Name: Combinatoriële Synthese van en high-throughput eiwit Op de markt van Polymer Film en Nanodeeltje bibliotheken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Leer de combinatorische synthese van biologisch afbreekbare polyanhydride film- en nanopartikelbibliotheken met high-throughput detectie van eiwitafgifte voor biomedische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs erkennen de ONR-MURI Award (NN00014-06-1-1176) en de US Army Medical Research en Materieel Command (Grant No W81XWH-10-1-0806) voor financiële steun. Dit materiaal is gebaseerd op het werk ondersteund door de National Science Foundation onder Grant No EEG 0552584 en 0851519.

1. Combinatorische Polymer Bibliotheek Synthese (Variërend in Polymer Chemistry) - zie figuur 1 voor Robotic Setup <ol><li> Los elk monomeer in het geschikte oplosmiddel (concentratie = 25 mg / ml) en te laden in een 10cc gasdichte injectiespuit. </li><li> Bevestig de oplosmiddelbestendige lokmiddel lock capillaire buizen aan het eind van elke spuit. </li><li> Plaats de spuiten op de spuit pompen (New Era Programmeerbare spuitpompen) en vergrendelen. </li><li> Stel de lineaire aandrijving (Zaber) naar de uitgangspositie. </li><li> Met behulp van ring statiefklemmen, plaats het einde van beide capillaire buizen in de uitgangspositie flacon / goed voor monomeer depositie. </li><li> Start de LabVIEW programma, dat pompen met variabele hoeveelheden van elk monomeer in ieder putje afhankelijk van de gewenste copolymeersamenstelling. Dit wordt bereikt door het programma instrueren de Z-as actuator om de capillaire buisjes omlaag in de flacon / putje en vervolgens elke pomp om het gewenste volume te doseren. Next het programma opdracht aan de Z-actuator terug naar de uitgangspositie en de X-en Y-actuators om naar de positie van het volgende injectieflacon / well. Dit wordt uitgevoerd tot elk putje werd de gewenste hoeveelheid monomeer afgezet in. </li><li> Na monomeer depositie wordt de multi-well of meerdere flesje monomeer bibliotheek naar een voorverwarmde oven en gedurende vacuum onder vacuüm voor de duur van de condensatiepolymerisatiereactie. Voor CPH: SA synthese wordt de reactie uitgevoerd bij 180 ° C, 0,3 torr, gedurende 1,5 uur, maar deze reactieomstandigheden varieert tussen verschillende polymeersystemen. </li></ol> 2. Combinatoriële Blank en eiwit-loaded polymeer nanodeeltje en Film Bibliotheek Fabrication - zie figuur 1 voor Robotic Setup <ol><li> De injectiespuit in de eerste programmeerbare spuitpomp is gevuld met een oplosmiddel (lege bibliotheek) of een oplosmiddel met eiwit gedispergeerd zijn (eiwit-loaded library) terwijl de spuit in de tweede spuitpomp leeg gelaten. Buizen voor nanodeeltjes fabricage in de aangrenzende monsterhouder zijn gevuld met het niet-oplosmiddel (verhouding van oplosmiddel tot niet-oplosmiddel is 1 tot 100). Voor filmvervaardiging een lege multi-well plaat gebruikt in plaats van de buizen in de aangrenzende monsterhouder. </li><li> Met het LabVIEW programma wordt het oplosmiddel neergeslagen in alle flesjes polymeer / putjes van de bibliotheek (concentratie = 20 mg / ml) en gedurende 1-5 min.. Een optionele stap sonicatie (30 s bij 40 Hz) kan worden ingevoerd om volledig oplossen van polymeer te waarborgen. </li><li> Vervolgens door het opzetten van een aparte LabVIEW programma wordt het monster dat in de lege spuit, en gedeponeerd in de bijbehorende buis van non-solvent (nanodeeltjes) of lege put (films) in de aangrenzende monsterhouder. </li><li> Dit proces wordt uitgevoerd voor elke samenstelling van de discrete polymeerbibliotheek. </li><li> De nanodeeltjes of film bibliotheek wordt vervolgens in een vacuümkamer voor oplosmiddel en niet-oplosmiddel verwijderd (de nanodeeltjes library kan worden hersteld met vacuümfiltratie). </li></ol> 3. High-throughput Protein afgiftekinetiek <ol><li> Voor het onderzoeken van high-throughput eiwit afgiftekinetiek van een polymeerbibliotheek, een 96 deep-sprongen (2 ml / putje) wordt polypropyleen plaat gewijzigd dat het bovenste 1/3 van de wand en in aangrenzende kolommen (ex: A en B, C en D, E en F, G en H) wordt verwijderd aan de putjes aansluiten. Het eiwit beladen films worden vervaardigd in of nanodeeltjes overgebracht naar deze plaat bij hoge doorvoer afgiftekinetiek studies uitgevoerd. Eiwit-loaded nanodeeltjes of film monsters mag alleen worden geplaatst in een goed van de aangrenzende kolommen (ex: A, C, E en G). Zie afbeelding 4 voor meer informatie. </li><li> Na de overdracht van de nanodeeltjes aan de 96 diep welden versie plaat, worden de deeltjes bezinken. PBS buffer (0,1 mM, pH 7,4) wordt langzaam toegevoegd aan elk monster putje (kolommen A, C, E en G) en vervolgens elke naburige put (kolommen B, D, F en H) totdat de putjes gevuld zijn en de buffer vrij stromend tussen aangrenzende wells. Voor nanodeeltjes Dit proces dient te worden uitgevoerd met extra voorzichtigheid te zorgen voor de deeltjes achterblijven op de bodem van de monsterholte (kolommen A, C, E en G) en niet overgebracht naar de aangrenzende afgifte well (kolommen B, D, F en H). In sommige gevallen wordt centrifugeren moet lokaliseren de nanodeeltjes monsters onderaan de monsteropening (kolommen A, C, E en G). </li><li> Vervolgens wordt de lossende plaat afgesloten met een deksel en op de gewenste temperatuur (bijvoorbeeld 37 ° C) onder roeren de duur van het experiment. </li><li> Bij incrementele tijdstippen (bijv. 0,04, 1, 2, 3, 5, 7, 9, 12, 15, 19, 24 en 30 dagen) de hoeveelheid vrijkomende fluorochroom-geconjugeerde eiwit wordt gekwantificeerd met een Typhoon 9400 Flatbed Fluorescent Scanner ( GE Healthcare). De lossende plaat wordt op de scanner oppervlak gescand met de juiste excitatie en emissie laser filters, en de fluorescentiesterkte van het model eiwit in de afgifte putjes (kolommen B, D, F en H) wordt gekwantificeerd (Image Quant). Voorgesteld wordt eiwitstandaarden van bekende concentraties worden opgenomen in de wells plaat berekening proteïne hoeveelheid en waarop fluorochroom quenching. </li></ol> 4. Representatieve resultaten Bij vervaardiging van het polymeer library werd karakterisering uitgevoerd met 1H NMR, GPC en FTIR deze combinatoriële methode te valideren 1,7,8,11. Molecuulgewichten variëren van 10.000-20.000 g / mol, polydispersiteitsindex varieert van 1.5-3.0, en chemische samenstelling is aangetoond nauwkeurig en in overeenstemming met gebruikelijke werkwijzen van synthese polyanhydride 12-15. Ook SEM beelden van de nanodeeltjes bibliotheken vertoonden dezelfde oppervlakte morfologie, grootte en grootteverdeling als die van conventioneel gefabriceerde nanodeeltjes 2. Proteïne afgifte kinetics polyanhydride van nanodeeltjes of films wordt uitgevoerd in een gemodificeerde putjes zoals hiervoor is beschreven 1. De resultaten toonden een ongeveer nulde orde afgifte met of zonder burst afhankelijk eiwitbelading en polymeerchemie (figuren 2 en 3) 1,12,14,16. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3882/3882fig1.jpg" /> Figuur 1. Combinatorial polymeerfilm en nanodeeltjes vervaardigingapparaat. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3882/3882fig2.jpg" /> Figuur 2 High-throughput afgifte van Texas Red runderserumalbumine (TRBSA) van een CPH:. SA polymeer nanodeeltje bibliotheek. SA-rijke polymeer chemie los ingekapseld TRBSA het snelst, terwijl CPH-rijke polymeer chemie laat de langzaamste. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatietie en n = 4. Herdrukt met toestemming van Petersen et. al.. 1. Copyright 2010 American Chemical Society. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3882/3882fig3.jpg" /> Figuur 3 High-throughput afgifte van Texas Red runderserumalbumine (TRBSA) van een CPTEG:. CPH polymeerfilm bibliotheek. CPTEG-rijke polymeer chemie los ingekapseld TRBSA het snelst, terwijl CPH-rijke polymeer chemie laat de langzaamste. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie en n = 3. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3882/3882fig4.jpg" /> Figuur 4. Afbeelding van de twee naburige putten &quot;voor&quot; en &quot;na&quot; wijziging in de 96 diepe welden polypropyleen plaat. De &quot;na&quot; wijziging beeld rechts toont ook de toevoeging van een polymeerfilm (onderaan links well) met een ingekapselde fluorescent moleculevrijkomt tussen de twee putten in een bufferoplossing. Het model fluorescent molecule wordt dan gedetecteerd in het denkbeeld.

<ol><li>Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+high-throughput+method+to+study+in+vitro+protein+release+from+polymer+nanospheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comb.+Chem%22%5BJournal%5D)">A novel, high-throughput method to study in vitro protein release from polymer nanospheres.</a> J. Comb. Chem. 12, 51-56 (2010).</li>
<li>Petersen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+innate+immune+responses+in+a+pathogen-mimicking+manner+by+amphiphilic+polyanhydride+nanoparticle+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants.</a> Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).</li>
<li>Vogel, B. M., Cabral, J. T., Eidelman, N., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+synthesis+and+high-throughput+dissolution+testing+of+biodegradable+polyanhydride+copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comb.+Chem%22%5BJournal%5D)">Parallel synthesis and high-throughput dissolution testing of biodegradable polyanhydride copolymers.</a> J. Comb. Chem. 7, 921-928 (2005).</li>
<li>Petersen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+evaluation+of+in+vivo+biodistribution+of+polyanhydride+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Healthcare+Mater%22%5BJournal%5D)">High-throughput evaluation of in vivo biodistribution of polyanhydride nanoparticles.</a> Adv. Healthcare Mater. , Forthcoming (2012).</li>
<li>Petersen, L. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+design+of+biomaterials+for+drug+delivery%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Combinatorial design of biomaterials for drug delivery: opportunities and challenges.</a> Expert Opin. Drug Deliv. 5, 837-846 (2008).</li>
<li>Petersen, L. K., Oh, J., Sakaguchi, D. S., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+polyanhydride+films+promote+neural+stem+cell+adhesion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic polyanhydride films promote neural stem cell adhesion and differentiation.</a> Tissue Eng. 17, 2533-2541 (2011).</li>
<li>Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+protein+stability+in+polyanhydride+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles.</a> Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).</li>
<li>Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+simultaneous+effect+of+polymer+chemistry+and+device+geometry+on+the+in+vitro+activation+of+murine+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells.</a> Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).</li>
<li>Thorstenson, J. B., Petersen, L. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial%2Fhigh-throughput+methods+for+the+determination+of+polyanhydride+phase+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comb.+Chem%22%5BJournal%5D)">Combinatorial/high-throughput methods for the determination of polyanhydride phase behavior.</a> J. Comb. Chem. 11, 820-828 (2009).</li>
<li>Xue, L., Petersen, L., Broderick, S., Narasimhan, B., Rajan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+factors+controlling+protein+release+from+combinatorial+biomaterial+libraries+via+hybrid+data+mining+methods%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Comb.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identifying factors controlling protein release from combinatorial biomaterial libraries via hybrid data mining methods.</a> ACS Comb. Sci. 13, 50-58 (2011).</li>
<li>Adler, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cell-based+screening+of+biodegradable+polyanhydride+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Comb.+Chem.+High+Through.+Screen%22%5BJournal%5D)">High-throughput cell-based screening of biodegradable polyanhydride libraries.</a> Comb. Chem. High Through. Screen. 12, 634-645 (2009).</li>
<li>Determan, A. S., Trewyn, B. G., Lin, V. S., Nilsen-Hamilton, M., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation%2C+stabilization%2C+and+release+of+BSA-FITC+from+polyanhydride+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Encapsulation, stabilization, and release of BSA-FITC from polyanhydride microspheres.</a> J. Control. Release. 100, 97-109 (2004).</li>
<li>Determan, A. S., Wilson, J. H., Kipper, M. J., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+stability+in+the+presence+of+polymer+degradation+products%3A+consequences+for+controlled+release+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Protein stability in the presence of polymer degradation products: consequences for controlled release formulations.</a> Biomaterials. 27, 3312-3320 (2006).</li>
<li>Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+polyanhydrides+for+protein+stabilization+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release.</a> Biomaterials. 28, 108-116 (2007).</li>
<li>Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+novel+polyanhydrides+with+tailored+erosion+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).</li>
<li>Carrillo-Conde, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+into+amphiphilic+polyanhydride+microparticles+stabilizes+Yersinia+pestis+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Encapsulation into amphiphilic polyanhydride microparticles stabilizes Yersinia pestis antigens.</a> Acta Biomater. 6, 3110-3119 (2010).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Kennis van de noodzakelijke synthesecondities en glasovergangstemperaturen (Tg) van de polymeren worden gesynthetiseerd zijn essentieel voor library fabricage. Als de Tg&#39;s zijn onder kamertemperatuur, kan de nanodeeltjes fabricage stap moet worden uitgevoerd in een gecontroleerde omgeving temperatuur onder de Tg van de polymeren. Bovendien moet voorzichtigheid worden gezorgd dat alle apparatuur die in contact komt met hoge temperaturen en de oplosmiddelen moeten geschikt om deze te h...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> Gemotoriseerde XYZ Stage: 3x T-LSM050A, 50 mm veerweg per as </td><td> Zaber Technologies </td><td> T-XYZ-LSM050A-KT04 </td></tr><tr><td> NE-1000 Single-spuitpomp </td><td> New Era Pump Systems </td><td> NE-1000 </td></tr><tr><td> Pyrex * Vista * Randloze Herbruikbaar Glas Cultuur Buizen </td><td> Corning </td><td> 07-250-125 </td></tr><tr><td> Glazen cuvetten </td><td> Wetenschappelijke Strategieën </td><td> G102 </td></tr><tr><td> LabVIEW </td><td> National Instruments </td><td> 776.671-35 </td></tr><tr><td> SGE gasdichte spuiten, Luer Loc </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 509507 </td></tr><tr><td> U96 deepwell platen 1,3 ml &amp; 2,0 ml </td><td> Thermo Scientific: Nunc </td><td> 278743 </td></tr><tr><td> Nou cap matten </td><td> Thermo Scientific: Nunc </td><td> 276000 </td></tr><tr><td> Typhoon 9400 </td><td> GE Healthcare </td><td> 63-0055-79 </td></tr><tr><td> Whatman Grade 50 Cirkels 90 mm </td><td> Whatman papier </td><td> 1450-090 </td></tr></tbody></table>

combinatoriële synthese van en high-throughput eiwit op de markt van polymer film en nanodeeltje bibliotheken

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Polyanhydriden zijn een klasse van biomaterialen met uitstekende biocompatibiliteit en drug delivery mogelijkheden. Terwijl ze uitvoerig bestudeerd met gebruikelijke een-sample-at-a-time synthesetechnieken, een recent high-throughput aanpak ontwikkeld waardoor de synthese en het testen van grote bibliotheken van polyanhydriden 1. Dit bevordert een efficiënte optimalisatie-en ontwerpproces van deze biomaterialen voor drugs-en toediening van vaccins toepassingen. De werkwijze in dit werk beschrijft de combinatorische synthese van biologisch afbreekbare polyanhydride film en nanodeeltjes bibliotheken en high-throughput detectie van proteïneafgifte uit deze bibliotheken. Bij deze robot bediende methode (figuur 1), zijn lineaire actuatoren en spuitpompen gecontroleerd door LabVIEW, die een hands-free geautomatiseerd protocol maakt, waardoor fout van de gebruiker. Bovendien deze werkwijze maakt de snelle fabricage van micro-schaal polymeer libraries, redvóór het eerste batchgrootte terwijl resulteert in de creatie van Multivariant polymeersystemen. Deze combinatorische benadering van polymeersynthese vergemakkelijkt de synthese van maximaal 15 verschillende polymeren in een equivalente hoeveelheid tijd die het zou kosten om een ​​polymeer conventioneel synthetiseren. Bovendien kan de combinatorische polymeerbibliotheek worden vervaardigd in lege of proteïne geladen geometrieën zoals films of nanodeeltjes bij oplossen van het polymeer in een oplosmiddel bibliotheek en precipitatie in een niet-oplosmiddel (nanodeeltjes) of door vacuümdroging (voor films). Bij het ​​laden van een fluorochroom-geconjugeerde eiwit in het polymeer bibliotheken kunnen eiwit afgiftekinetiek worden beoordeeld op high-throughput met fluorescentie gebaseerde detectiemethode (figuren 2 en 3) zoals eerder beschreven een. Deze combinatorische platform is gevalideerd met conventionele methoden 2 en de polyanhydride film en nanodeeltjes bibliotheken zijn gekarakteriseerd met <sup&gt; 1 H NMR en FTIR. De bibliotheken werden gescreend op eiwitten afgiftekinetiek, stabiliteit en antigeniciteit, in vitro cellulaire toxiciteit, cytokine productie, oppervlakte marker expressie, hechting, proliferatie en differentiatie en in vivo biodistributie en mucoadhesion 1-11. De werkwijze hierin ontwikkelde combinatorische maakt high-throughput polymeersynthese en fabricage van eiwit beladen nanodeeltjes en film libraries, die op hun beurt in vitro en in vivo worden gescreend optimaliseren van prestaties biomateriaal.

Deze methode beschrijft de combinatorische synthese van biologisch afbreekbare polyanhydride film en nanodeeltjes bibliotheken en het high-throughput detectie van proteïneafgifte uit deze bibliotheken.

Combinatoriële Synthese van en high-throughput eiwit Op de markt van Polymer Film en Nanodeeltje bibliotheken

Polyanhydriden zijn een klasse biomaterialen met een uitstekende biocompatibiliteit en mogelijkheden voor geneesmiddelentoediening. Hoewel ze uitgebreid zijn bestudeerd met ...

Deze video beschrijft de combinatorische synthese van bibliotheken met biologisch afbreekbare polyanhydride-folies en nanodeeltjes, en de high-throughput detectie van eiwitvrijgave uit deze bibliotheken. Eerst wordt een geautomatiseerd high-throughput depositieapparaat gebruikt om een compositioneel diverse reeks monomeren in glazen cuvetten aan te brengen. Een polycondensatiereactie wordt uitgevoerd bij 180 °C en 0,3 tor gedurende 1,5 uur.Deze reactiecondities zijn specifiek voor de synthese van C-P-H-S-A polyanhydridepolymeren. Met behulp van het geautomatiseerde depositieapparaat worden het oplosmiddel en eventuele componenten voor inkapseling in de cuvetten gedeponeerd die de polymeerbibliotheek bevatten. Sonicatie kan worden toegepast om volledige oplossing van het polymeer en een uniforme verspreiding van de additionele componenten te waarborgen.Vervolgens wordt het opgeloste polymeer overgebracht naar een buis met nonsolvent om de nanodeeltjesbibliotheek via nanoprecipitatie te vervaardigen. De nanodeeltjes worden teruggewonnen door vacuümdrogen of filtratie en daarna overgebracht naar een gemodificeerde 96-wells releaseplaat. Ten slotte wordt de eiwitgeladen bibliotheek onder fysiologische omstandigheden geïncubeerd en worden de eiwitvrijgavekinetieken geëvalueerd met behulp van een fluorescentiedetectiemethode.Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de kinetiek van eiwitvrijgave tonen als functie van de polymeereigenschappen of de omgevingscondities van de vrijgave. Het belangrijkste voordeel van deze benadering ten opzichte van andere conventionele technieken waarbij één monster tegelijk wordt geanalyseerd, is dat we in staat zijn om meerdere monsters gelijktijdig te synthetiseren. Deze monsters kunnen vervolgens via high-throughput screening worden onderzocht op interacties tussen eiwit-polymeer, cel-polymeer of gastheer-polymeer.Dit versnelt vervolgens het rationele ontwerp en de ontwikkeling van deze biomaterialen voor geneesmiddelentoediening en weefseltechnologie. De procedure zal worden gedemonstreerd door La Tricia Peterson, een postdoc uit mijn laboratorium. In dit gedeelte van de video wordt een high-throughput depositieapparaat gebruikt om een compositioneel variërende monomeerbibliotheek te deposeren na de polymeersynthese.Dit apparaat wordt gebruikt voor het vervaardigen van een combinatorische bibliotheek van blanco of met eiwitten geladen polymeerfilms of nanodeeltjes. Het geautomatiseerde platform bestaat uit twee programmeerbare spuitenpompen en drie lineaire actuatoren die in serie zijn verbonden met een computer. LabVIEW-software wordt gebruikt om commando's naar de spuitenpompen en actuatoren te sturen.10 cc gasttight spuiten worden geplaatst in spuitpompen met metalen capillaire buizen die zijn aangesloten via lure lock-koppelingen, waarmee de polymeeroplossingen in glazen cuvetten worden gedoseerd. In deze demonstratie worden seic acid of SA en one six Biss para oxy heane of CPH gebruikt om een bibliotheek van nanodeeltjes te maken die Texas Red Boan serum albumine inkapselen. De instructies in deze video en de bijbehorende documenten kunnen worden aangepast om een breed scala aan polymeerfilm- en nanodeeltjesbibliotheken te vervaardigen en te testen.Om de bibliotheken te synthetiseren, begint u met het oplossen van elk monomeer in chloroform tot een uiteindelijke concentratie van 25 milligram per milliliter in een glazen vial. Laad vervolgens elke oplossing in een gastichte spuit van 10 cc door de oplossing via het luer-lock-uiteinde van de spuit op te zuigen. Verwijder eventuele luchtbellen.Bevestig vervolgens de oplosmiddelbestendige Luer-lock roestvrijstalen capillaire buis aan het uiteinde van de spuit. Zet de capillaire buizen vast in klemmen en bevestig deze aan een statief. Plaats vervolgens het uiteinde van beide capillaire buizen in de startcuvet.Voor de depositie van monomeren. Plaats de spuiten op de programmeerbare spuitpompen en vergrendel ze in de juiste positie in de LabVIEW-software. Stel de lineaire actuatoren in de software in op de beginpositie.Start de geautomatiseerde depositie van de SA- en CPH-monomeren in de glazen cuvetten langs de x-, y- en z-as. Actuatoren positioneren de capillaire buisjes correct in elke cuvet en pompen de geprogrammeerde volumes van elk monomeer erin, waardoor een compositioneel variërende monomeerbibliotheek wordt gecreëerd. Na de depositie van de monomeren.Breng de monomeerbibliotheek over naar een voorverwarmde vacuümoven en incubeer deze bij 180 °C en 0,3 tour gedurende 1,5 uur om condensatiepolymerisatie mogelijk te maken. Na de incubatie is de vervaardiging van de polymeerbibliotheek voltooid. Vervolgens worden polymeernanodeeltjes geladen met eiwitten gegenereerd.Raadpleeg het bijbehorende protocol voor de vervaardiging van een proteïneladen polymeerfilmbibliotheek voor het vervaardigen van een proteïneladen nanodeeltjesbibliotheek. Voeg in dit geval het eiwit, Texas red runderserumalbumine, toe aan het geschikte oplosmiddel, dat in staat moet zijn de polymeerbibliotheek op te lossen. Hier wordt methyleenchloride gebruikt in een concentratie van twee milligram per milliliter.Vul de 10 cc spuit met Texas Red BSA-houdend oplosmiddel en plaats deze in de eerste spuitpomp. Plaats vervolgens een schone, lege spuit van twee cc in de tweede spuitpomp en plaats buisjes met 15 milliliters van een niet-oplosmiddel, in dit geval pentaan, in de buishouder naast het vialsplatform. Start vervolgens in de lab-view software het geautomatiseerde proces voor oplosmiddeldepositie door het programma te selecteren.Na het starten van het programma wordt het oplosmiddel in de cuvetten met de polymeerbibliotheek gedoseerd, wat resulteert in een polymeerconcentratie van 20 mg/mL. Wanneer al het oplosmiddel is gedoseerd, laat het polymeer dan één tot vijf minuten oplossen. Volg dit eventueel op met agitatie om een volledige polymeeroplossing en een uniforme eiwitverspreiding te waarborgen.Start vervolgens het programma voor monstertransport in LabVIEW. Elk opgelost polymeermonster in de bibliotheek wordt vervolgens in de lege spuit opgenomen en gedoseerd in de overeenkomstige buis met niet-oplosmiddel in de monsterhouder. Zodra elk monster is overgebracht, worden de eiwitgeladen nanodeeltjes teruggewonnen door de nanodeeltjesbibliotheek in een vacuümkamer bij een vacuüm van 10 millimeters kwik te plaatsen, of door vacuümfiltratie toe te passen totdat het oplosmiddel is verwijderd.Om de afgifte van ingekapseld BSA te onderzoeken, begint u met een diepe 96-well polypropyleenplaat die is aangepast door de bovenste halve inch van de wand van elke well van om en om aangrenzende kolommen in de plaat te verwijderen. Het verwijderen van de bovenkant van elke well tussen kolommen A en B, C en D, E en F, en G en H maakt vloeistofstroom tussen elk paar aangrenzende wells mogelijk wanneer deze tot het volledige overdrachtsvolume zijn gevuld. Voeg Texas red BSA-standaarden variërend van 1000 tot 10 microgram per milliliter toe aan de diepe 96-well plaat.Deze zullen worden gebruikt voor het berekenen van de eiwithoeveelheid en zullen ook rekening houden met fluorochroom-quenching. Reconstitueer de gewenste massa nanodeeltjes in PBS-buffer en sonicize vervolgens om de deeltjes gelijkmatig te verspreiden. Breng daarna de nanodeeltjesbibliotheek over naar de diepe 96-wellplaat en wacht tot de monsters naar de bodem van de wellplaat zijn gezakt. Vul vervolgens, met behulp van een pipetteerder, langzaam alle aangrenzende wells met PBS-buffer tot ongeveer een kwart inch vanaf de bovenkant van de well.Er moet voldoende buffer in de aangrenzende putjes aanwezig zijn zodat deze vrij tussen de putjes kan stromen. Sluit vervolgens de releaseplaat af met het deksel en plaats deze bij 37 °C onder agitatie. Gebruik gedurende het experiment op opeenvolgende tijdstippen een 9, 400 Typhoon flatbed fluorescentiescanner om de plaat te scannen met behulp van de juiste excitatie-, laser- en emissiefilters.Gebruik na het scannen software voor beeldkwantificering om de hoeveelheid vrijgekomen fluorochroom-geconjugeerd eiwit in elke release te kwantificeren. Texas Red BSA werd ingekapseld in een bibliotheek van polymere nanodeeltjes, gesynthetiseerd uit SA- en CPH-monomeren zoals beschreven in deze video, om de eiwitvrijgavekinetiek als functie van de polymeerchemie te bepalen. De eiwitgeladen nanodeeltjes werden één maand lang geïncubeerd bij 37 °C, waarbij op opeenvolgende tijdstippen fluorescentiescans werden uitgevoerd voor de kwantificering van de eiwitvrijgave.Zoals hier wordt aangetoond, is deze methode voor hydro-doorvoer gebruikt om de afgiftekinetiek van Texas Red BSA te bepalen uit een A-C-P-H-S-A polyanhydride nanodeeltjesbibliotheek. Er werden chemie-afhankelijke trends waargenomen, met toenemende afgiftesnelheden bij Sarich-filmchemieën. Vergelijkbare resultaten werden verkregen bij het gebruik van standaard assays voor eiwitkwantificatie.In een apart experiment werd de afgifte van Texas Red BSA uit CPT CPH polyanhydride-filmbibliotheken beoordeeld; zoals hier wordt getoond, werden kinetieken van nagenoeg nulde-orde afgifte waargenomen, waarbij cpeg-rijke films het eiwit het snelst afgaven, met potentiële toepassingen in het medische veld als biologisch afbreekbare apparaten voor geneesmiddelentoediening. Deze resultaten geven aan dat het gewenste afgifteprofiel van een therapeutisch geneesmiddel of vaccineantigeen kan worden beheerst door de polymeerchemie te wijzigen. Na deze procedure zijn andere combinatorische methoden ontwikkeld om gebieden zoals eiwitstabiliteit, cellulaire toxiciteit, cellulaire activatie en in vivo biodistributie te onderzoeken.Deze aspecten zijn belangrijk voor het rationele ontwerp van biomaterialen voor geneesmiddelentoediening en tissue engineering. Vergeet niet om geschikte PBM te dragen en veilige laboratoriumprocedures toe te passen gedurende het gehele protocol.

combinatorial-synthesis-high-throughput-protein-release-from-polymer

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Een beschrijving van de vorming van een polymeer met een microarray on-chip fotopolymerisatie techniek. De high throughput oppervlaktekarakterisering behulp van atomic force microscopy, water contacthoekmetingen, X-ray foto-elektron spectroscopie en vluchttijden secundaire ionen massaspectrometrie en celhechting assay wordt ook beschreven.

Polymeer Microarrays voor High Throughput Ontdekking van biomaterialen

We een microfluïdische benadering voor de expressie van eiwit arrays. De inrichting bestaat uit duizenden reactiekamers gecontroleerd door micro-mechanische kleppen. De microfluïdische apparaat is gekoppeld aan een microarray-gedrukte gen bibliotheek. Deze genen worden vervolgens getranscribeerd en getranslateerd on-chip, resulterend in een eiwit array klaar voor experimenteel gebruik.

High-throughput eiwit expressie Generator Met behulp van een Microfluïdische Platform

In dit artikel wordt een hoge doorvoer methode voorgesteld voor de synthese van Oligosacchariden en de bevestiging aan het oppervlak van polyanhydride nanodeeltjes voor verder gebruik in voor specifieke receptoren op antigeen-presenterende cellen.

High-throughput synthese van koolhydraten en functionalisering van polyanhydride Nanodeeltjes

Een eenvoudige, robuuste en schaalbare techniek om functionaliseren en zelf te monteren macroscopische nanodeeltjes-ligand monolaag films op-template gratis substraten wordt beschreven in dit protocol.

Een techniek om functionaliseren en zelf-assembleren Macroscopisch Nanoparticle-ligand Monolayer Films op-Sjabloonloze Substrates

We rapporteren protocollen voor het “polymeriseren” van verschillende soorten polymeer-ingekapselde metaal-nanodeeltjes tot lange ketens van “homo-“ en “co-polymeren”.

Met behulp van polystyreen<em&gt; Block</em&gt; Poly (acrylzuur) -gecoate Metal Nanodeeltjes als monomeren voor hun homo- en co-polymerisatie

Niet-geroerde precipitatie polymerisatie geeft een snelle, reproduceerbare prototyping aanpak van de synthese van stimuli-gevoelige poly (N -isopropylacrylamide) microgels smalle grootteverdeling. In dit protocol synthese, lichtverstrooiing karakterisering en enkel deeltje fluorescentie volgen van deze microgels in een wide-field microscopie setup worden gedemonstreerd.

Gecontroleerde Synthese en Fluorescentie Tracking of Highly Uniform Poly (<em&gt; N</em&gt; -isopropylacrylamide) Microgels

Nanomaterialen bieden veelzijdige mechanismen van gecontroleerde therapeutische aflevering voor zowel basiswetenschap en translationeel toepassingen, maar hun fabricage vaak vereist expertise die niet beschikbaar is in de meest biomedische laboratoria. Hier presenteren we protocollen voor het schaalbare fabricage en therapeutische laden van uiteenlopende zelf gemonteerd nanocarriers met behulp van flash nanoprecipitation.

Snelle, schaalbare montage en laden van bioactieve eiwitten en Immunostimulants in verschillende synthetische Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation

Hier presenteren we een protocol om eiwitmonomeer te vervoegen door enzymen die eiwitpolymeer vormen met een gecontroleerde sequentie en het op het oppervlak immobiliseren voor spectroscopiestudies met één molecuul.

OaAEP1-Gemedeerde Enzymatische Synthese en Immobilisatie van gepolymeriseerd eiwit voor Single-Molecule Force Spectroscopie

Nanogels zijn een uitstekend en veelzijdig nanodeeltjesplatform voor de levering van biologische geneesmiddelen. Stimuli-responsieve poly(ethyleen) glycol-gebaseerde polymere nano-gels, die in staat zijn om op eiwitten gebaseerde ladingen in te kapselen, werden gesynthetiseerd met behulp van een eenstaps cross-linking co-nanopolymerisatiestrategie in waterige omstandigheden. De optimale fabricage en karakterisering van deze nieuwe nanodeeltjes worden hier gepresenteerd.

Synthese van stimuli-responsieve nanogels met behulp van waterige eenstaps crosslinking en co-nanopolymerisatie

Hier presenteren we twee protocollen voor het inbedden van celvrije eiwitsynthesereacties in hydrogelmatrices op macroschaal zonder dat er een externe vloeibare fase nodig is.

Methoden voor het inbedden van celvrije eiwitsynthesereacties in hydrogels op macroschaal

De fabricage van een dubbellaags apparaat op basis van polydimethylsiloxaan (PDMS) voor de productie van combinatorische bibliotheken in water-in-olie-emulsies (pluggen) wordt hier gepresenteerd. De benodigde hardware en software die nodig zijn om de productie van stekkers te automatiseren, worden gedetailleerd beschreven in het protocol en de productie van een kwantitatieve bibliotheek van fluorescentiestekkers wordt ook gedemonstreerd.

Dubbellaags microfluïdisch apparaat voor de productie van combinatorische pluggen

Leer de combinatorische synthese van biologisch afbreekbare polyanhydride film- en nanopartikelbibliotheken met high-throughput detectie van eiwitafgifte voor biomedische toepassingen.

Combinatoriële Synthese van en high-throughput eiwit Op de markt van Polymer Film en Nanodeeltje bibliotheken

Meer video's verkennen