Name: Kweken en Toepassingen van Rotating muur Schip Bioreactor Afgeleid 3D epitheelcellen modellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Ontdek een roterend bioreactorsysteem voor het kweken van 3D epitheelcelaggregaten die menselijk weefsel nabootsen. Deze methode ondersteunt onderzoek naar weefselbiologie en infectieziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Brooke Hjelm bedanken voor haar technische expertise en Andrew Larsen voor zijn eiwit analyse. Dit werk werd deels gefinancierd door de Alternatives Research Development Foundation (MMHK) Grant en de NIH NIAID seksueel overdraagbare infecties en Topical Microbiciden Cooperative Research Center IU19 AI062150-01 (MMHK). Steeds meer industrieën herkennen Biologie van kopieën voor hergebruik van cijfers.

<ol><li>Herbst-Kralovetz, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+comparison+of+toll-like+receptor+expression+and+responsiveness+in+primary+and+immortalized+human+female+lower+genital+tract+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Quantification and comparison of toll-like receptor expression and responsiveness in primary and immortalized human female lower genital tract epithelia.</a> Am. J. Reprod. Immunol. 59 (3), 212-224 (2008).</li>
<li>Hjelm, B. E., Berta, A. N., Nickerson, C. A., Arntzen, C. J., Herbst-Kralovetz, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+three-dimensional+organotypic+human+vaginal+epithelial+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a three-dimensional organotypic human vaginal epithelial cell model.</a> Biol. Reprod. 82, 617-627 (2009).</li>
<li>Bibliography of Research Publications [Internet]. , Synthecon. Houston, Texas. Available from: 
		
	 <a target="_blank" href="http://www.synthecon.com/bibliography.html">http://www.synthecon.com/bibliography.html</a> (2012).</li>
<li>Khaoustov, V. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+three-dimensional+assembly+of+human+liver+cells+by+simulated+microgravity%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev.+Biol.+Anim%22%5BJournal%5D)">Induction of three-dimensional assembly of human liver cells by simulated microgravity.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 35, 501-509 (1999).</li>
<li>Papadaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+of+functional+cardiac+muscle%3A+molecular%2C+structural%2C+and+electrophysiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering of functional cardiac muscle: molecular, structural, and electrophysiological studies.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 280, 168-178 (2001).</li>
<li>Ishikawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+hepatic+tissue+architectures+from+fetal+liver+cells+obtained+from+a+three-dimensional+culture+with+a+rotating+wall+vessel+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of hepatic tissue architectures from fetal liver cells obtained from a three-dimensional culture with a rotating wall vessel bioreactor.</a> J. Biosci. Bioeng. 111, 711-718 (2011).</li>
<li>Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+tissue+culture+model+for+the+study+of+attach+and+efface+lesion+formation+by+enteropathogenic+and+enterohaemorrhagic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli.</a> Cell Microbiol. 7, 1771-1781 (2005).</li>
<li>Nickerson, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tissue+assemblies%3A+novel+models+for+the+study+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis.</a> Infection and Immunity. 69, 7106-7120 (2001).</li>
<li>Honer zu Bentrup, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+organotypic+models+of+human+colonic+epithelium+to+study+the+early+stages+of+enteric+salmonellosis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis.</a> Microbes Infect. 8, 1813-1825 (2006).</li>
<li>Carterson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A549+lung+epithelial+cells+grown+as+three-dimensional+aggregates%3A+alternative+tissue+culture+model+for+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> Infection and Immunity. 73, 1129-1140 (2005).</li>
<li>Smith, Y. C., Grande, K. K., Rasmussen, S. B., O'Brien, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+three-dimensional+organoid+model+for+evaluation+of+the+interaction+of+uropathogenic+Escherichia+coli+with+terminally+differentiated+human+urothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Novel three-dimensional organoid model for evaluation of the interaction of uropathogenic Escherichia coli with terminally differentiated human urothelial cells.</a> Infection and Immunity. 74, 750-757 (2006).</li>
<li>Sainz, B., TenCate, V., Uprichard, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+Huh7+cell+culture+system+for+the+study+of+Hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional Huh7 cell culture system for the study of Hepatitis C virus infection.</a> Virol J. 6, 103(2009).</li>
<li>Duray, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+human+tissue+ex+vivo+by+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Invasion of human tissue ex vivo by Borrelia burgdorferi.</a> J. Infect Dis. 191, 1747-1754 (2005).</li>
<li>Margolis, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+trafficking+and+HIV+infection+of+human+lymphoid+tissue+in+a+rotating+wall+vessel+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res.+Hum.+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte trafficking and HIV infection of human lymphoid tissue in a rotating wall vessel bioreactor.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 13, 1411-1420 (1997).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hyg%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> Am. J. Hyg. 27, 493-497 (1938).</li>
<li>Beer, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+preclinical+testing+of+nonoxynol-9+as+potential+anti-human+immunodeficiency+virus+microbicide%3A+a+retrospective+analysis+of+results+from+five+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vitro preclinical testing of nonoxynol-9 as potential anti-human immunodeficiency virus microbicide: a retrospective analysis of results from five laboratories.</a> Antimicrob Agents Chemother. 50, 713-723 (2006).</li>
<li>Hickey, D. K., Patel, M. V., Fahey, J. V., Wira, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+adaptive+immunity+at+mucosal+surfaces+of+the+female+reproductive+tract%3A+stratification+and+integration+of+immune+protection+against+the+transmission+of+sexually+transmitted+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate and adaptive immunity at mucosal surfaces of the female reproductive tract: stratification and integration of immune protection against the transmission of sexually transmitted infections.</a> J. Reprod. Immunol. 88, 185-194 (2011).</li>
<li>Andersch-Bjorkman, Y., Thomsson, K. A., Holmen Larsson, J. M., Ekerhovd, E., Hansson, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+scale+identification+of+proteins%2C+mucins%2C+and+their+O-glycosylation+in+the+endocervical+mucus+during+the+menstrual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Large scale identification of proteins, mucins, and their O-glycosylation in the endocervical mucus during the menstrual cycle.</a> Mol. Cell Proteomics. 6, 708-716 (2007).</li>
<li>Barrila, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture+models%3A+Innovative+platforms+for+studying+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">3D cell culture models: Innovative platforms for studying host-pathogen interactions.</a> Nature Reviews Microbiology. 8, 791-801 (2010).</li>
<li>Vamvakidou, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+breast+tumoroids%3A+An+in+vitro+assay+for+investigating+cellular+heterogeneity+and+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous breast tumoroids: An in vitro assay for investigating cellular heterogeneity and drug delivery.</a> J. Biomol Screen. 12, 13-20 (2007).</li>
<li>Jin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+three-dimensional+tissue-engineered+bone+constructs+under+microgravity-simulated+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Artif+Organs%22%5BJournal%5D)">Establishment of three-dimensional tissue-engineered bone constructs under microgravity-simulated conditions.</a> Artif Organs. 34, 118-125 (2010).</li>
<li>Vertrees, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+three-dimensional+model+of+lung+cancer+using+cultured+transformed+lung+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Development of a three-dimensional model of lung cancer using cultured transformed lung cells.</a> Cancer Biol Ther. 8, 356-365 (2009).</li>
<li>Hwang, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+murine+embryonic+stem+cells%2C+alginate+encapsulation%2C+and+rotary+microgravity+bioreactor+in+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of murine embryonic stem cells, alginate encapsulation, and rotary microgravity bioreactor in bone tissue engineering.</a> Biomaterials. 30, 499-507 (2009).</li>
<li>Pei, M., He, F., Kish, V. L., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+functional+cartilage+tissue+using+stem+cells+from+synovial+lining%3A+a+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering of functional cartilage tissue using stem cells from synovial lining: a preliminary study.</a> Clin. Orthop Relat. Res. 466, 1880-1889 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Gebruik van de RWV bioreactor-technologie hier gepresenteerd kunnen onderzoekers de mogelijkheid om hun huidige celcultuur verder te gaan naar een meer fysiologisch relevante organotypische celkweek model. De RWV bioreactor celkweek systeem zorgt voor een lage shear micro-omgeving die cellen in staat stelt om 3-D cellulaire aggregaten te vormen met in vivo-achtige kenmerken, met inbegrip tight junctions, mucine de productie, de extracellulaire processen (dwz microvilli), en cellulaire polariteit. Het merendeel ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Invitrogen </td><td> A21131 </td><td> Gebruikt bij 1:500 verdunning </td></tr><tr><td> FACSDiva </td><td> BD </td><td></td><td> Flowcytometer </td></tr><tr><td> β-tublin antilichaam </td><td> Calbiochem </td><td> 654162 </td><td> Gebruikt op 1:5000 verdunning </td></tr><tr><td> Bio-Plex 2000 </td><td> BioRad </td><td> 171-000205 </td><td> v5 software </td></tr><tr><td> Bioreactor en componenten </td><td> Synthecon </td><td> RCC-4 </td><td></td></tr><tr><td> Cell zeef </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td><td> 40 pm poriegrootte </td></tr><tr><td> Conische buis (50 ml) </td><td> Corning </td><td> 5-538-60 </td><td></td></tr><tr><td> Dekglaasjes </td><td> VWR </td><td> 48366067 </td><td></td></tr><tr><td> Cytokine bead array kits </td><td> BioRad </td><td> Aangepast menselijke kit </td><td></td></tr><tr><td> Cytodex kralen </td><td> Sigma </td><td> C3275 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> ED-500G </td><td> Ethyleendiaminetetraazijnzuur </td></tr><tr><td> Epitheliale specifieke antilichaam (ESA) </td><td> Chemicon </td><td> CBL251 </td><td> Gebruikt om 1:50 verdunning </td></tr><tr><td> Foetaal runderserum (FBS) </td><td> Gibco </td><td> 10438 </td><td> Hitte geïnactiveerd </td></tr><tr><td> HARV (wegwerp) </td><td> Synthecon </td><td> D-405 </td><td></td></tr><tr><td> Zoutzuur </td><td> Sigma </td><td> 258148 </td><td> 37% </td></tr><tr><td> Involucrine antilichaam </td&gt; <td> Sigma </td><td> Ik 9018 </td><td></td></tr><tr><td> Objectglaasjes </td><td> VWR </td><td> 16004-368 </td><td></td></tr><tr><td> MTT reagens </td><td> MP Biomedicals, LLC </td><td> 194592 </td><td> 3 - (4,5-Dimethylthiazolyl 1-2) -2,5-difenyl tetrazolium Bromide </td></tr><tr><td> MUC1 antilichaam (microscopie) </td><td> Santa Cruz </td><td> Sc-7313 </td><td> Gebruikt om 1:50 verdunning </td></tr><tr><td> MUC1 antilichaam (flowcytometrie) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559774 </td><td> Ook wel CD227, gebruik 20μL per test </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> Elektronen Microscopie Wetenschappen </td><td> 15710 </td><td> Verdund tot 4% in DPBS </td></tr><tr><td> Petrischaal (klein) </td><td> BD Falcon </td><td> 353002 </td><td></td></tr><tr><td> Polystyreen buis filter </td><td> BD Falcon </td><td> 352235 </td><td></td></tr><tr><td&gt; Polystyreen stijgbuis </td><td> BD Falcon </td><td> 352058 </td><td></td></tr><tr><td> PR antilichaam </td><td> DAKO </td><td> M3569 </td><td> Gebruikt bij 1:100 verdunning </td></tr><tr><td> ProLong Gold </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td> Montage media met DAPI </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74903 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfaat </td><td> Sigma </td><td> 71725 </td><td></td></tr><tr><td> Sterilisatie zakje </td><td> VWR </td><td> 11213-035 </td><td></td></tr><tr><td> Kranen (enkele reis) </td><td> Medex </td><td> MX5061L </td><td></td></tr><tr><td> Spuit (10 ml) </td><td> BD </td><td> 309604 </td><td> Luer-lock tip </td></tr><tr><td> Spuit (5 ml) </td><td> BD </td><td> 309603 </td><td> Luer-lock tip </td></tr><tr><td> Trypaan blauw </td><td> Invitrogen </td><td>T10282 </td><td></td></tr><tr><td> Vp5 antilichaam </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-13525 </td><td> HSV-2 antilichaam Clone 6F10; gebruikt bij 1:5000 verdunning </td></tr></tbody></table>

kweken en toepassingen van rotating muur schip bioreactor afgeleid 3d epitheelcellen modellen

Culturing and Applications of Rotating Wall Vessel Bioreactor Derived 3D Epithelial Cell Models

Cellen en weefsels in het lichaam ervaring milieu-omstandigheden die hun architectuur beïnvloeden, intercellulaire communicatie, en de algemene functies. Voor in vitro celcultuur modellen om nauwkeurig na te bootsen het weefsel van belang, de groei omgeving van de cultuur is een cruciaal aspect om te overwegen. Veel gebruikte conventionele celkweek systemen verspreiden epitheliale cellen op een vlakke twee-dimensionale (2-D) ondoordringbare oppervlakken. Hoewel er veel is geleerd van de conventionele celkweek systemen, veel bevindingen zijn niet reproduceerbaar in de menselijke klinische proeven of weefselexplantaten, mogelijk als gevolg van het ontbreken van een fysiologisch relevante micro-omgeving. Hier wordt beschreven een teeltsysteem dat vele van de cultuur toestand grenzen van 2-D celculturen overwint met de innovatieve roterende wand vat (RWV) bioreactor technologie. Wij en anderen hebben aangetoond dat organotypische RWV-afgeleide modellen kunnen structureel samen te vattene, functie, en authentieke menselijke reacties op externe stimuli op dezelfde wijze als de mens explant weefsels 1-6. De RWV bioreactor is een suspensiekweek systeem dat zorgt voor de groei van epitheelcellen onder lage fysiologische vloeistof schuifkracht. De bioreactoren in twee verschillende formaten, een hoge aspect roterend vat (HARV) of een langzaam draaiende laterale vat (STLV), waarin zij verschillen van de beluchting bron. Epitheelcellen worden toegevoegd aan de bioreactor keuze in combinatie met poreus collageen beklede parels microdrager (figuur 1A). De cellen gebruiken de korrels als groei steiger tijdens de constante vrije val in de bioreactor (figuur 1b). De micro-omgeving die door de bioreactor kan de cellen aan drie-dimensionale (3-D) aggregaten het weergeven van in vivo-achtige kenmerken vormen vaak niet waargenomen onder standaard 2-D kweekomstandigheden (figuur 1D). Deze kenmerken zijn onder andere tight junctions, mucons productie, apicale / basale oriëntatie, in vivo eiwit lokalisatie, en extra epitheliale cel-type specifieke eigenschappen. De overgang van een monolaag van epitheelcellen een volledig gedifferentieerde 3-D totale varieert afhankelijk celtype 1 7-13. Periodieke bemonstering van de bioreactor zorgt voor monitoring van epitheliale totale formatie, cellulaire differentiatie markers en levensvatbaarheid (figuur 1D). Zodra celdifferentiatie en gaatvorming wordt vastgesteld, worden de cellen geoogst uit de bioreactor en soortgelijke assays uitgevoerd op 2-D cellen kunnen worden op de 3-D aggregaten met een paar overwegingen (figuur 1E-G). In dit werk beschrijven we gedetailleerde stappen van hoe cultuur 3-D-epitheliale cel aggregaten in de RWV bioreactor en een verscheidenheid van potentiële testen en analyses die kunnen worden uitgevoerd met de 3-D aggregaten. Deze analyses omvatten, maar zijn niet beperkt tot, structurele / morphological analyse (confocale, scanning en transmissie elektronenmicroscopie), cytokine / chemokine secretie en cell signaling (cytometrische bead array en Western blot analyse), de analyse van genexpressie (real-time PCR), toxicologische / Analyse van Geneesmiddelen en gastheer-pathogeen interacties. Het gebruik van deze testen het fundament gelegd voor meer diepgaande en uitgebreide studies zoals metabolomics, transcriptomics, proteomics en andere array-gebaseerde applicaties. Ons doel is om een niet-conventionele middelen van het kweken van menselijke epitheelcellen aan organotypische 3-D modellen die de mens in vivo weefsels herhalen, op een gemakkelijke en robuust systeem om te worden gebruikt door onderzoekers met uiteenlopende wetenschappelijke belangen te produceren.

Een roterende celcultuur die het mogelijk maakt epitheliale cellen om te groeien onder fysiologische omstandigheden resulteert in 3-D cellulaire totale formatie wordt beschreven. De aggregaten gegenereerde weergave<em&gt; In vivo</em&gt;-Achtige eigenschappen niet die in conventionele cultuur modellen en dienen als een meer nauwkeurige organotypische modelsysteem voor een veelheid aan wetenschappelijke onderzoeken.

Kweken en Toepassingen van Rotating muur Schip Bioreactor Afgeleid 3D epitheelcellen modellen

Cellen en weefsels in het lichaam worden blootgesteld aan omgevingscondities die hun architectuur, intercellulaire communicatie en algemene functies beïnvloeden. ...

Dit niet-conventionele protocol presenteert een eenvoudig en robuust systeem om menselijke epitheelcellen te kweken in organotypische 3D-modellen die het menselijke in vivo-weefsel nabootsen. Eerst worden epitheelcellen in een weefselkweekfles gekweekt tot een confluente monolaag en geoogst, waarna ze in de STLV-bioreactor worden gecombineerd met microcarrier-beads; door de STLV op het platform te roteren wordt een constante vrije-valomgeving met een lage vloeistofschuifspanning gecreëerd, waardoor de cellen kunnen hechten en groeien op de beads en na 96 uur en vervolgens ongeveer elke dag daarna cellulaire aggregaten vormen.Vul het medium in de SDLV aan om te voorzien in het cellulaire metabolisme na aggregatievorming. Maak wekelijks beelden van de monsters met lichtmicroscopie om de ontwikkelingsprogressie te monitoren zodra de volledige aggregatievorming en cellulaire differentiatie hebben plaatsgevonden. Zaai de aggregaten uit voor downstream experimentele analyse en assays. Uiteindelijk kan dit systeem in vivo-achtige organotypische modelsystemen genereren voor een multitude aan wetenschappelijke onderzoeken.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals conventionele celkweek, is dat de epitheelcellen differentiëren en polariseren tot weefselachtige aggregaten, waardoor ze morfologisch en functioneel vergelijkbaar reageren met authentiek menselijk weefsel. Dit 3D-modelsysteem biedt verder inzicht in de biologie van epitheelcellen, interacties tussen gastheer en pathogeen, en de complexe wisselwerking tussen celtypen die in het systeem kunnen worden geïntroduceerd. Dr. Andrea Radkey.Een postdoc in mijn laboratorium zal nu deze procedure demonstreren om de langzaam draaiende laterale vaatbioreactor te detoxificeren. Dek open poorten af met lure-doppen. Vul de STLV met 95% ethanol en laat dit 24 uur lang equilibreren.Verwijder de ethanol, vul vervolgens met gesteriliseerd gedestilleerd water en incubeer gedurende 24 uur met behulp van de door de leverancier verstrekte instrumenten, draai alle schroeven los en verwijder de centrale plug uit de STLV. Plaats deze in een sterilisatiezak en autoclaveer bij 110 °C gedurende 20 minuten. Zet de STLV weer in elkaar en herhaal de detoxificatie om de steriliteit te waarborgen.Draai vervolgens de schroeven van de STLV aan. Bevestig de vooraf gesteriliseerde eenrichtingsstopkraan aan elke poort. Verwijder nu de zuigers uit een lure lock spuit van 10 milliliter en vijf milliliter en bewaar de zuigers in de verpakkingen.Om de steriliteit te waarborgen, worden de spuiten op de stopkraan geschroefd. Voeg vervolgens DPBS toe aan de spuit van 10 milliliter totdat de STLV vol is en de spuit van vijf milliliter begint te vullen. Plaats daarna de steriele zuigers terug in elke spuit en verwijder eventuele resterende luchtbellen in de bioreactor door de zuigers van de spuiten afwisselend aan te drijven.Sluit de stopkranen en bevestig de STLV aan het roterende verticale platform. Roteer gedurende minimaal 24 uur om te controleren op lekken in een conische buis van 50 milliliter. Voeg 15 milliliter DPBS toe aan 250 milligram cytodex microcar beads en autoclaveer na afkoeling.Verwijder de DPBS en was drie keer met kweekmedium voor de epitheelcellen. Draai de buis voorzichtig rond om de beads opnieuw te suspenderen. Suspendeer de beads vervolgens in 15 milliliters kweekmedium.Kweek eerst 1 x 10⁷ epitheelcellen als monolagen in weefselkweekflessen. Oogst de cellen, tel ze en bepaal de celviabiliteit via trypaanblauw-exclusiekleuring, en voeg de cellen vervolgens toe aan de voorbereide beads.Spoel de conische buis om ervoor te zorgen dat alle cellen zijn overgebracht. Verwijder vervolgens de DPBS en de spuiten uit de STLV. Verwijder daarnaast de plug uit de centrale poort met een serologische pipet van 10 milliliter.Laad de suspensie van epitheelcelkralen in de STLV. Spoel de conische buis één keer om alle cellen en kralen over te brengen. Plaats vervolgens de plug van de centrale poort terug.Verwijder vervolgens de zuigers uit een spuit van 5 mL en een spuit van 10 mL en bewaar de zuigers in de verpakkingen. Om de steriliteit te waarborgen, worden de aansluitingen van de spuiten afgesloten met open stopkranen. Vul de STLV met medium.Vervang de zuigers en sluit de stopkraan. Laat de nieuw ingezaaide STLV-cultuur nu 30 minuten equilibreren in een incubator bij 37 °C zonder rotatie. Open de stopkraan nadat de STLV uit de incubator is gehaald.Verwijder eventuele luchtbellen met de zuigers en sluit de stopkraan. Stel vervolgens de STLV in de incubator in op continue rotatie met 20 RPM. Vervang na 96 tot 120 uur het medium door de spuiten te verwijderen en beide stopkranen van de STLV te openen, zodat de kralen en cellen kunnen bezinken.Zodra de cellen zijn neergedaald, giet u ongeveer 75% van het medium via de zijpoort af met behulp van de spuiten om het voedingsprotocol uit te voeren. Blijf het medium naar behoefte aanvullen op basis van het cellulaire metabolisme. Controleer daarnaast elke vijf tot zeven dagen de groei en levensvatbaarheid van de aggregaten.Om het afschuiven van aggregaten te voorkomen, gebruikt u een 1000 µL pipetpunt die ongeveer twee centimeter vanaf de punt is afgeknipt en gesteriliseerd. Verwijder voorzichtig 200 µL aggregaten uit de centrale poort en verdeel deze in twee buisjes van 1,5 mL. Gebruik één aliquot voor het monitoren van de cellevensvatbaarheid. Nadat de cellen van de beads zijn gescheiden, wordt de levensvatbaarheid geëvalueerd via trypaanblauw-exclusie.Kleuring voor beeldvorming van cellulaire aggregaten. Voeg 0,5 tot 1 milliliter medium toe aan de tweede aliquot van 1,5 milliliter aggregaten en breng dit over naar een kleine Petrischaal met behulp van een afgesneden 1000 microliter pipetpunt voor de beeldvorming van de aggregaten.Bij het gebruik van een omgekeerde lichtmicroscoop voor sommige epitheliale celmodellen is het noodzakelijk om de aggregaten over te brengen naar een wegwerphalve om de beluchting van de cultuur te verbeteren, ongeveer één week vóór het oogsten van de aggregaten. Verwijder voor de analyse de spuiten uit de STLV en giet ongeveer 50% van het medium via de zijpoort af. Verwijder de centrale stop en giet voorzichtig alle inhoud via de centrale poort in een conische buis van 50 milliliter.Spoel de STLV tweemaal met vijf milliliter medium en voeg de spoelingen samen met de geoogste aggregaten. Draag vervolgens de aggregaten over van de 50 milliliter conische buis naar de Harv. Oogst na één week zorgvuldig de aggregaten voor potentiële assay-formaten, assays en analyses waarbij gedifferentieerde menselijke epitheliale aggregaten zijn gekweekt in het STLV-bioreactorsysteem.De SEM- en TEM-beelden zijn verzameld van menselijke vaginale cellen die gedurende 39 dagen in de STLV zijn gekweekt. Merk op dat de 3D-aggregaten ultrastructurele kenmerken vertonen die vergelijkbaar zijn met weefsels, zoals de microruggen, invaginaties, intracellulaire secretoire blaasjes en microvilli op het apicale oppervlak. Confocale immunofluorescentiemicroscopiebeelden van 3D-vaginale cellen duiden op de expressie van mucine en markers die specifiek zijn voor epitheelcellen en terminale differentiatie. Fysiologisch relevante fenotypen dienen daarnaast als een uitstekend platform voor het evalueren van de toxiciteit van verbindingen.De MTT-assay, een veelgebruikte methode om celviabiliteit, metabolisme of proliferatie te meten, kan worden gebruikt om de toxiciteit van diverse chemicaliën en verbindingen te bepalen. Alternatief kan de toxiciteit na behandeling met testverbindingen worden gemeten via trypaanblauw-exclusie. In dit voorbeeld vertoonden de vaginale aggregaten na behandeling met NONOXINOL nine een toxiciteitsrespons die vergelijkbaar was met die van cervicale X-explantmodellen, maar een ander profiel in vergelijking met monolagen.De 3D-aggregaten zijn functioneel responsief, bijvoorbeeld bij stimulatie met moleculen afkomstig van microben die worden herkend door de toll-like receptoren. De aggregaten reageren en scheiden pro-inflammatoire cytokinen uit, waaronder IL six proteïne en transcriptexpressie van de progesteronreceptor. In de vaginale cellen kan ook een receptor worden waargenomen die reageert op hormoonstimulatie.De 3D-aggregaten hebben niet alleen het vermogen om te reageren op pathogeen- en hormoonmoleculen, maar zijn ook in staat om functioneel een infectie met herpes simplex virus type 2 te ondersteunen. Een confocale microscopie-opname van met HSV-2 geïnfecteerde 3D-vaginale aggregaten demonstreert de infectie. De fysieke en functionele eigenschappen van individuele cellen binnen de aggregaten kunnen ook worden gekwantificeerd met flowcytometrie, zoals bijvoorbeeld een flowcytometrie-assay om de oppervlakte-expressie van mucin 1 op individuele vaginale cellen te meten.De 3D vaginale aggregaten vertoonden een lager percentage mucine 1 op hun oppervlak vergeleken met monolagen na diens ontwikkeling. Deze techniek stelde onderzoekers in de velden van de weefselbiologie en infectieziekten in staat om de structuur en fysiologische reacties op stimuli te bestuderen. Met het gebruik van deze organotypische modellen kunnen we de menselijke biologie beter nabootsen.

culturing-applications-rotating-wall-vessel-bioreactor-derived-3d

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In het verleden tal van in vitro-cultuur systemen - met name monolaagculturen - vaak last van het nadeel dat gedifferentieerde primaire cellen een relatief korte levensduur hebben en de-gedifferentieerde tijdens de cultuur. Als gevolg daarvan werden de meeste van hun orgaan-specifieke functies snel verloren. Zo, met het oog op betere voorwaarden voor deze cellen in vitro te reproduceren, zijn wijzigingen en aanpassingen gedaan om de conventionele monolaagculturen.

Interview: bioreactoren en ondergedompeld-Modified 3D-Stellingen voor stamcelonderzoek

Traditionele, tweedimensionale celcultuur technieken vaak resulteren in veranderde eigenschappen met betrekking tot de differentiatie markers, cytokines en groeifactoren. Drie-dimensionale celkweek in het draaiende celkweek systeem (RCC's) herstelt expressie van vele van deze factoren zoals hier afgebeeld met een extravillous trophoblast cellijn.

Roterende celkweek systemen for Human Cultuur van de Cel: Human trofoblast cellen als een model

De functionele gedrag van cellen in kweek kan worden verbeterd door het kweken meer in vivo-achtige 3-dimensionale kweek omgevingen 16-21. Dit manuscript beschrijft de opzet en exploitatie van een holle vezel bioreactor systeem voor in vivo-achtige zoogdieren weefselkweek.

Holle vezel voor Bioreactoren<em&gt; In Vivo</em&gt; -achtige Mammalian Tissue Culture

Cellen groeien in een driedimensionale (3-D) milieu vormen een duidelijke verbetering ten opzichte celkweek in 2-D omgevingen (bijvoorbeeld kolven of schalen). Hier beschrijven we de ontwikkeling van een meercellige 3-D model van het organotypische menselijke darmslijmvlies gekweekt onder microzwaartekracht door roterende-wall-vat (RWV) bioreactoren.

Ontwikkeling van een Meercellige Driedimensionale Organotypische model van het menselijk darmslijmvlies geteeld onder Microgravity

Dit manuscript beschrijft een zachte lithografie gebaseerde techniek uniforme arrays van driedimensionale (3D) epitheliale weefsels gedefinieerde geometrische midden van extracellulaire matrix ingenieur. Deze methode is vatbaar voor een grote verscheidenheid aan celtypen en experimentele contexten en zorgt voor high-throughput screening van identieke herhalingen.

Techniek Driedimensionale epitheelweefsels Embedded binnen extracellulaire matrix

Het protocol wordt beschreven hoe een perfusable vasculaire netwerk in een sferoïde ingenieur. Van de sferoïde omliggende communicatie is bedacht om te induceren angiogenese en de sferoïde verbinden met de microchannels in een microfluidic apparaat. De methode staat de perfusie van het sferoïde, die een langverwachte techniek in driedimensionale culturen is.

Perfusable vasculaire netwerk met een Model van het weefsel in een Microfluidic-apparaat

Het doel van dit protocol is om borsteptheelcellen rechtstreeks bioprinten als meercellige sferoïden op voorgevormde endotheelnetwerken om snel 3D-borst-endotheel co-cultuurmodellen te creëren die kunnen worden gebruikt voor geneesmiddelenscreeningsstudies.

Directe bioprinting van 3D-meercellige borstsferoïden op endotheelnetwerken

Dit protocol presenteert een methode voor de kweek en 3D-groei van ameloblastachtige cellen in microzwaartekracht om hun langwerpige en gepolariseerde vorm en glazuurspecifieke eiwitexpressie te behouden. Kweekomstandigheden voor de kweek van parodontale engineeringconstructies en longorganen in microzwaartekracht worden ook beschreven.

Voortplanting van tandheelkundige en respiratoire cellen en organen in microzwaartekracht

In dit artikel wordt een nieuw ontworpen 3D-geprinte insert gepresenteerd als een model van co-cultuur en gevalideerd door de studie van de paracriene intercellulaire communicatie tussen endotheelcellen en keratinocyten.

Een innovatief 3D-geprint inzetstuk dat is ontworpen om eenvoudige 2D- en 3D-celculturen mogelijk te maken

Hier laten we zien hoe epitheelcellen gekweekt met fibroblasten in het nanovezelige membraangebaseerde tweelaagse systeem stabiel kunnen hechten aan en groeien op het membraan.

Het opzetten van een driedimensionale cocultuurmodule van epitheelcellen met behulp van nanovezelmembranen

Ontdek een roterend bioreactorsysteem voor het kweken van 3D epitheelcelaggregaten die menselijk weefsel nabootsen. Deze methode ondersteunt onderzoek naar weefselbiologie en infectieziekten.

Kweken en Toepassingen van Rotating muur Schip Bioreactor Afgeleid 3D epitheelcellen modellen

Meer video's verkennen