instantie gesubkloneerd in een gemeenschappelijke plasmid-backbone. Om dit te bereiken, worden de gewenste cap-genen eerst geamplificeerd via PCR vanuit algemeen beschikbare AAV-plasmiden met behulp van de primers cap F en cap R. De cap-genen worden vervolgens gekloneerd in een plasmid dat is ontworpen om specifieke primer-bindingsplaatsen en restrictieplaatsen te bevatten. In dit voorbeeld wordt het cap-gen gekloneerd in de PAC one- en SC one-plaatsen, die aanwezig zijn in de primers die gebruikt worden voor cap-amplificatie en in het ontvangende plasmid, maar afwezig zijn in de meeste AAV's. Zodra de plasmid-sets die de AAV-capsidgenen coderen zijn gegenereerd, wordt de procedure voor cap-shuffling gestart via PCR, waarbij de gekozen cap-genen worden geamplificeerd met behulp van de T3- en T7-primers.

Stel een PCR-reactie van 50 µL samen bestaande uit 200 ng cap-plasmide, elke primer in een uiteindelijke concentratie van 2 µM, 10 µL van de five x high five-buffer en 1 µL high five-polymerase. Deze reactie levert ongeveer 3 µg PCR-product op, wat voldoende is voor maximaal zes shuffling-reacties, afhankelijk van het aantal cap-genen dat in de library moet worden opgenomen. Begin met vijf minuten bij 95 °C en voer vervolgens 40 cycli uit van 15 seconden bij 94 °C, 30 seconden bij 57 °C en drie minuten bij 68 °C, gevolgd door een laatste stap van 10 minuten bij 72 °C.

Na het zuiveren van de PCR-producten wordt een gecontroleerde DNA-digestie gebruikt om cap-genfragmenten te creëren voor herassemblage in Kyra. Een van de moeilijkste aspecten van deze procedure is het verkrijgen van een specifiek bruikbaar bereik aan gedigesteerde DNA-fragmenten van het cap-gen voor de herassemblage in Kyra; met dit doel bereiden we aanvankelijk PLE-hoeveelheden van gezuiverde cap-genen voor en stellen we vervolgens meerdere parallelle reacties op met variërende condities. Om de digestie gelijkmatig op te zetten, mengt u de verschillende cap-PCR-producten tot een totale hoeveelheid van 4 µg in 54 µL water en voegt u vervolgens 6 µL DS-reactiebuffer en 0,5 µL DNAse I voorzichtig toe aan de reactie. centrifugeer de buis kort drie keer en plaats deze onmiddellijk op een warmteblok van 25 °C.

Incubeer deze eerste reactie gedurende één minuut. Bereid vervolgens een tweede digestiereactie voor, maar incubeer deze gedurende één minuut en 15 seconden bij 25 °C. Stel op deze manier meerdere parallelle reacties op met incubatietijden tussen één en twee minuten, waarbij de incubatietijd in stappen van 15 seconden varieert.

Stop elke reactie door zes µL 25 mM EDTA toe te voegen. Vortex de buis kort en incubeer 10 minuten bij 75 °C. De meerdere parallelle reacties resulteren in vijf cap-monsters gedigereerd met DNAs, één voor variërende incubatietijden; zuiver de cap-fragmenten op een standaard 1% AROS-gel.

Idealiter moet er een smear zichtbaar zijn tussen 100 en 500 baseparen, zoals te zien is in dit voorbeeld met incubatietijden van één minuut, 45 seconden of twee minuten om mee te beginnen. Bij DNA family shuffling worden de cap-fragmenten eerst geassembleerd tot volledige sequenties via een PCR, waarbij ze zichzelf primen op basis van partiële homologieën. Stel een reactie van 50 µL op met 500 ng gezuiverde fragmenten, 10 µL 10x fusiebuffer, 1 µL 10 mM dNTPs, 1,5 µL DMSO en 0,5 µL fusie.

Incubeer de twee polymerasen gedurende 30 seconden bij 98 °C en voer vervolgens 40 cycli uit van 10 seconden bij 98 °C, 30 seconden bij 42 °C en 45 seconden bij 72 °C, gevolgd door een laatste stap van 10 minuten bij 72 °C. Amplificeer vervolgens de opnieuw samengestelde cap-genen voor daaropvolgende klonering via een tweede PCR met gebruik van primers die binden aan de geconserveerde flankerende sequenties. Stel bijvoorbeeld een reactie van 50 µL op met SAF en SAR of CUF en CUR, bestaande uit telkens twee µL van de eerste PCR, elke primer in een eindconcentratie van 2 µM, 0,5 µL magnesiumchloride, 10 µL van een 5x high-FI buffer en 1 µL high-FI polymerase.

Er worden 16 tot 24 PCR's aanbevolen om voldoende hoge opbrengsten te garanderen voor daaropvolgende klonering. Nadat de PCR's zijn samengevoegd en de volledige lengte van de cap-band is gezuiverd, is de volgende stap het ligeren van de gezuiverde cap-genpool met PAC one en a SC one voor klonering in een replicatiecompetent a a v-plasmide. Het ontvangende plasmide draagt a a v inverted terminal repeats die het AAV two rep-gen flankeren onder controle van de AAV P five-promoter, PAC one en ASC one.

Restrictieplaatsen stroomafwaarts van rep maken in-frame klonering van de pool van gehusselde cap mogelijk. De LSE-primerbindingsplaatsen, aangegeven door pijlen, zijn nuttig voor sequencing van het cap-gen; voeg de cap-fragmenten en de dienovereenkomstig geknipte recipient-plasmidbackbone toe in een molaire ratio van drie op één. Maak een mastermix met een totaalvolume van 40 µL, voldoende voor 20 transformaties, met een uiteindelijke DNA-concentratie van 15 ng/µL.

Incubeer overnacht bij 16 °C. Transformeer de ligatiereactie de volgende dag in E. coli. Meng 2 µL ligatiereactie met 30 µL elektrocompetente E. coli en breng dit over in vooraf gekoelde electroporatiecuvetten op ijs. Elektroporteer bij 1,8 kV, 200 Ω en 25 µF. De tijdconstante moet dicht bij 5 ms liggen. Voeg onmiddellijk 1 mL voorverwarmd SOC-medium toe en breng dit over naar een maatkolf van 250 mL.

20 dergelijke elektroporaties leveren een bibliotheek op met een diversiteit van ongeveer 1 × 10⁶ verschillende klonen. Voeg één volume voorverwarmd SOC-medium toe aan de samengevoegde transformaties en schud gedurende één uur bij 37 °C en 180 RPM. Voeg vervolgens 40 ml van de samengevoegde transformaties toe aan 800 ml LB-medium met ampicilline en incubeer dit nog 16 uur onder dezelfde omstandigheden; het plasmide-DNA van de bibliotheek wordt vervolgens gezuiverd met behulp van een commercieel verkrijgbare kit.

De productie van de virale bibliotheek begint met de transfectie van HEC 2 9 3 T-cellen met de a a v-bibliotheek. Om deze procedure te starten, zaait men 10 15 centimeter vierkante schalen met HEC 2 9 3 T-cellen en laat men deze 48 uur groeien bij 37 °C. Bereid voor elke transfectie de volgende twee reagensmengsels in twee afzonderlijke buizen voor. De volgende hoeveelheden zijn gegeven per 10 platen in de eerste buis.

Meng 7,9 milliliters natriumchloride en DNA en voeg water toe tot een totaalvolume van 15,8 milliliters. Voeg in de tweede buis 3,52 milliliters polyethyleenamine, 7,9 milliliters natriumchloride en 4,38 milliliters water toe. Combineer de mengsels, vortex en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur; verdeel de oplossing gelijkmatig over elke schaal met 2 9 3 T-cellen. Incubeer bij 37 °C.

Na 48 uur kan de virale bibliotheek worden geoogst. Schraap de cellen in het medium, breng de cellen van alle schalen samen in één buis en centrifugeer 15 minuten bij 1200 RPM. Resuspendeer de celpellet in zes milliliter lysisbuffer en onderwerp deze vervolgens aan vijf vries-dooi-cycli; na deze vijf vries-dooi-cycli incubeert men één uur bij 37 graden Celsius met Ben Nase.

Centrifuge vervolgens de celresten bij 3 750 RPM gedurende 20 minuten. Stel een gradiënt in voor een zuivering door met een pasteurpipet vijf milliliter virusсусpensie in een Beckman Quicks seal centrifugebuis te voegen, gevolgd door telkens 1,5 milliliter van een 15%, 25% en 40% iodale oplossing. Vul de gradiënt aan met lysislabuffer en ultracentrifugeer bij 50 000 K gedurende twee uur bij vier graden Celsius.

Verwijder na voltooiing van de ultracentrifugatie de buis uit de rotor en reinig de buitenkant van de buis met 70% ethanol. Steek een naald in de bovenkant van de buis voor ventilatie en gebruik een andere naald om 1,2 milliliters van de 40% IOL-fractie op te zuigen. Zorg ervoor dat u niet uit de 25%-fractie put, aangezien deze leeg is.

AAV-capsiden. Individuele klonen uit de oorspronkelijke plasmidenbibliotheek worden geanalyseerd op hun functionaliteit en diversiteit door ze te gebruiken voor de productie van recombinante AAV-vectoren die een reportergen tot expressie brengen. Gecultiveerde cellen of dieren worden vervolgens geïnfecteerd met verschillende hoeveelheden van het gezuiverde virus, waarna de transductie-efficiëntie wordt bepaald.

Hier worden fluorescentiemicroscopie-resultaten getoond van drie menselijke cellijnen die zijn geïnfecteerd met vijf verschillende recombinante YFP-uitdrukkende AAV-vectoren, gemaakt met gehusselde cap-genen. Een alternatieve methode voor het analyseren van de transductie-efficiëntie is FACS-gebaseerde meting van de expressie van het fluorescente reportergen. Deze figuur toont een typisch resultaat van vier celtypen: menselijke niercellen, menselijke cervixcellen, muizenfibroblasten en menselijke T-cellen, geïnfecteerd met 18 verschillende recombinante YFP-uitdrukkende AAV-vectoren, gemaakt met willekeurig geselecteerde gehusselde cap-genen uit een oorspronkelijke bibliotheek.

De YFP-expressie is met kleuren gecodeerd voor een eenvoudigere visualisatie. De weergaves tonen percentages getransduceerde cellen, waarbij zwart 0% aangeeft en wit het hoogste gemeten aantal in elk celtype. Clone B2 (rood) is een voorbeeld van een kloon met een geringe algehele efficiëntie, wat verwacht kan worden bij niet-geselecteerde capsiden. De virale bibliotheek kan vervolgens worden gescreend op enkelvoudige particles die de meeste of alle gewenste eigenschappen vertonen in een specifieke cellijn of in dieren voor selectie.

In gekweekte cellen worden de cellen eerst co-geïnfecteerd met diverse aliquots van de bibliotheek en het ENO-virus five om de groei van a a v te ondersteunen, waarna de cellen worden geoogst en het geamplificeerde a a v wordt geëxtraheerd en gebruikt om nieuwe cellen te reinfecteren. Het bepalen van optimale a a v adenovirus-ratio's voor de co-infectie van cellen is belangrijk, en een goede maatstaf voor een krachtige arius-infectie is het optreden van cytopathische effecten drie dagen na virusinoculatie, evidenced door het rond worden en loslaten van cellen; in deze figuur toont het linksboven gelegen paneel niet-geïnfecteerde cellen, terwijl de overige panelen cellen tonen die zijn geïnfecteerd met de aangegeven hoeveelheden adenovirus in particles per cel. Een andere nuttige readout voor a a v-infectie en amplificatie is de detectie van kapsid-eiwitten via western blotting met gebruik van de B one-antilichamen die een sterk geconserveerd a a v-kapsid-epitoop herkennen.

De linker blot toont cellen die gecoinfecteerd zijn met verschillende volumes in microliters van een a a V library en helper ENO vir. De eerste twee banen zijn goede voorbeelden van condities die resulteren in nauwelijks detecteerbare a a v proteïne-expressie, wat duidt op een voldoende maar niet excessieve a a v infectie en amplificatie, en derhalve de gewenste nauwe koppeling tussen genotype en fenotype.

De resultaten van de western blot worden getoond in de cellen rechts. In LA c werd alleen een v geïnfecteerd als negatieve controle. Het is daarnaast cruciaal om de diversiteit van de bibliotheek tijdens herhaalde infectieronden te monitoren via DNA-sequencing.

Dit diagram toont de vergelijkingen van eiwitsequenties van AAV-klonen uit een bibliotheek op basis van AAV twee, acht en negen vóór en na selectie. De sequenties boven de rode lijn tonen de ouderlijke AAV's. Paarse pijlen geven homologe recombinatiegebeurtenissen aan. De rode pijl markeert een crossover tussen AAV twee en AAV negen, waargenomen in alle geselecteerde klonen. Voor selectie in dieren wordt de AAV-bibliotheek in de dieren geïnfundeerd, via PCR uit de doelcellen of het weefsel teruggewonnen en vervolgens opnieuw gekloond en verpakt voor een nieuwe infectieronde.

Hier wordt een voorbeeld getoond van de rescue van succesvol geïnfecteerde a a v-klonen uit muizenlevers één week na perifere library-infusie. Baan één vertoont de verwachte band van 2,2 kilobase, terwijl baan twee een non-template controle is; de groottes van de DNA-markerbanden in baan M zijn aangegeven in kilobases. Ongeacht de selectieprocedure moeten de verrijkte capside-varianten uiteindelijk worden gevalideerd in passende systemen.

Hier wordt een voorbeeld getoond van de superieure prestaties van een verrijkte AAV-kymera in gekweekte cellen. Donkere kleuren duiden op een hogere infectiviteit per partikelgetal, en dus per kloon. AAV-DJ presteert beter dan een verzameling van acht natuurlijke AAV-wildtypes in een breed scala aan cellijnen.

Ten slotte wordt een analyse getoond van een geselecteerde AAV KYMERA-kloon in de lever van muizen. De AAV DN werd geselecteerd op basis van spiegelbeeldige hepatomacellen en vervolgens gebruikt om luciferase-expresserende recombinante vectoren te produceren, getoond in onze representatieve muizen (drie per groep) één week na perifere infusie van gelijke doses van deze vector of een controle op basis van wildtype AAV8, een van de meest potente bekende natuurlijke isolaten in de muizenlever. Let op dat hoewel de AAV DN-kloon een iets lagere totale expressie in de lever geeft, deze specifieker is voor dit orgaan, aangezien er aanzienlijk minder off-targeting in niet-hepatische weefsels optreedt zodra de expressieniveaus in de lever via de imaging-software zijn aangepast.

Deze techniek kan in één week worden voltooid, beginnend met de amplificatie van de AAV-capsidegenen en eindigend met de virale bibliotheek, mits deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het hier beschreven protocol is afgeleid van onze ervaringen met de selectie van natuurlijke AV-serotypen en dat het goed mogelijk is dat sommige condities moeten worden aangepast en geoptimaliseerd wanneer andere gebruikers hun eigen aangepaste bibliotheken maken. Naast deze procedure kunnen andere methoden, zoals peptide-display via site-directed mutagenese met AGENESIS of PCR-gebaseerde randomisatie, worden toegepast om eveneens zeer diverse bibliotheken te genereren of om te proberen de eigenschappen van capsiden die zijn gecreëerd en verrijkt middels DNA-family shuffling verder te verbeteren na diens ontwikkeling.

Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van virale genoverdracht om therapeutische strategieën te verkennen voor ziekten en bijbehorende doelcellen waarvoor conventionele AAV-typen onbevredigende resultaten gaven, zoals HIV-infecties en T-cellen, alsofom vector-gebaseerde gentransfer naar menselijke stamcellen en andere moeilijk te infecteren cellen in kweek te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u zeer diverse bibliotheken van synthetische adeno-geassocieerde virale vectoren kunt ontwikkelen en evolueren met behulp van een combinatie van genfragmentatie en reassemblage, en hoe u deze bibliotheken hoofdzakelijk kunt selecteren in gekweekte cellen of in dieren om individuele capsiden te verrijken met gewenste specifieke eigenschappen voor gebruik als gentransfervectoren. Vergeet niet dat het werken met adenovirus risico's kan inhouden en dat er veel voorzorgsmaatregelen genomen moeten worden tijdens het uitvoeren van deze procedure.