Het analyseren van cellulaire internalisatie van nanodeeltjes en bacteriën door Multi-spectrale Imaging flowcytometrie

Om de cellulaire mechanismen van internalisatie van nanodeeltjes en bacteriën door middel van multispectrale beeldvorming en stromingscytometrie te analyseren. Macrofagen worden eerst behandeld met cyto klain D om actinepolymerisatie te remmen. Nanodeeltjes of salmonella worden toegevoegd aan de macrofaag, monolaag en geïncubeerd.

Vervolgens worden de macrofagen geoogst, gefixeerd en gelabeld voor analyse met behulp van een beeldstroom. Multispectrale beeldvorming en stromingscytometrie onderscheidt cellen die nanodeeltjes en/of salmonella hebben geïnternaliseerd van die met oppervlaktegebonden nanodeeltjes en/of salmonella. De resulterende gegevens geven aan dat zowel salmonella als nanodeeltjes alleen worden geïnternaliseerd door cellen die niet zijn behandeld met cyto klain.

D suggereert dat internalisatie actine-afhankelijk is. Deze techniek heeft verschillende voordelen boven bestaande methoden zoals stromingscytometrie en confocale microscopie. In de eerste plaats biedt het een nauwkeurige meting van fluorescentiesignalen en ruimtelijke resolutie tussen verschillende cellulaire kenmerken met hoge snelheid.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen voor zowel biomaterialenvaccin- als geneesmiddelafleveringsonderzoek, evenals een groot aantal onderzoeken naar de interactie van pathogenen. Dit omvat het bepalen van de internalisatieroutes die worden gebruikt door poly-anhydride nanodeeltjes en bacteriën. Over het algemeen worstelen individuen die nieuw zijn met deze methode vaak.

Het is belangrijk om tijd te besteden aan het titeren van de kleurstoffen om optimale fluorescentiesignalen te verkrijgen. Ook het leren kennen van de software en het maken van analysetemplates neemt tijd in beslag. We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we ontdekten dat poly-hydro nanodeeltjes pathogeen-nabootsende kenmerken vertonen bij het gebruik van microscopie en andere technieken.

We wilden vervolgens een high-throughput systeem om de internalisatieprocessen te vergelijken die worden gebruikt door salmonella en de pollenhydride nanodeeltjes Voor het uitvoeren van de test. Alle zoogdier- en bacterieelcelculturen moeten worden geoogst en nanodesuspensies moeten worden bereid. Begin met het oogsten van confluente RA W2 64.7 cellen met behulp van een celschraper.

Bepaal het aantal cellen met behulp van een hemo cytometer. Bepaal vervolgens de cellen in een 24-wells cultuurschaal met een dichtheid van vijf keer 10 tot de vijfde cellen per put in 0,5 milliliter. Volledig DMEM incuberen overnacht bij 37 graden Celsius en een 5%CO2 incubator.

Om de salmonella tarica te bereiden, verdun transformeerde salmonella in C-D-M-E-M om een multipliciteit van infectie van honderd per RA W2 64.7 cellen in een 16 bij 125 millimeter autoclave schroefflens glazen kweekbuis te verkrijgen. Weeg vervolgens met behulp van gesteriliseerd weipapier vijf milligram van 1%FITC geladen poly-anhydride nanodeeltjes af, gegenereerd zoals beschreven door rean-collega's in hun publicatie uit 2009 en farmaceutisch onderzoek in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Voeg de nanodeeltjes toe aan 0,5 milliliter koud fosfaatgebufferd zoutwater en plaats het op ijs.

Houd de buis op ijs. Gebruik een ultrasone vloeistofprocessor met een microtip om de suspensie gedurende ongeveer 25 seconden bij vier tot zes joule te sonificeren. Nu alle benodigde cellen en reagentia klaar zijn, kan de fagocytosetest worden uitgevoerd.

Label 24, putjes van weefselcultuurplaten die RA W2 64.7 cellen bevatten in cultuur in voorbereiding voor de test op de eerste plaat. Elk van de volgende monsters zal worden getest in triplicate, cyto en D met nanodeeltjes, cyto en D met salmonella, medium met nanodeeltjes, medium met salmonella nanodeeltjes alleen, salmonella alleen en AF zes 60 kleuring cellen alleen vier graden Celsius. Controles worden getest op de tweede plaat en zullen medium plus nanodeeltjes en medium plus salmonella bevatten. Incubatie bij deze lage temperatuur vertraagt cellulaire processen zoals fagocytose een uur voorafgaand aan inductie. Voeg vijf microgram per milliliter van cyto en D en C-D-M-E-M toe aan de geschikte putjes en incubeer de cellen bij 37 graden Celsius.

Na de incubatie, roer de nanodesuspensie door en voeg 10 microliter toe aan de geschikte putjes. Roer vervolgens de salmonella door en voeg deze toe aan de geschikte putjes bij een MOI van 100. Tik een paar keer op de plaat om te mengen.

Plaats vervolgens de monsterschalen bij 37 graden Celsius en de negatieve controleschalen bij vier graden Celsius gedurende 45 minuten. Na de incubatie, plaats de schalen op ijs, was de cellen twee keer met ijskoud PBS zonder calcium en magnesium door het oude medium af te zuigen en weg te gooien om niet-gebonden deeltjes, salmonella en dode of losgekoppelde cellen te verwijderen. Gebruik van petal magnesium.

Pre PBS in dit stadium is essentieel omdat het de loskoppeling van cellen van het substraat vergemakkelijkt. Om de cellen te oogsten, voeg 250 microliter ijskoud PBS toe en schraap voorzichtig de putjes, pipet de geoogste cellen in siliconen snapcap microcentrifugebuisjes en bewaar ze op ijs. Was de cellen door één milliliter koud wasbuffer toe te voegen, centrifugeer vervolgens bij 250 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Na het weggooien van het supernatant, verwijder de resterende buffer door de omgekeerde microcentrifugebuis op papier te tikken.

Handdoek hersuspenseer het cellenpelletje door voorzichtig de microcentrifugebuis over een reageerbuisrek te raken. Om de cellen te fixeren, voeg 100 microliter van 4% paraformaldehyde in PBS toe en laat de cellen gedurende 15 minuten staan. Was de cellen bij kamertemperatuur door één milliliter perm wasbuffer toe te voegen, centrifugeer vervolgens bij 250 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.

Na het weggooien van het supernatant, verwijder de resterende buffer zoals hiervoor. Vervolgens om de RA W2 64.7 cellen te kleuren. Voor actine, voeg 100 microliter van perm wasbuffer toe met Alexa Fluora foid in zes 60 gedurende 15 minuten.

Bij kamertemperatuur moeten de ongekleurde monsters worden geïncubeerd met perm, was