Name: Een primaire Neuron Cultuurstelsel voor de Studie van Herpes Simplex Virus latentie en reactivatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Leer hoe een primair neuronkweeksysteem wordt gebruikt om herpes simplex virus type 1 latentie en reactivatie te bestuderen. Deze methode maakt gedetailleerde analyse van virus-neuroninteracties mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken de reviewers voor hun doordachte suggesties die heeft geholpen bij dit manuscript te verbeteren. Dit werk werd ondersteund door subsidies aan MVC (NS21072, HD23315), ACW (GM61139, S10RR017970) en IM (AI073898, GM056927) van de NIH. MK werd mede ondersteund door een NIH-subsidie ​​training (5T32 AI007180).

<ol><li>Camarena, V., Kobayashi, M., Kim, J. Y., Roehm, P., Perez, R., Gardner, J., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+and+duration+of+growth+factor+signaling+through+receptor+tyrosine+kinases+regulates+HSV-1+latency+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Nature and duration of growth factor signaling through receptor tyrosine kinases regulates HSV-1 latency in neurons.</a> Cell Host & Microbe. 8, 320-330 (2010).</li>
<li>Johnson, M. I. Primary cultures of sympathetic ganglia. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohnson%2C+MI+%22Protocols+for+Neural+Cell+Culture%22">Protocols for Neural Cell Culture</a>. Fedoroff, S., Richardson, A. , 3rd Ed, Humana Press, Inc. Totowa, N.J. 71-94 (2001).</li>
<li>Letourneau, P. C. Preparation of substrata for in vitro culture of neurons. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLetourneau%2C+PC+%22Protocols+for+Neural+Cell+Culture%22">Protocols for Neural Cell Culture</a>. Fedoroff, S., Richardson, A. , 3rd Ed, Humana Press, Inc. Totowa, N.J. 245-254 (2001).</li>
<li>Price, J. P., Brewer, G. J. Serum-free media for neural cell cultures. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPrice%2C+JP+%22Protocols+for+Neural+Cell+Culture%22">Protocols for Neural Cell Culture</a>. Fedoroff, S., Richardson, A. , 3rd Ed, Humana Press, Inc. Totowa, N.J. 255-264 (2001).</li>
<li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlint%2C+SJ+%22Principles+of+virology%22">Principles of virology</a>. , 3rd Ed, ASM Press. (2008).</li>
<li>Roizman, B., Pellett, P. E. The family Herpesviridae: A brief introduction. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoizman%2C+B+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. 2381-2397 (2001).</li>
<li>Price, R. W., Rubenstein, R., Khan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+infection+of+isolated+autonomic+neurons+in+culture%3A+viral+replication+and+spread+in+a+neuronal+network%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Virol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus infection of isolated autonomic neurons in culture: viral replication and spread in a neuronal network.</a> Arch. Virol. 71, 127-140 (1982).</li>
<li>Tomishima, M. J., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+alpha-herpesvirus+protein+necessary+for+axonal+localization+of+viral+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins.</a> J. Cell Biol. 154, 741-752 (2001).</li>
<li>Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+primary+and+transformed+neuronal+cells+for+studying+pseudorabies+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection.</a> Methods Mol. Biol. 292, 299-316 (2005).</li>
<li>Wang, F., Tang, W., McGraw, H. M., Bennett, J., Enquist, L. W., Friedman, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+type+1+glycoprotein+E+is+required+for+axonal+localization+of+capsid%2C+tegument%2C+and+membrane+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus type 1 glycoprotein E is required for axonal localization of capsid, tegument, and membrane glycoproteins.</a> J. Virol. 79, 13362-13372 (2005).</li>
<li>Benboudjema, L., Mulvey, M., Gao, Y., Pimplikar, S. W., Mohr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+the+herpes+simplex+virus+type+1+us11+gene+product+with+the+cellular+kinesin+light-chain-related+protein+PAT1+results+in+the+redistribution+of+both+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Association of the herpes simplex virus type 1 us11 gene product with the cellular kinesin light-chain-related protein PAT1 results in the redistribution of both polypeptides.</a> J. Virol. 77, 9192-9203 (2003).</li>
<li>Blaho, J., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus%3A+propagation%2C+quantification+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus: propagation, quantification and storage.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 14, Unit 14E.1(2005).</li>
<li>Van Zeijl, M., Fairhurst, J., Jones, T. R., Vernon, S. K., Morin, J., LaRocque, J., Feld, B. L., O'Hara, B. L., Bloom, J. D., Johann, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+class+of+thiourea+compounds+that+inhibit+herpes+simplex+virus+type+1+DNA+cleavage+and+encapsidation%3A+resistance+maps+to+the+UL6+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Novel class of thiourea compounds that inhibit herpes simplex virus type 1 DNA cleavage and encapsidation: resistance maps to the UL6 gene.</a> J. Virol. 74, 9054-9061 (2000).</li>
<li>Newcomb, W. W., Brown, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+herpes+simplex+virus+replication+by+WAY-150138%3A+assembly+of+capsids+depleted+of+the+portal+and+terminase+proteins+involved+in+DNA+encapsidation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of herpes simplex virus replication by WAY-150138: assembly of capsids depleted of the portal and terminase proteins involved in DNA encapsidation.</a> J. Virol. 76, 10084-10088 (2002).</li>
<li>Pesola, J. M., Zhu, J., Knipe, D. M., Coen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+1+immediate-early+and+early+gene+expression+during+reactivation+from+latency+under+conditions+that+prevent+infectious+virus+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus 1 immediate-early and early gene expression during reactivation from latency under conditions that prevent infectious virus production.</a> J. Virol. 79, 4516-14525 (2005).</li>
<li>Arthur, J. L., Scarpini, C. G., Connor, V., Lachmann, R. H., Tolkovsky, A. M., Efstathiou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+type+1+promoter+activity+during+latency+establishment%2C+maintenance+and+reactivation+in+primary+dorsal+root+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus type 1 promoter activity during latency establishment, maintenance and reactivation in primary dorsal root neurons in vitro.</a> J. Virol. 75, 3885-3895 (2001).</li>
<li>Danaher, R. J., Jacob, R. J., Steiner, M. R., Allen, W. R., Hill, J. M., Miller, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibitors+induce+reactivation+of+herpes+simplex+virus+type+1+in+a+latency-associated+transcript-+independent+manner+in+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibitors induce reactivation of herpes simplex virus type 1 in a latency-associated transcript- independent manner in neuronal cells.</a> J. Neurovirol. 11, 306-317 (2005).</li>
<li>Terry-Allison, T., Smith, C. A., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relaxed+repression+of+herpes+simplex+virus+type+1+genomes+in+murine+trigenminal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Relaxed repression of herpes simplex virus type 1 genomes in murine trigenminal neurons.</a> J. Virol. 71, 12394-12405 (2007).</li>
<li>Harris, R. A., Preston, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+latency+in+vitro+by+the+herpes+virus+type+1+mutant+in1918%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Establishment of latency in vitro by the herpes virus type 1 mutant in1918.</a> J. Gen. Virol. 72, 907-913 (1991).</li>
<li>Wagner, E. K., Bloom, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+investigation+of+herpes+simplex+virus+latency%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Experimental investigation of herpes simplex virus latency.</a> Clin. Microbiol. Rev. 10, 419-443 (1997).</li>
<li>Strelow, L. I., Laycock, K. A., Jun, P. Y., Rader, K. A., Brady, R. H., Miller, J. K., Pepose, J. S., Leib, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+and+functional+comparison+of+the+latency-associated+transcript+promoters+of+herpes+simplex+virus+type+1+strains+KOS+and+McKrae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">A structural and functional comparison of the latency-associated transcript promoters of herpes simplex virus type 1 strains KOS and McKrae.</a> J. Gen Virol. 75, 2475-2480 (1994).</li>
<li>Stroop, W. G., Banks, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+type+1+strain+KOS-63+does+not+cause+acute+or+recurrent+ocular+disease+and+does+not+reactivate+ganglionic+latency+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus type 1 strain KOS-63 does not cause acute or recurrent ocular disease and does not reactivate ganglionic latency in vivo.</a> Acta Neuropathol. 87, 14-22 (1994).</li>
<li>Sawtell, N. M., Poon, D. K., Tansky, C. S., Thompson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+latent+herpes+simplex+virus+type+1+genome+copy+number+in+individual+neurons+is+virus+strain+specific+and+correlates+with+reactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The latent herpes simplex virus type 1 genome copy number in individual neurons is virus strain specific and correlates with reactivation.</a> J. Virol. 72, 5343-5350 (1998).</li>
<li>Thompson, R. L., Cook, M. L., Devi-Rao, G., Wagner, E. K., Stevens, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+molecular+analysis+of+the+avirulent+wild-type+herpes+simplex+virus+type+1+strain+KOS%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Functional and molecular analysis of the avirulent wild-type herpes simplex virus type 1 strain KOS.</a> J. Virol. 58, 203-211 (1986).</li>
<li>Wilcox, C. L., Smith, R. L., Freed, C. R., Johnson, E. M. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor-dependence+of+herpes+simplex+virus+latency+in+peripheral+sympathetic+and+sensory+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor-dependence of herpes simplex virus latency in peripheral sympathetic and sensory neurons in vitro.</a> J. Neurosci. 10, 1268-1275 (1990).</li>
<li>Roehm, P. C., Camarena, V., Gardner, J. B., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+vestibular+ganglion+neurons+demonstrate+latent+herpes+simplex+type+I+reactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Cultured vestibular ganglion neurons demonstrate latent herpes simplex type I reactivation.</a> Laryngoscope. 121, 2268-2275 (2011).</li>
<li>Kuhn, M. A., Nayak, S., Camarena, V., Gardner, J., Wilson, A., Mohr, I., Chao, M. V., Roehm, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+culture+model+of+facial+palsy+resulting+from+reactivation+of+latent+herpes+simplex+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Otology+%26+Neurotology%22%5BJournal%5D)">A cell culture model of facial palsy resulting from reactivation of latent herpes simplex virus type 1.</a> Otology & Neurotology. , Forthcoming (2012).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Deze primaire neuron cultuur en infectie systeem biedt een eenvoudige en effectieve methode om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen HSV-1 latentie en reactivatie te verkennen. Het systeem trouw recapituleert de algemeen aanvaarde kenmerken van vertraging in de zin van zowel menselijke infecties en in live-diermodellen. Wanneer het virus latent aanwezig in de SCG culturen, kunnen besmettelijke deeltjes en virale lytische genproducten niet worden gedetecteerd. De enige virale genproduct ged...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalog # </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> 70μm nylon filter (cel zeef) </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Balanced Salt 1x Hank&#39;s Solution (HBSS - / -) </td><td> Invitrogen </td><td> 14175 </td><td> w / o CaCl2 en MgCl2 </td></tr><tr><td> 1x Minimum Essential Media (MEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 11095-080 </td><td></td></tr><tr><td> 5-fluor-2&#39;-deoxyuridine </td><td> Sigma </td><td> F0503 </td><td> voor te bereiden 20 mM voorraad in 1x MEM; bewaren bij -20 ° C </td></tr><tr><td> 96-well vlakke bodem en TC platen </td><td> Corning </td><td> 3599 </td><td></td></tr><tr><td> Acyclovir </td><td> &lt;em&gt; Calbiochem </td><td> 114798 </td><td> voor te bereiden 31 mm voorraad in DMSO; bewaren bij -20 ° C </td></tr><tr><td> Aphidicolin </td><td> Calbiochem </td><td> 178273 </td><td> voor te bereiden 10 mM voorraad in DMSO; bewaren bij -20 ° C </td></tr><tr><td> B-27 supplement </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-44 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> Sigma </td><td> C2674 </td><td> voor te bereiden 10 mg / ml bouillon in HBSS - / -; bewaren bij -20 ° C </td></tr><tr><td> D-(+)-Glucose </td><td> Sigma </td><td> G6152 </td><td> voor te bereiden 40% aandelen in H 2 O; filter steriliseren en bewaren bij 4 ° C </td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td><td></td></tr><tr><td> Laminine </td><td> Sigma </td><td> L2020 </td><td> voor te bereiden 1 mg / ml voorraad in H 2O; snel bevriezen 20 uialiquats en bewaren bij -80 ° C, verdund tot 2 mg / ml werken conc. in steriele H2O </td></tr><tr><td> Leibovit&#39;z L-15 media </td><td> Invitrogen </td><td> 11415 </td><td></td></tr><tr><td> Nerve Growth Factor </td><td> Harlan Laboratories </td><td> BT.5017 </td><td> bereiden 50 ug / ml voorraadoplossing in HBSS - / -; bewaren bij -80 ° C </td></tr><tr><td> Neurobasal medium </td><td> Invitrogen </td><td> 12348 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphonoacetic acid (PAA) </td><td> Sigma </td><td> P6909 </td><td> voor te bereiden 75 mg / ml voorraad in H 2 O; bewaren bij -20 ° C </td></tr><tr><td> Poly-D-lysine hydrobromide </td><td> Sigma </td><td> P0899 </td><td> voor te bereiden 20 mg / ml voorraad in H 2 O; bewaren bij -20 ° C </td></tr><tr><td> Rat-tail collageen </td><td> Millipore </td><td> 08-115 </td><td>Concentratie is afhankelijk van het aanbod veel; bewaren bij 4 ° C en verdund tot 0,66 mg / ml werken conc. in steriele H2O </td></tr><tr><td> Trichostatine A </td><td> Sigma </td><td> T8552 </td><td> voor te bereiden 1 mM voorraad in DMSO; bewaren bij -20 ° C </td></tr><tr><td> Trypsine 2,5% </td><td> Invitrogen </td><td> 15090-04 </td><td></td></tr></tbody></table>

een primaire neuron cultuurstelsel voor de studie van herpes simplex virus latentie en reactivatie

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) wordt een leven lang latente infectie in de perifere neuronen. Dit latente reservoir is de bron van terugkerende reactivering gebeurtenissen te verzekeren dat de en bijdragen aan klinische ziekte. De huidige antivirale middelen hebben geen invloed op de latente reservoir en er zijn geen vaccins. Terwijl de moleculaire details van lytische replicatie zijn goed gekarakteriseerd, mechanismen die de latentie in neuronen blijven ongrijpbaar. Onze huidige kennis van latentie is afgeleid van in vivo studies met kleine diermodellen, die zijn onmisbaar voor het definiëren van virale gen-eisen en de rol van de immuunrespons. Het is echter niet te onderscheiden specifieke effecten op het virus neuron relatie van meer algemene gevolgen van infectie gemedieerd door immuun-of niet-neuronale ondersteuning cellen in levende dieren. Daarnaast dierproeven is kostbaar, tijdrovend, en beperkt in termen van beschikbare opties voor het manipuleren van gastheerprocessen. Om deze beperkingen te overwinnen, is een neuron-only systeem hard nodig dat reproduceert de in vivo eigenschappen van latentie en reactivatie, maar biedt de voordelen van weefselkweek op het gebied van homogeniteit en toegankelijkheid. Hier presenteren we een in vitro model gebruik te maken van gekweekte primaire sympathische neuronen van de rat superieure cervicale ganglia (SCG) (figuur 1) tot HSV-1 latentie en reactivatie dat past studie zijn de meeste zo niet alle van de gewenste criteria. Na verwijderen van niet-neuronale cellen, nagenoeg homogene TrkA + neuron kweken geïnfecteerd met HSV-1 in aanwezigheid van acyclovir (ACV) tot lytische replicatie onderdrukken. Na ACV verwijdering, niet-productieve HSV-1 infecties die trouw vertonen aanvaarde kenmerken van latency op efficiënte wijze vastgesteld. Met name lytische mRNAs, eiwitten en infectieuze virus meer detecteerbaar, zelfs in de afwezigheid van selectie, maar latentie-geassocieerde transcript (LAT) expression blijft in neuronale kernen. Virale genomen worden gehandhaafd op gemiddeld aantal kopieën van 25 per neuron en kan worden geïnduceerd om productief te repliceren door te interfereren met PI3-kinase / Akt signalisatie of de eenvoudige intrekking van zenuwgroeifactor 1. Een recombinant HSV-1 codering EGFP gefuseerd met het virale eiwit US11 lytische zorgt voor een functionele, real-time marker voor replicatie voortvloeien uit de reactivering die gemakkelijk wordt gekwantificeerd. Naast chemische behandelingen kunnen genetische methoden zoals RNA-interferentie of genafgifte via lentivirale vectoren succes worden toegepast op het systeem waarmee mechanistische studies die zeer moeilijk, zo niet onmogelijk, bij dieren. Kortom, de SCG op basis van HSV-1 latency / reactivering systeem zorgt voor een krachtige, noodzakelijk instrument om de moleculaire mechanismen die HSV1 latentie en reactivatie in neuronen, van oudsher een puzzel in de virologie waarvan de oplossing kan nieuwe inzichten bieden in het ontwikkelen van nieuwe therapieën die te ontrafelen doelstelling thij latent herpesvirus reservoir.

Het protocol beschrijft een efficiënt en reproduceerbaar modelsysteem om te studeren herpes simplex virus type 1 (HSV-1) latentie en reactivatie. De test maakt gebruik van homogene sympathiek neuron culturen en maakt het mogelijk om moleculaire dissectie van virus-neuron interacties met behulp van een scala aan hulpmiddelen met inbegrip van RNA-interferentie en expressie van recombinante eiwitten.

Een primaire Neuron Cultuurstelsel voor de Studie van Herpes Simplex Virus latentie en reactivatie

Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) veroorzaakt een levenslange latente infectie in perifere neuronen. Dit latente reservoir is de bron van recurrente ...

Het doel van dit experiment is om aan te tonen hoe een primair neuronale celculturesysteem kan worden gebruikt om de latentie en reactivatie van het herpes simplexvirus te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst neuronen van de superieure cervicale ganglia te isoleren uit RA-embryo's en de neuronen uit gedissocieerde ganglia te cultureren na eliminatie van niet-neuronaire cellen. Een latente HSV-infectie wordt tot stand gebracht door neuronen te infecteren met een EGFP-virus in aanwezigheid van een remmer van lytische replicatie.De volgende stap is het induceren van de reactivatie van de latent geïnfecteerde culturen. Ten slotte wordt de efficiëntie van de reactivatie beoordeeld door de expressie van EGFP in de loop van de tijd te monitoren. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die aantonen hoe verschillende neuronale signaleringspaden de latentie en reactivatie van het herpes simplexvirus reguleren door middel van het gebruik van chemische inhibitoren, RNA-interferentie en genoverdracht.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat het gedetailleerde studies mogelijk maakt naar de interacties die de latentie van herpes simplex

a-primary-neuron-culture-system-for-study-herpes-simplex-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Werkwijze voor het traceren van synaptisch verbonden neuronen beschreven. We maken gebruik van TVA specificiteit van een upstream cel te peilen of een cel populatie van belang synaptische input van genetische gedefinieerde celtypes ontvangt.

Virale Tracing van genetische gedefinieerde neurale circuits

De meeste studies van de herpes ziekte van het hoornvlies gebruik maken van een primaire infectie model. Echter, primaire infectie met HSV-1 gewoonlijk niet tot menselijke ziekte. Hier beschrijven we een terugkerende herpes model van ziekte van het hoornvlies, die beter nabootst menselijke ziekte.

Terugkerende Herpetische Stroma Keratitis in Muizen, een model voor het bestuderen van de Mens HSK

Source: Nguyen, H., et al. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates the propagation and harvesting of oncolytic herpes simplex virus in mammalian cell cultures, highlighting viral entry, replication, and the recovery of virus-loaded cells. It further shows methods for preserving infected cells for downstream processing.

Propagation and Harvesting of Oncolytic Herpes Simplex Virus in Mammalian Cells

Bron: Dembowski, J. A., Deluca, N. A. Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins. J. Vis. Exp. (2017)Deze video demonstreert de infectie van zoogdiercellen in de stationaire fase met HSV-1 (Herpes Simplex Virus-1), gevolgd door replicatie van het virale genoom met behulp van de replicatiemachinerie van de gastheer en van het virus. Een synthetisch nucleoside-analoog wordt ingebouwd in nieuw gesynthetiseerd viraal DNA om replicerende genomen te...

Labeling van replicerende HSV-1-genomen met een nucleoside-analoog

Live cell imaging van alphaherpes virusinfecties maakt analyse van de dynamische gebeurtenissen van gerichte transport en intercellulaire verspreiding. Hier presenteren we methodieken die recombinante virale stammen die fluorescerende fusie-eiwitten tot visualisatie van virale assemblages tijdens infectie van primaire neuronen te faciliteren.

Live cell imaging van Alphaherpes Virus Anterograad Transport en Spread

We hebben een fluorescente in situ hybridisatie protocol voor de detectie van een persistente DNA virusgenoom in weefselcoupes van diermodellen. Dit protocol maakt het bestuderen infectie proces codetection van het virale genoom, zijn RNA producten en virale of cellulaire eiwitten in enkele cellen.

Detectie van het genoom en de transcripties van een persistente DNA Virus in neuronale weefsels door Fluorescent In situ Hybridisatie Gecombineerd met Immunokleuring

De huid is een doelwitweefsel van het humane pathogeen herpes simplex-virus type 1 (HSV-1). Om de invasieroute van HSV-1 in weefsel te onderzoeken, hebben we een ex vivo infectiemodel opgezet van muis-epidermale vellen die de buitenste laag van de huid vertegenwoordigen.

Ex Vivo Infectie van Muizen Epidermis met Herpes simplex virus type 1

Het is van cruciaal belang in de neurobiologie en neurovirologie om een betrouwbaar, reproduceerbaar in vitro systeem te hebben dat dient als een translationeel model voor wat zich in vivo in menselijke neuronen voordoet. Dit protocol beschrijft hoe SH-SY5Y humane neuroblastomacellen te kweken en te differentiëren in levensvatbare neuronen voor gebruik in in vitro toepassingen.

Differentiatie van de SH-SY5Y Human Neuroblastoom Cell Line

In dit verslag zijn de voordelen van organotypic culturen en gedissocieerde primaire culturen van muis-afgeleide dorsal root ganglia gemarkeerd om te onderzoeken van een breed scala van mechanismen die zijn gekoppeld aan neuron-gliale interactie, Neuroplasticiteit, neuroinflammation, en reactie op virale infectie.

Volwassen muis DRG Explant en losgekoppeld van cel modellen om te onderzoeken Neuroplasticiteit en reacties op milieu beledigingen, met inbegrip van de virale infectie

Een hoge doorvoersnelheid protocol voor functionele beoordeling van efficiënte reactivering van HIV en de ontmijning van latente proviruses is beschreven en toegepast door het testen van het effect van interventies op HIV transcriptie, egaliseren en lamineren. Representatieve resultaten van het effect van latentie omkering van agenten op LTR-gedreven transcriptie, egaliseren en lamineren zijn verstrekt.

High Throughput In Vitro beoordeling van latentie omkering van agenten op HIV transcriptie, egaliseren en lamineren

Dit protocol beschrijft een in vitro systeem om de novo lytische infectie van Kaposi's sarcoom-geassocieerd herpesvirus te modelleren met behulp van BAC16-afgeleide virionen. De methode maakt onderzoek mogelijk naar vroege virale replicatie en verspreiding. De productie van infectieuze virussen wordt gekwantificeerd door op GFP gebaseerde tests van infectieuze eenheden en real-time PCR van ingekapselde virale genomen.

Vaststelling en kwantificering van de novo lytische infectie door celvrij Kaposi's sarcoom-geassocieerd herpesvirus

Leer hoe een primair neuronkweeksysteem wordt gebruikt om herpes simplex virus type 1 latentie en reactivatie te bestuderen. Deze methode maakt gedetailleerde analyse van virus-neuroninteracties mogelijk.

Een primaire Neuron Cultuurstelsel voor de Studie van Herpes Simplex Virus latentie en reactivatie

Meer video's verkennen