Kweken en Toepassingen van Rotating muur Schip Bioreactor Afgeleid 3D epitheelcellen modellen

Dit niet-conventionele protocol presenteert een eenvoudig en robuust systeem voor het kweken van menselijke epitheelcellen tot organotypische 3D-modellen die het menselijke in vivo weefsel nabootsen. Eerst worden epitheelcellen gekweekt tot een confluente monolaag in een weefselkweekfles en geoogst, om vervolgens te worden gecombineerd met microcarrier-beads in de STLV-bioreactor. Door de STLV op het platform te roteren wordt een constante vrije-valomgeving met een lage vloeistofschuifspanning gecreëerd, waardoor de cellen zich aan de beads kunnen hechten en groeien en na 96 uur en vervolgens ongeveer elke dag daarna cellulaire aggregaten vormen.

Vul het medium in de SDLV aan om te voorzien in het cellulaire metabolisme bij de vorming van aggregaten. Maak wekelijks afbeeldingen van de monsters met lichtmicroscopie om de ontwikkelingsvoortgang te monitoren zodra de volledige aggregaatvorming en cellulaire differentiatie heeft plaatsgevonden. Zaai de aggregaten uit voor downstream experimentele analyse en assays. Uiteindelijk kan dit systeem in vivo-achtige organotypische model systemen genereren voor een veelvoud aan wetenschappelijke onderzoeken.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals conventionele celkweek, is dat de epitheelcellen differentiëren en polariseren tot weefselachtige aggregaten, waardoor ze morfologisch en functioneel vergelijkbaar reageren met authentiek menselijk weefsel. Dit 3D-model biedt verder inzicht in de biologie van epitheelcellen, interacties tussen gastheer en pathogeen en het complexe samenspel tussen celtypen die in het systeem kunnen worden geïntroduceerd. Dr. Andrea Radkey.

Een postdoc in mijn laboratorium zal nu deze procedure demonstreren om de langzaam draaiende laterale vat-bioreactor te detoxificeren. Dek de open poorten af met lure-doppen. Vul de STLV met 95% ethanol en laat dit 24 uur lang equilibreren.

Verwijder de ethanol, vul vervolgens met gesteriliseerd gedestilleerd water en incubeer gedurende 24 uur met behulp van de door de leverancier verstrekte instrumenten; draai alle schroeven los en verwijder de centerplug uit de STLV. Plaats deze in een sterilisatiezak en autoclaveer bij 110 °C gedurende 20 minuten. Zet de STLV weer in elkaar en herhaal de detoxificatie om de steriliteit te waarborgen.

Draai vervolgens de schroeven van de STLV aan. Bevestig de vooraf gesteriliseerde eenrichtingsstopkraan aan elke poort. Verwijder nu de zuigers uit een lure lock-spuit van 10 milliliter en vijf milliliter en bewaar de zuigers in de verpakkingen.

Om de steriliteit te waarborgen, worden de spuiten op de stopkraan geschroefd. Voeg vervolgens DPBS toe aan de spuit van 10 milliliter totdat de STLV vol is en de spuit van vijf milliliter begint te vullen. Plaats daarna de steriele zuigers terug in elke spuit en verwijder eventuele resterende luchtbellen in de bioreactor door afwisselend de zuigers van de spuiten aan te drijven.

Sluit de stopkranen en bevestig de STLV aan het roterende verticale platform. Rotateer gedurende minimaal 24 uur om te controleren op lekken in een conische buis van 50 milliliter. Voeg 15 milliliters DPBS toe aan 250 milligrams cytodex microcar beads en autocleaveer na afkoeling.

Verwijder de DPBS-wasbeurt drie keer met kweekmedium voor de epitheelcellen. Draai de buis om de beads opnieuw te suspenderen. Suspendeer de beads vervolgens opnieuw in 15 milliliters kweekmedium.

Kweek eerst 1 x 10⁷ epitheelcellen als monolagen in weefselkweekflessen. Oogst de cellen, tel ze en bepaal de cellulaire levensvatbaarheid via trypanblauw-uitsluitingskleuring, en voeg de cellen vervolgens toe aan de geprepareerde beads.

Spoel de conische buis om ervoor te zorgen dat alle cellen zijn overgebracht. Verwijder vervolgens de DPBS en de spuiten uit de STLV. Verwijder daarnaast de plug uit de centrale poort met behulp van een serologische pipet van 10 milliliter.

Laad de suspensie van epitheelcelkraaltjes in de STLV. Spoel de conische buis één keer om alle cellen en kraaltjes over te dragen. Plaats vervolgens de stop van de centrale poort terug.

Verwijder vervolgens de zuigers uit een spuit van 5 mL en een spuit van 10 mL en bewaar de zuigers in de verpakkingen. Om de steriliteit te behouden, worden de aansluitingen van de spuiten voorzien van open stopkranen. Vul de STLV met medium.

Vervang de zuigers en sluit de stopkraan. Laat de vers gezaaide STLV-cultuur nu 30 minuten equilibreren in een incubator van 37 °C zonder rotatie. Open de stopkraan nadat de STLV uit de incubator is gehaald.

Verwijder eventuele bellen met behulp van de zuigers en sluit de stopkraan. Stel vervolgens de STLV in de incubator in op continue rotatie bij 20 RPM. Vervang na 96 tot 120 uur het medium door de spuiten te verwijderen en beide stopkranen van de STLV te openen, zodat de kralen en cellen kunnen bezinken.

Zodra het is bezonken, giet dan ongeveer 75% van het medium af via de zijpoort met behulp van de spuiten om het voedingsprotocol uit te voeren. Blijf daarnaast het medium aanvullen naar behoefte, afhankelijk van het cellulaire metabolisme. Controleer tevens elke vijf tot zeven dagen de groei en levensvatbaarheid van de aggregaten.

Om het afscheren van aggregaten te voorkomen, gebruikt u een pipetpunt van 1000 µL die ongeveer twee centimeter vanaf de punt is afgeknipt en is gesteriliseerd. Verwijder voorzichtig 200 µL aggregaten uit de centrale poort en verdeel deze over twee buisjes van 1,5 mL. Gebruik één aliquot voor het monitoren van de cellevensvatbaarheid. Nadat de cellen van de beads zijn gescheiden, evalueert u de levensvatbaarheid via trypanblauw-exclusie.

Kleuring voor beeldvorming van cellulaire aggregaten. Voeg 0,5 tot één milliliter medium toe aan de tweede 1,5 milliliter aliquot aggregaten en overbreng naar een kleine Petrischaal met behulp van een afgeknotte 1000 microliter pipetpunt voor de beeldvorming van aggregaten.

Bij het gebruik van een omgekeerde lichtmicroscoop voor sommige epitheliale celmodellen is het noodzakig om de aggregaten ongeveer één week voor het oogsten over te brengen naar een wegwerphalve om de beluchting van de cultuur te verbeteren. Verwijder voor de analyse de spuiten uit de STLV en giet ongeveer 50% van het medium via de zijpoort af. Verwijder de centrale dop en giet voorzichtig alle inhoud via de centrale poort in een conische buis van 50 milliliter.

Spoel de STLV tweemaal met vijf milliliter medium en voeg de spoelvloeistoffen samen met de geoogste aggregaten. Breng vervolgens de aggregaten over van de conische buis van 50 milliliter naar de Harv. Oog na één week voorzichtig aggregaten voor potentiële assay-formaten, assays en analyses waarbij gedifferentieerde humane epitheliale aggregaten zijn gekweekt in het STLV-bioreactorsysteem.

De SEM- en TEM-beelden zijn verzameld van menselijke vaginale cellen die gedurende 39 dagen in de STLV zijn gekweekt. Let op dat de 3D-aggregaten ultrastructurele kenmerken vertonen die vergelijkbaar zijn met weefsels: de microruggen, invaginaties, intracellulaire secretoire blaasjes en microvilli op het apicale oppervlak. Confocale immunofluorescentiemicroscopiebeelden van 3D-vaginale cellen duiden op de expressie van mucine en markers die specifiek zijn voor epitheelcellen en terminale differentiatie. Fysiologisch relevante fenotypen dienen daarnaast als een uitstekend platform voor het evalueren van de toxiciteit van verbindingen.

De MTT-assay, een veelgebruikte analyse om cellevensvatbaarheid, metabolisme of proliferatie te meten, kan worden gebruikt om de toxiciteit van diverse chemicaliën en verbindingen te bepalen. Alternatief kan de toxiciteit na behandeling met testverbindingen worden gemeten via trypan blue-exclusie. In dit voorbeeld vertoonden de vaginale aggregaten na behandeling met NONOXINOL nine een toxiciteitsrespons die vergelijkbaar was met die van cervicale X-explantmodellen, maar een ander profiel in vergelijking met monolagen.

De 3D-aggregaten zijn functioneel responsief, bijvoorbeeld bij stimulatie met moleculen afgeleid van microben die worden herkend door de toll-like receptoren. De aggregaten reageren en scheiden pro-inflammatoire cytokinen uit, waaronder IL six eiwit en transcriptexpressie van de progesteronreceptor. Een receptor die reageert op hormoonstimulatie kan ook worden waargenomen in de vaginale cellen.

De 3D-aggregaten hebben niet alleen het vermogen om te reageren op pathogeen- en hormoonmoleculen, maar zijn ook in staat om functioneel een infectie met herpes simplex virus type 2 te ondersteunen. Een confocale microscopie-afbeelding van HSV-2-geïnfecteerde 3D-vaginale aggregaten demonstreert de infectie. De fysieke en functionele eigenschappen van individuele cellen binnen de aggregaten kunnen ook worden gekwantificeerd via flowcytometrie, zoals een flowcytometrie-assay om de oppervlakte-expressie van mucin 1 op individuele vaginale cellen te meten.

De 3D vaginale aggregaten vertoonden na hun ontwikkeling een lager percentage mucine 1 op hun oppervlak in vergelijking met monolagen. Deze techniek stelde onderzoekers in de velden van de weefselbiologie en infectieziekten in staat om de structuur en fysiologische reacties op stimuli te bestuderen. Door gebruik te maken van deze organotypische modellen kunnen we de menselijke biologie beter nabootsen.