Name: Het analyseren van cellulaire internalisatie van nanodeeltjes en bacteriën door Multi-spectrale Imaging flowcytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 7 s
Description: Leer hoe u de internalisatie van nanodeeltjes en bacteriën door macrofagen analyseert met behulp van multi-spectrale imaging flowcytometrie. Deze methode onderscheidt geïnternaliseerde deeltjes van oppervlaktegebonden deeltjes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen graag de ONR-MURI Award (NN00014-06-1-1176) en het Amerikaanse leger Medical Research en Materieel Command (Grant Numeri W81XWH-09-1 tot 0386 en W81XWH-10-1-0806) bedanken voor de financiële ondersteunen.

<ol><li>Ulery, B. D., Kumar, D., Ramer-Tait, A. E., Metzger, D. W., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+protective+single-dose+intranasal+nanoparticle-based+vaccine+platform+for+respiratory+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Design of a protective single-dose intranasal nanoparticle-based vaccine platform for respiratory infectious diseases.</a> PLoS One. 6, e17642(2011).</li>
<li>Kasturi, S. P., Skountzou, I., Albrecht, R. A., Koutsonanos, D., Hua, T., Nakaya, H. I., Ravindran, R., Stewart, S., Alam, M., Kwissa, M., Villinger, F., Murthy, N., Steel, J., Jacob, J., Hogan, R. J., García-Sastre, A., Compans, R., Pulendran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+the+magnitude+and+persistence+of+antibody+responses+with+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programming the magnitude and persistence of antibody responses with innate immunity.</a> Nature. 470, 543-547 (2011).</li>
<li>Rice-Ficht, A. C., Arenas-Gamboa, A. M., Kahl-McDonagh, M. M., Ficht, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+particles+in+vaccine+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Polymeric particles in vaccine delivery.</a> Curr. Opin. Microbiol. 13, 106-112 (2010).</li>
<li>Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyanhydrides+as+localized+drug+delivery+carrier%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Opin.+Drug.+Deliv%22%5BJournal%5D)">Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update.</a> Expert. Opin. Drug. Deliv. 5, 889-907 (2008).</li>
<li>Pfeifer, B. A., Burdick, J. A., Little, S. R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ester-anhydride%29%3Apoly%28beta-amino+ester%29+micro-+and+nanospheres%3A+DNA+encapsulation+and+cellular+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Poly(ester-anhydride):poly(beta-amino ester) micro- and nanospheres: DNA encapsulation and cellular transfection.</a> Int. J. Pharm. 304, 210-219 (2005).</li>
<li>Ahmed, F., Friend, S., George, T. C., Barteneva, N., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numbers+matter%3A+quantitative+and+dynamic+analysis+of+the+formation+of+an+immunological+synapse+using+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Numbers matter: quantitative and dynamic analysis of the formation of an immunological synapse using imaging flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 347, 79-86 (2009).</li>
<li>Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+quantifying+phagocytosis+and+bacterial+killing+by+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for quantifying phagocytosis and bacterial killing by human neutrophils.</a> J. Immunol. Methods. 232, 15-22 (1999).</li>
<li>Rieger, A. M., Hall, B. E., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+differentially+modulates+particle+binding%2C+phagocytosis+and+downstream+antimicrobial+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Comp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation differentially modulates particle binding, phagocytosis and downstream antimicrobial mechanisms.</a> Dev. Comp. Immunol. 34, 1144-1159 (2010).</li>
<li>Murphy, K. C., Campellone, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lambda+Red-mediated+recombinogenic+engineering+of+enterohemorrhagic+and+enteropathogenic+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lambda Red-mediated recombinogenic engineering of enterohemorrhagic and enteropathogenic E. coli.</a> BMC. Mol. Biol. 4, 11(2003).</li>
<li>Karsi, A., Lawrence, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+host+range+fluorescence+and+bioluminescence+expression+vectors+for+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria.</a> Plasmid. 57, 286-295 (2007).</li>
<li>Ulery, B. D., Phanse, Y., Sinha, A., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B., Bellaire, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+chemistry+influences+monocytic+uptake+of+polyanhydride+nanospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres.</a> Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).</li>
<li>Doherty, G. J., McMahon, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of endocytosis.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 857-902 (2009).</li>
<li>Vercauteren, D., Vandenbroucke, R. E., Jones, A. T., Rejman, J., Demeester, J., De Smedt, S. C., Sanders, N. N., Braeckmans, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+inhibitors+to+study+endocytic+pathways+of+gene+carriers%3A+optimization+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls.</a> Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).</li>
<li>Di Marzio, L., Marianecci, C., Cinque, B., Nazzarri, M., Cimini, A. M., Cristiano, L., Cifone, M. G., Alhaique, F., Carafa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH-sensitive+non-phospholipid+vesicle+and+macrophage-like+cells%3A+binding%2C+uptake+and+endocytotic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">pH-sensitive non-phospholipid vesicle and macrophage-like cells: binding, uptake and endocytotic pathway.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1778, 2749-2756 (2008).</li>
<li>Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+novel+polyanhydrides+with+tailored+erosion+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).</li>
</ol>

Sherree L. vriend is in dienst van Amnis Corporation, die de ImageStream X-systeem produceert.

Onderzoek heeft aangetoond dat biologisch afbreekbare nanodeeltjes gebaseerd op poly (melkzuur-co-glycolzuur (PLGA) of polyanhydriden kan worden ingekapselde antigenen of geneesmiddelen leveren doelcellen. Opname van deze nanodeeltjes van fagocyten belangrijk voor de effectiviteit, waardoor kwantitatieve . analyse van de internalisatie van cruciaal belang in het ontwerpen van nieuwe nanodeeltjes systemen Door gebruik te maken van deze methode kan differentiële opname van nanodeeltjes door verschillende celtypen worden g...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> RAW 264,7 cellijn </td><td> American Type Culture Collection (ATCC) </td><td> TIB-71 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) </td><td> Cellgro </td><td> 10 tot 013-CV </td><td></td></tr><tr><td> Foetaal runderserum </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S 11150 </td><td> Van hoge kwaliteit </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Gibco </td><td> 35050-061 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Gibco </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> 24-wells plaat</td><td> TPP </td><td> 92024 </td><td></td></tr><tr><td> Celcultuur Kolven </td><td> TPP </td><td> 90151 </td><td></td></tr><tr><td> Cell schraper </td><td> TPP </td><td> 99002 </td><td> 24 cm </td></tr><tr><td> Salmonella enterica serovar Typhimurium </td><td> ATCC </td><td> 14028 </td><td></td></tr><tr><td> BTX ECM630 Electro Cell Manipulator </td><td> BTX Harvard Apparatuur </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MOPS </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP308 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) </td><td> Cellgro </td><td> 21 tot 040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Ultrasoon vloeistof processor </td><td> MisOnix </td><td> S-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Cytochalasine-D </td><td> Sigma-Aldrich, </td><td> C8273 </td><td></td></tr><tr><td> Formaldehyde </td><td> Polysciences </td><td> 04018 </td><td></td></tr><tr><td> Was buffer </td><td> 2% hitte geïnactiveerd FBS, 0,1% natriumazide in PBS. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Perm / wasbuffer </td><td> BD Biosciences </td><td> 554714 </td><td></td></tr><tr><td> Clear-view klikdop microbuisjes </td><td> Sigma </td><td> T4816 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor phalloidin 660 </td><td> Invitrogen </td><td> A22285 </td><td></td></tr><tr><td> ImageStream X </td><td> Amnis CorporaTIE </td><td> 100200 </td><td> Opties: 658nm laser, autosampler </td></tr><tr><td> Natriumazide </td><td> Fisher Scientific </td><td> S 227I-500 </td><td></td></tr></tbody></table>

het analyseren van cellulaire internalisatie van nanodeeltjes en bacteriën door multi-spectrale imaging flowcytometrie

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanodeeltjes systemen naar voren zijn gekomen als waardevolle instrumenten in de toediening van vaccins door hun vermogen om efficiënt te leveren goederen, waaronder eiwitten, aan antigeen presenterende cellen 1-5. Internalizatie van nanodeeltjes (NP) door antigeen-presenterende cellen een belangrijke stap in het genereren van een effectieve immuunrespons de ingekapselde antigeen. Om hoe veranderingen in nanopartikelformulering invloed functie te bepalen, hebben we getracht een high throughput, kwantitatieve experimentele protocol dat in overeenstemming was met het opsporen van geïnternaliseerde nanodeeltjes evenals bacteriën te ontwikkelen. Tot op heden zijn twee onafhankelijke technieken, microscopie en flowcytometrie, zijn de methoden die worden gebruikt om de fagocytose van nanodeeltjes te bestuderen. De high throughput aard van flowcytometrie genereert robuuste statistische gegevens. Echter, als gevolg van lage resolutie, is niet nauwkeurig te kwantificeren geïnternaliseerd versus cel gebonden nanodeeltjes. Microscopie genereert beelden met een hoge ruimtelijke resolutie, hHof toevoegde, het is tijdrovend en het gaat om kleine steekproeven 6-8. Multi-spectrale beeldvorming flowcytometrie (MIFC) is een nieuwe technologie die aspecten van zowel microscopie en flowcytometrie dat multi-color spectrale fluorescentie en helder field imaging voert tegelijkertijd door middel van een laminaire kern opgenomen. Deze mogelijkheid biedt een nauwkeurige analyse van fluorescent signaal intensiteiten en ruimtelijke relaties tussen verschillende structuren en cellulaire functies op hoge snelheid. Hierin beschrijven we een methode gebruik te maken van MIFC om de celpopulaties die zijn geïnternaliseerd polyanhydride nanodeeltjes of Salmonella enterica serovar Typhimurium karakteriseren. We beschrijven ook de voorbereiding van nanodeeltjes suspensies, cel-etikettering, de verwerving van een ImageStream X-systeem en de analyse van de gegevens met behulp van het IDEAS-toepassing. Ook tonen de toepassing van een techniek die kan worden gebruikt om de internalisatie p onderscheidenathways voor nanodeeltjes en bacteriën door het gebruik cytochalasine-D als een remmer van actine-gemedieerde fagocytose.

In dit artikel beschrijven we een methode gebruik te maken van multi-spectraal imaging flowcytometrie om de internalisering van polyanhydride nanodeeltjes of bacteriën door RAW 264.7 cellen te kwantificeren.

Het analyseren van cellulaire internalisatie van nanodeeltjes en bacteriën door Multi-spectrale Imaging flowcytometrie

Nanodeeltjessystemen zijn waardevolle instrumenten geworden voor de toediening van vaccins dankzij hun vermogen om vracht, waaronder eiwitten, efficiënt af te leveren bij ...

Om de cellulaire mechanismen van internalisatie van nanodeeltjes en bacteriën te analyseren via multispectrale imaging flowcytometrie. Macrofagen worden eerst voorbehandeld met cytochalasin D om actinpolymerisatie te remmen. Nanodeeltjes of Salmonella worden toegevoegd aan de macrofaagmonolaag en geïncubeerd.Vervolgens worden de macrofagen geoogst, gefixeerd en gelabeld voor analyse met een imagestroom. Met een multispectrale imaging flowcytometer worden cellen die nanodeeltjes en/of salmonella hebben geïnternaliseerd onderscheiden van cellen met aan het oppervlak gebonden nanodeeltjes en/of salmonella. De resulterende gegevens geven aan dat zowel salmonella als nanodeeltjes alleen worden geïnternaliseerd door cellen die niet zijn behandeld met cyto klain.D suggereert dat internalisatie actine-afhankelijk is. Deze techniek biedt verschillende voordelen ten opzichte van bestaande methoden zoals flowcytometrie en confocale microscopie. In het bijzonder biedt het een nauwkeurige meting van fluorescentiesignaalintensiteiten en ruimtelijke resolutie tussen verschillende cellulaire kenmerken bij hoge snelheid.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen voor zowel onderzoe

analyzing-cellular-internalization-nanoparticles-bacteria-multi

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Source: Zhang, Y., et al. Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the use of fluorescent nanoparticles to visualize endo-lysosomal remodeling in human epithelial cells infected by intracellular bacteria. Following bacterial invasion, the pathogens manipulate the host cytoskeleton and endo-lysosomal system, forming vacuoles with tubular projections that alter vesicle transport.

Nanoparticle-Mediated Visualization of Endo-Lysosomal Remodeling in Bacterially-Infected Cells

Wij evalueren onze recente resultaten op de integratie van fluorescentie microscopie en beeldvorming flowcytometrie tools op een mobiele telefoon met behulp van compacte en kosteneffectieve opto-vloeibare bijlagen. Deze mobiele telefoon op basis van micro-analyse-apparaten kan nuttig zijn voor cytometrische analyse, zoals het uitvoeren van diverse cellen tellen taken alsook voor high-throughput screening van bijvoorbeeld watermonsters in resource minder instellingen.

Wide-field fluorescentie microscopie en fluorescentie imaging Flowcytometrie op een mobiele telefoon

In deze studie was het belangrijkste doel om de cellulaire opname en uiteindelijke exocytose van koolstofnanobuizen (CNT's) te monitoren. Vanuit dit perspectief stelden we hier een unieke methode voor die gebruikmaakt van multispectrale beeldvorming en stromende cytometrie, waardoor een kwantificering en lokalisatie van CNT's in een statistisch relevant aantal cellen mogelijk is.

Lokalisatie en relatieve kwantificering van koolstofnanobuizen in cellen met multispectrale beeldvorming en doorstromende cytometrie

Analyse van nanodeeltjes interactie met gedefinieerde subpopulaties van immune cellen door flowcytometrie.

Detectie van TL Nanoparticle Interacties met Primary Immune celtypes door flowcytometrie

Dit artikel beschrijft methoden voor de synthese en TL-etikettering van nanodeeltjes (NP). De NP's werden toegepast in pulse-chase experimenten om de endo-lysosomale systeem van eukaryotische cellen te labelen. Manipulatie van de endo-lysosomale systeem door de activiteiten van de intracellulaire pathogeen Salmonella enterica werden gevolgd door live cell imaging en gekwantificeerd.

Toepassing van TL Nanodeeltjes naar herinrichting van de Endo-lysosomale systeem Bestudeer door intracellulaire bacteriën

Deze methode toont een techniek voor het beoordelen van de functie van granulocyten door gelijktijdig de fagocytose van bacteriën en oxidatieve burst te meten. Beeldgebaseerde flowcytometrie maakte het mogelijk om drie verschillende subsets van geactiveerde granulocyten te identificeren die allemaal verschilden in hun relatieve functionele capaciteit.

Image-based flowcytometrie Techniek om Veranderingen in Granulocyt Functie Evalueer In Vitro

Flow cytometrische analyse heeft waardevol voor het onderzoeken van zuivere culturen en controle van de microbiële Gemeenschap dynamiek bewezen. Wij presenteren drie uitgebreide werkstromen, van monsterneming tot data-analyse, voor zuivere culturen en complexe gemeenschappen in duidelijke medium zoals in uitdagende matrices, respectievelijk.

Wezenlijke Microbiome Dynamics – Stroom Cytometry gebaseerd werkstromen van reinculturen aan natuurlijke gemeenschappen

De in-vitro-micronucleustest is een gevestigde methode voor het evalueren van genotoxiciteit en cytotoxiciteit, maar het scoren van de test met behulp van handmatige microscopie is moeizaam en lijdt onder subjectiviteit en variabiliteit tussen de scorer. Dit artikel beschrijft het protocol dat is ontwikkeld om een volledig geautomatiseerde versie van de test uit te voeren met behulp van multispectrale beeldvormings stroom cytometrie.

Een geautomatiseerde methode voor het uitvoeren van de in-vitro micronucleus assay met behulp van multispectrale beeldvormings stroom Cytometrie

Dit artikel presenteert de integratie van een spectrale focusmodule en een dual-output pulslaser, waardoor snelle hyperspectrale beeldvorming van gouden nanodeeltjes en kankercellen mogelijk wordt. Dit werk is bedoeld om de details van multimodale niet-lineaire optische technieken te demonstreren op een standaard laserscanmicroscoop.

Biomoleculaire beeldvorming van cellulaire opname van nanodeeltjes met behulp van multimodale niet-lineaire optische microscopie

Dit protocol beschrijft een kwantitatieve benadering om microbiële autoaggregatie te meten met behulp van beeldvormende flowcytometrie.

Beeldvorming flowcytometrie om microbiële autoaggregatie te bestuderen

Deze studie verheldert de fagocytische verwerking van Godanti Bhasma (GB) deeltjes in zoogdiercellen, waarbij hun cellulaire opname, vacuoledynamiek, verzuring en afbraak worden gekarakteriseerd. Deze bevindingen vergroten niet alleen ons begrip van fundamentele fagocytosemechanismen, maar vestigen GB ook als een veelbelovend modelsysteem voor het ontwikkelen van nieuwe therapeutische strategieën.

Onderzoek naar de sequentiële cellulaire gebeurtenissen van fagocytose veroorzaakt door Godanti Bhasma in zoogdiercellen

Leer hoe u de internalisatie van nanodeeltjes en bacteriën door macrofagen analyseert met behulp van multi-spectrale imaging flowcytometrie. Deze methode onderscheidt geïnternaliseerde deeltjes van oppervlaktegebonden deeltjes.

Het analyseren van cellulaire internalisatie van nanodeeltjes en bacteriën door Multi-spectrale Imaging flowcytometrie

Meer video's verkennen