Een primaire Neuron Cultuurstelsel voor de Studie van Herpes Simplex Virus latentie en reactivatie

Het doel van dit experiment is om aan te tonen hoe een primair neuronale celcultuursysteem kan worden gebruikt om de latentie en reactivatie van het herpes simplexvirus te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst neuronen uit de ganglia cervicalis superior te isoleren uit RA-embryo's en de neuronen die zijn geïsoleerd uit gedissocieerde ganglia te kweken na eliminatie van niet-neuronale cellen. Een latente HSV-infectie wordt tot stand gebracht door gebruik te maken van een EGFP-virus om neuronen te infecteren in de aanwezigheid van een lytische replicatieremmer.

De volgende stap is het induceren van de reactivatie van de latente geïnfecteerde culturen. Ten slotte wordt de efficiëntie van de reactivatie beoordeeld door de expressie van EGFP in de loop van de tijd te monitoren. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die aantonen hoe verschillende neuronale signaleringspaden de latentie en reactivatie van het herpes simplex virus reguleren door middel van het gebruik van chemische inhibitoren, RNA-interferentie en genoverdracht.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat het gedetailleerde studies mogelijk maakt naar de interacties die de latentie van herpes simplex virus in het gastneuroon op moleculair niveau reguleren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van herpes simplex virus latentie, zoals wat de signalen zijn die werken om het latente genoom te onderdrukken en hoe reactivatie op moleculair niveau wordt getriggerd. In neuronen kan deze methode inzicht verschaffen in HSV-1 latentie.

Het kan ook worden toegepast op andere neurotrofe alfa-herpesvirussen. De procedure zal worden gedemonstreerd door Marigo Kochi en Julian Kim, beide promovendi in onze laboratoria. Superieure cervicale ganglia of SCG-neuronen voor dit protocol worden geïsoleerd uit E 21 ratpups die uit de baarmoeder van een drachtige vrouwtjesrat zijn gehaald. Offer elke pup in onder een dissectiekap door de schaar aan de basis van de nek, net boven de schouders, te plaatsen en de kop van de romp te scheiden. Gebruik 23 gauge naalden om de kop op drie plaatsen vast te pinnen met de nekzijde naar boven om de ganglia bloot te leggen.

Zet eerst het ruggenmerg vast met pinnen. Trek vervolgens de voorste huid over de neus en zet deze vast, en pin ten slotte de slokdarm en luchtpijp weg van de achterzijde van de nek. Zoek het SCG door de vertakking van de halsslagader te lokaliseren.

De halsslagader is een gepaarde structuur. Er bevinden zich aan weerszijden van de hals twee vertakkingen, waardoor er twee s CGS per persoon zijn. De SCG bevindt zich net onder de vertakking.

Scheid het SCG van de slagaders door de bifurcatie aan de twee uiteinden uit elkaar te trekken. Het SCG is doorschijnend en kleurloos in vergelijking met het ondoorzichtige gelige vetweefsel dat de bifurcatie omringt. Plaats de ganglia in 12 milliliters L 15.

Medium aangevuld met glucose in een conische buis van 15 milliliter op ijs. Nadat alle SCG's uit de embryo's zijn geoogst en voorzichtig zijn verwijderd, worden de ganglia één minuut gecentrifugeerd bij 600 RPM; verwijder vervolgens het overtollige medium.

Suspendeer de ganglia in één milliliter L 15-medium dat trypsine en collagenase bevat. Incubeer gedurende 24 minuten bij 37 °C.

Agiteer elke acht minuten. Voeg vervolgens 10 milliliters zeemedium toe om de trypsine te inactiveren en centrifugeer gedurende één minuut. Verwijder bij 600 RPM zoveel mogelijk van het trypsine-collagenase-medium en was de ganglia met 10 milliliters C-medium door één minuut te centrifugeren bij 600 RPM.

Herhaal deze wasstap één keer. Verwijder het wasmedium en resuspendeer de ganglia in één milliliter C medium om deze te dissociëren door middel van tritratie met een 21 gauge naald bevestigd aan een spuit van vijf milliliter voor maximaal 15 op-en-neer cycli. Voltooi de tritratie met een 23 gauge naald totdat de meeste klonten zijn gedissocieerd.

Verwijder eventuele resterende celklonters door de gedisassocieerde neuronen door een nylon filter van 70 micron in een conische buis van 50 milliliter te filteren. Neem een aliquot van 10 microliter van de gefilterde celsuspensie en meng deze met trypaanblauw om het aantal levende cellen te bepalen. Tel het aantal cellen dat de kleurstof actief uitsluit met behulp van een hemocytometer.

Breng vervolgens 5.000 tot 6.000 levende cellen in totaal aan in 100 µL C-medium per putje van een 96-wells weefselkweekplaat die vooraf is gecoat met collageen en laminine; voeg 50 ng/mL nerve growth factor toe aan het C-medium. Incubeer dit gedurende de nacht bij 37 °C. Controleer de volgende dag, dag één in vitro of DIV 1, op een goede aanhechting van de neuronen en de groei van enkele axonale projecties.

Vervang het C-medium in de wells door 50 µL neurobasaal medium of NBM bevatttend NGF, Acho en vijf-fluoro-2-doxy-uridine. Vervang het medium rij voor rij om te voorkomen dat de cellen uitdrogen. Incubeer de culturen gedurende vijf dagen bij 37 °C.

Controleer de cultuur dagelijks om de dood van niet-neuronale cellen en de groei van de neuronen te bevestigen. Om dit deel van de procedure op dag zes in vitro te starten, moet worden gecontroleerd of de meeste niet-neuronale ondersteuningscellen zijn geëlimineerd. Het is uiterst belangrijk om onnodige fysieke manipulatie van de neuronen te allen tijde te minimaliseren.

Het verwijderen en vervangen van het medium moet zeer voorzichtig en langzaam gebeuren, anders kan de resulterende mechanische stress de levensvatbaarheid van de neuronen beïnvloeden. Voeg aciclovir of een CV toe aan het bestaande medium in elke put tot een eindconcentratie van 100 micromolar. Voeg een CV langzaam en voorzichtig toe om ervoor te zorgen dat mechanische kracht de cellen op de volgende dag niet negatief beïnvloedt.

Infecteer op DIV zeven de SCG-culturen met een recombinant HSV-1 dat een EGF-reporter tot expressie brengt, gefuseerd aan het virale lytische eiwit US 11, met een multipliciteit van infectie tussen één en twee. Voeg het verdunde virus direct toe aan het bestaande medium in de well. Neem een schijngeïnfecteerde controle en een lytische infectie mee.

Positieve controle in medium zonder CV. Laat de infectie twee tot drie uur voortschrijden bij 37 °C. Vervang vervolgens het infectiemedium door vers NBM met NGF en een CV. Het is van cruciaal belang om uiterst voorzichtig te zijn bij het vervangen van het infectiemedium. Kantel de plaat naar u toe en verwijder langzaam het medium van de bodem van de well.

Richt de tip van de pipet vervolgens op de wand van het putje in plaats van op de bodem en laat het medium voorzichtig over de cellen glijden. Vervang het medium rij voor rij om te voorkomen dat de cellen uitdrogen. Plaats de culturen terug in de incubator en hanteer deze zo voorzichtig mogelijk om te voorkomen dat hun vermogen om HSV one latentie te ondersteunen in gevaar komt.

Houd de culturen zes dagen lang bij 37 °C, gedurende welke tijd het virus latentie zal vestigen. Gebruik tijdens deze periode een fluorescentiemicroscoop om de expressie van us 11 EGFP te monitoren als indicator voor lytische replicatie.

Zoals verwacht mag er geen GFP-expressie zijn in de mock-geïnfecteerde controle. S 11 EGFP moet alleen worden gedetecteerd bij de infectie. Positieve controleputjes zonder CV-behandeling duiden op een succesvolle primaire infectie en productieve lytische replicatie.

Om de reactivatie op DIV 14 te beoordelen, vervangt u voorzichtig het medium dat CV bevat door vers medium zonder CV, zoals eerder beschreven. Richt de pipetpunt op de wand van de put in plaats van op de bodem van de put en laat het medium indien gepast voorzichtig over de cellen glijden. Voeg farmacologische of biologische variabelen toe, zoals LY 2 9 0 0 4 in een concentratie van 20 micromolar.

Er mag geen GFP-expressie worden gedetecteerd in de latent geïnfecteerde culturen die met A CV zijn behandeld. Breng de cellen gedurende een periode van vijf tot zes dagen terug naar 37 °C. Monitor de levende culturen met een fluorescentiemicroscoop om neuronen te detecteren die reactivatie ondergaan.

De reactivatiefrequentie wordt berekend door het aantal wells met EGFP-positieve neuronen te tellen en dit uit te drukken als een fractie van het totale aantal monster-wells. Deze figuur illustreert een voorbeeld waarbij trigger statine, een bekende induceerder van reactivatie, is toegevoegd aan de laat geïnfecteerde SCG-culturen. De reactivatie werd elke dag na de drugbehandeling gedurende een periode van vijf dagen gemonitord en gescoord met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Met TSA bereikt de reactivatie binnen twee dagen 50% van het maximum; na vijf dagen bereikt de reactivatie 60%. De baseline of spontane reactivatie wordt weergegeven door de DMSO. De behandelde controleculturen bedragen in dit experiment ongeveer 10% en variëren doorgaans van vijf tot 20% bij gebruik van dit in vitro systeem. Later werden de geïnfecteerde SCG-culturen ook behandeld met LY 2 9 0 0 4.

Culturen met reactivatie geïnduceerd door LY, een bekende induceerder van reactivatie, werden vergeleken met culturen behandeld met de virale DNA-synthese-remmer PAA, en de twee verbindingen samen, zoals hier wordt geïllustreerd. US 11 EGFP-expressie wordt belemmerd door PAA in culturen die zijn geïnduceerd om te reactiveren met LY 2 9 4 0 0 2, wat aangeeft dat US 11 EGFP-expressie afhankelijk is van virale DNA-replicatie. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om strikt aandacht te besteden aan steriele technieken en de CG-cultuur zo voorzichtig mogelijk te behandelen om verhoogde spontane reactivatie door stress of mechanische bewegingen te voorkomen. Na het volgen van deze procedure om HSV-1 latente infecties in gecultiveerde neuronen te vestigen, kunnen andere methoden zoals shRNA-knockdown en ectopische expressie van wild-type en mutante genverliezen worden uitgevoerd om neuronale functies te karakteriseren die HSV-1 latentie en reactivatie reguleren.

Vergeet niet dat HSV-1 een menselijk pathogeen is waarvoor PSL 2-veiligheidsmaatregelen vereist zijn. U dient bekend te zijn met het werken onder PSL 2-omstandigheden voordat u deze procedure uitvoert. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het opzetten van SCG-culturen voor het induceren van latente HSV-1-infecties en het effectief induceren van reactivatie in de neuronen.