Name: In vitro Mesothelial Ontruiming Assay dat de modellen van de vroege stappen van eierstokkanker Metastase (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Leer hoe eierstokkankersferoïden mesotheliale monolagen binnendringen met fluorescentie-tijdsverloopmicroscopie. Deze methode kwantificeert invasiedynamiek en ondersteunt onderzoek naar vroege metastase.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag de Nikon Imaging Center aan de Harvard Medical School, in het bijzonder Jennifer Waters, Lara Petrak en Wendy Zalm, voor de opleiding en het gebruik van hun timelapse microscopen bedanken. Wij zouden ook graag Rosa Ng en Achim Besser bedanken voor waardevolle discussies. Dit werk werd ondersteund door NIH Grant 5695837 (tot M. Iwanicki) en GM064346 aan JSB, door een subsidie ​​van Dr Miriam en Sheldon Adelson G. Medical Research Foundation (tot GCO).

1. Ovarian Cancer Cell Spheroid Vorming <ol><li> RFP expressie ovariumkanker cellen gekweekt in 10% basismedium (een maat celkweekmedium bevattende een 50:50 mengsel van 199 en MCDB105 10% geïnactiveerd foetaal runderserum en 1% pen-strep). Om RFP uitdrukken gelabelde ovarium kankercellen transfecteren de cellen met een plasmide dat RFP en selecteren cellen die RFP. Als alternatief kan virale vectoren worden gebruikt om op transiënte drukken fluorescente eiwitten en cellen kan vooraf geïncubeerd met een fluorescerende kleurstof cel tracker (Invitrogen). </li><li> Voorafgaand aan het vormen van ovariumkanker sferoïden, moet bereiden lage wrijvingscoëfficiënt 96 en ronde bodem kweekschalen. Om lage wrijvingscoëfficiënt kweekplaten produceren 30μl poly-HEMA (6 mg polyhydroxyethylmethacrylaat in 1 ml 95% EtOH) oplossing toegevoegd aan elk putje van een 96 Corning celkweek schotel. De platen met 96 putjes werden geïncubeerd in een 37 ° C niet-bevochtigde incubator de ethanol, l verdampeneaving een laag poly-HEMA op elk putje. Deze poly-HEMA film voorkomt cellen zich hecht aan de bodem van de put, waardoor de cellen in suspensie groeien 18. [Als alternatief kan Ultra-Low Attachment kweekplaten (Corning) worden gebruikt in plaats van poly-HEMA gecoat gerechten.] </li><li> Na het lage-adhesie kweekplaten bereid, trypsinize een plaat ovarium kankercellen pellet cellen in een tafelblad centrifuge (Heraeus) 900 RCF 3 minuten zuig de supernatant en in suspensie opnieuw in 10% basismedium. </li><li> Tel het aantal cellen met behulp van een hemocytometer. </li><li> Stel de concentratie van cellen, dat er 100 cellen per 50 ul 10% basismedium. </li><li> Voeg 50 ul van het uniform opgeschort verdunde celsuspensie in elke well van de 96 goed poly-HEMA gecoate cultuur schotel. </li><li> Incubeer de plaat met 96 putjes in een 37 ° C celkweek incubator gedurende 16 uur (de tijd worden verhoogd of verlaagd afhankelijk van de hoeveelheid tijd dieeen bepaalde cel lijn naar meercellige sferoïden of gewenst experimentele condities) vormen voor de eierstokkanker cellen samen te laten cluster, de vorming van een meercellige sferoïde in elk putje. Sommige tumorcellen apoptose ondergaan in deze periode is het van belang een tijd kiezen voor inductie van apoptose. </li></ol> 2. Mesothelial Cell monolaagvorming <ol><li> In een celkweek kap voorlaag de putjes van een 6 goed glazen bodem MatTek schaal met fibronectine door toevoeging van 2 ml van een 5μg fibronectine / ml PBS oplossing in elk putje van de schotel en incubatie bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. De optische kwaliteit van het glas-bottoms in MatTek gerechten zorgen voor een hoge resolutie microscopische beeldvorming. </li><li> GFP-expressie mesotheelcellen gekweekt in 10% basismedium. Trypsinize een plaat van mesotheelcellen, naar beneden draaien in een tafelblad centrifuge (Heraeus) op 900RPM gedurende 3 minuten, zuig het supernatant, en opnieuw te schorten in 10% Base Medium. Demesotheelcellen hier gebruikt reeds expressie GFP wanneer ze verkregen, maar ongelabelde mesotheelcellen kan worden door transfectie met een plasmide dat GFP cDNA of preincubating de cellen in een groen fluorescerend cel tracker kleurstof (Invitrogen). </li><li> Na de 30-minuten fibronectine incubatie (in stap 2.1), was de putjes van de MatTek schotel met 2 ml PBS. </li><li> Zuig het PBS en de plaat 6 x10 5 mesotheelcellen cel per putje in elke well van de 6 goed MatTek schotel. Incubeer de MatTek schotel in een 37 ° C celkweek incubator nacht om de mesotheelcellen te hechten aan de schaal en een monolaag vormen. </li></ol> 3. Mesothelial Cell Clearance Assay <ol><li> Gebruik een pipet om de kanker van de eierstokken sferoïden te halen bij de 96 en poly-HEMA gecoate plaat. </li><li> Zuig het medium van een goed van de 6 goed MatTek schotel met een mesotheelcellen cel monolaag. Was eenmaal met 2 ml PBS. Voeg alle sferoïden van de 96 goed plaat een put van het MatTek schotel (3x ~ het aantal sferoïden die zullen worden afgebeeld om rekening te houden sferoïden landing van de zijde van de schotel te kunnen afgebeeld). </li><li> Plaats de MatTek schotel op het podium van een omgekeerde groothoek fluorescentiemicroscoop staat om time-lapse imaging voor de duur van ten minste 8 uur. Gebruik een gemotoriseerde podium om afbeelding meerdere posities in de schotel, met meerdere sferoïde intercalatie gebeurtenissen, in een enkel experiment. We maken gebruik van een Nikon Ti-E Inverted Gemotoriseerde Widefield Fluorescentie time-lapse microscoop met geïntegreerde Perfect Focus System en lage [20x-0.75 numerieke apertuur (NA)] vergroting / NA differentieel interferentie contrast (DIC) optica, een Nikon halogeen transilluminator met 0,52 NA lange werkafstand (LWD) condensor, Nikon snel (&lt;100 ms schakeltijd) excitatie en emissie filters (GFP Ex 480/40, Em 525/50, RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50), Sutter snel overgedragen en epifluorescentie lichtpad Smart Shutters, een Nikon lineaire-gecodeerde gemotoriseerde podium, een Hamamatsu ORCA-AG gekoeld charge-coupled device (CCD) camera, een custom-built microscoop incubatiekamer met de temperatuur en CO 2-controle, Nikon NIS-elementen AR-software versie 3, en een TMC trillingsisolatie tafel. </li><li> De ovarium kankercellijn sferoïden zal naar de bodem van de schotel en hechten aan de mesotheelcellen celmonolaag. Verzamel GFP, RFP en fase beelden van de 20 + sferoïde / monolaag interacties, elke 10 minuten, gedurende 8 uur. </li><li> De RFP expressie ovarium kankercellijn sferoïden zal binnendringen in de GFP expressie mesotheelcellen celmonolaag een gat in de monolaag. Na 8 uur meten de grootte van de gaten door het opsporen van de zwarte gaten GFP beelden met behulp Elements (of een ander geschikt software zoals beeld J). Normaliseren gatgrootte de eerste bolvormige grootte wordt door het gat 8 uur door de grootte van de bolvormige de overeenkomstige RFP beeld op tijdstip nul. In exruime, werd het gat grootte slechts een keer gemeten, maar het kan gemeten worden meerdere keren gedurende de acht uur durende experiment beter inzicht in de dynamiek van intercalatie. </li></ol> 4. Representatieve resultaten In dit voorbeeld vergeleken mesotheelcellen goedkeuring vermogen van OVCA433 ovarium kankercellijn sferoïden dat verzwakte expressie van Talin-1 OVCA433 sferoïden beheersen. OVCA433 sferoïden van elke groep werden toegevoegd aan een MatTek schotel met ZT mesotheelcellen celmonolagen. Zes sferoïden van elke groep werden afgebeeld elke 10 minuten voor acht uur (Figuur 4, Film 3, Film 4). De gaten die in de monolaag door het verspreidorgaan sferoïden gemeten en zes positie van elke groep werden gemiddeld. Figuur 4 laat zien dat de gemiddelde klaring gebied gecreëerd door Tallinn een knockdown sferoïden was aanzienlijk kleiner dan de gemiddelde oppervlakte aan controle sferoïden, wat suggereert dat Tallinn is vereist voor mesotheelcellen klaring door OVCA433 eierstokkanker sferoïden. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3888/3888fig1.jpg" /> Figuur 1. Eierstokkanker Metastase. Primaire ovariële tumoren te ontwikkelen, hetzij bij de ovariële oppervlakte-epitheel of eileiders. Tumorcellen / clusters af te breken uit de primaire tumor en verzamelen in de buikholte. Tumorcellen kunnen dan samen tot meercellige sferoïden te vormen. Sferoïden dan hechten aan de mesotheelcellen cel monolagen langs de buikholte. De mesotheelcellen zijn uitgesloten van onder de bijgevoegde ovariumkanker sferoïde, waardoor de sferoïden toegang tot de onderliggende kelder membraan te verkrijgen. Movie 1. Eierstokkanker Metastase. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_1_Lower_Quality.mp4">Klik hier om film te bekijken</a> . <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3888/3888fig2.jpg" /> Figuur 2. </strong&gt; mesotheelcellen lijn het oppervlak van menselijke peritoneale weefsel en zijn uitgesloten van onder eierstokkanker cel implantaten. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3888/3888fig3.jpg" /> Figuur 3. Mesothelial Clearance Assay. Ovarium kanker sferoïden gevormd door incubatie 100 RFP expressie ovariumkanker cellen per putje in een poly-HEMA gecoate 96 en rondbodem kweekschaal bij 37 ° C gedurende 16 uur. Poly-HEMA voorkomt dat de cellen hechten aan de kweekschaal, waardoor de cellen gesuspendeerd blijven en elkaar hechten tot een cluster vormt per well. Mesotheelcellen celmonolagen bereid door uitplaten 6x10 5 mesotheelcellen per putje in een fibronectine gecoate 6 goed MatTek schaal en incuberen van de plaat bij 37 ° C gedurende 16 uur. De sferoïden worden vervolgens overgedragen aan de MatTek schotel met de mesothelial monolaag en de twee celpopulaties worden afgebeeld elke 10 minuten voor 8 uur met een Nikon Ti-E-Inverted Gemotoriseerde Widefield Fluorescentie time-lapse microscoop en Elements-software. Movie 2. Mesothelial Ontruiming Assay. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_2_lower_quality.mp4">Klik hier om film te bekijken</a> . <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3888/3888fig4.jpg" /> Figuur 4. Verzwakking van Tallinn 1 expressie in OVCA433 sferoïden verlaagt mesotheelcellen klaring vermogen. OVCA433 sferoïden (rood) met en zonder verzwakte expressie van Talin een mochten hechten aan en in een ZT mesotheelcellen monolaag (groen) dringen. De twee celpopulaties werden afgebeeld elke 10 minuten voor 8 uur met een Nikon Ti-E Inverted Gemotoriseerde Widefield Fluorescentie time-lapse microscoop en elementen software. De grafiek laat zien dat Tallinn een verzwakkingaanzienlijk vermindert mesotheelcellen cel klaring (kwantiel plot met groene balken aan de middelen). Movie 3. Controle OVCA433 sferoïden (rood) binnen te vallen in een mesotheelcellen monolaag (groen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_3.mov">Klik hier om film te bekijken</a> . Movie 4. Verzwakking van Tallinn 1 expressie in OVCA433 sferoïden (rood) vermindert mesotheelcellen (groen) ruimte vermogen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_4.mov">Klik hier om de film te bekijken</a> .

<ol><li>Jemal, A. CA Cancer J. Clin. 59, 225-249 (2009).</li>
<li>Ries, L. G., Melbert, D., Krapcho, M., Stinchcomb, D. G., Howlader, N., Horner, M. J., Mariotto, A., Miller, B. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRies%2C+LG+%22SEER+Cancer+Statistics+Review%2C+1975-2005%22">SEER Cancer Statistics Review, 1975-2005</a>. , National Cancer Institute. Bethesda, MD. Available from: 
 
 <a target="_blank" href="http://seer.cancer.gov/csr/1975_2005">http://seer.cancer.gov/csr/1975_2005</a> (2007).</li>
<li>Burleson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+carcinoma+ascites+spheroids+adhere+to+extracellular+matrix+components+and+mesothelial+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers.</a> Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).</li>
<li>Birbeck, M. S., Wheatley, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Electron+Microscopic+Study+of+the+Invasion+of+Ascites+Tumor+Cells+into+the+Abdominal+Wall%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">An Electron Microscopic Study of the Invasion of Ascites Tumor Cells into the Abdominal Wall.</a> Cancer Res. 25, 490-497 (1965).</li>
<li>Witz, C. A., Monotoya-Rodriguez, I. A., Schenken, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+explants+of+peritoneum+and+endometrium%3A+a+novel+model+of+the+early+endometriosis+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Whole explants of peritoneum and endometrium: a novel model of the early endometriosis lesion.</a> Fertil. Steril. 71, 56-60 (1999).</li>
<li>Zhang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+growth+patterns+of+human+peritoneal+mesothelial+cells%3A+comparison+between+advanced+epithelial+ovarian+cancer+and+non-ovarian+cancer+sources%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Soc.+Gynecol.+Investig%22%5BJournal%5D)">Characteristics and growth patterns of human peritoneal mesothelial cells: comparison between advanced epithelial ovarian cancer and non-ovarian cancer sources.</a> J. Soc. Gynecol. Investig. 6, 333-340 (1999).</li>
<li>Kenny, H. A., Nieman, K. M., Mitra, A. K., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+First+Line+of+Intra-abdominal+Metastatic+Attack%3A+Breaching+the+Mesothelial+Cell+Layer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">The First Line of Intra-abdominal Metastatic Attack: Breaching the Mesothelial Cell Layer.</a> Cancer Discovery. 1, 100-102 (2011).</li>
<li>Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+human+ovarian+tumor+cells+with+human+mesothelial+cells+grown+on+extracellular+matrix.+An+in+vitro+model+system+for+studying+tumor+cell+adhesion+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Interactions of human ovarian tumor cells with human mesothelial cells grown on extracellular matrix. An in vitro model system for studying tumor cell adhesion and invasion.</a> Exp. Cell. Res. 160, 499-513 (1985).</li>
<li>Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+novel+3D+culture+model+to+elucidate+the+role+of+mesothelial+cells%2C+fibroblasts+and+extra-cellular+matrices+on+adhesion+and+invasion+of+ovarian+cancer+cells+to+the+omentum%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells to the omentum.</a> Int. J. Cancer. 121, 1463-1472 (2007).</li>
<li>Ksiazek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+peritoneal+mesothelial+cells+promote+ovarian+cancer+cell+adhesion%3A+the+role+of+oxidative+stress-induced+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Senescent peritoneal mesothelial cells promote ovarian cancer cell adhesion: the role of oxidative stress-induced fibronectin.</a> Am. J. Pathol. 174, 1230-1240 (2009).</li>
<li>Burleson, K. M., Boente, M. P., Pambuccian, S. E., Skubitz, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disaggregation+and+invasion+of+ovarian+carcinoma+ascites+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Disaggregation and invasion of ovarian carcinoma ascites spheroids.</a> J. Transl. Med. 4, 6-6 (2006).</li>
<li>Heyman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitronectin+and+its+receptors+partly+mediate+adhesion+of+ovarian+cancer+cells+to+peritoneal+mesothelium+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Tumour.+Biol%22%5BJournal%5D)">Vitronectin and its receptors partly mediate adhesion of ovarian cancer cells to peritoneal mesothelium in vitro.</a> Tumour. Biol. 29, 231-244 (2008).</li>
<li>Heyman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesothelial+vitronectin+stimulates+migration+of+ovarian+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">Mesothelial vitronectin stimulates migration of ovarian cancer cells.</a> Cell. Biol. Int. 34, 493-502 Forthcoming.</li>
<li>Lessan, K., Aguiar, D. J., Oegema, T., Siebenson, L., Skubitz, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+and+beta1+integrin+mediate+ovarian+carcinoma+cell+adhesion+to+peritoneal+mesothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">CD44 and beta1 integrin mediate ovarian carcinoma cell adhesion to peritoneal mesothelial cells.</a> Am. J. Pathol. 154, 1525-1537 (1999).</li>
<li>Leroy-Dudal, J., Heyman, L., Gauduchon, P., Carreiras, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+human+ovarian+adenocarcinoma+IGROV1+cells+to+endothelial+cells+is+partly+mediated+by+the+alphav+integrins-vitronectin+adhesive+system+and+induces+an+alteration+of+endothelial+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">Adhesion of human ovarian adenocarcinoma IGROV1 cells to endothelial cells is partly mediated by the alphav integrins-vitronectin adhesive system and induces an alteration of endothelial integrity.</a> Cell. Biol. Int. 29, 482-488 (2005).</li>
<li>Leroy-Dudal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmigration+of+human+ovarian+adenocarcinoma+cells+through+endothelial+extracellular+matrix+involves+alphav+integrins+and+the+participation+of+MMP2%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Transmigration of human ovarian adenocarcinoma cells through endothelial extracellular matrix involves alphav integrins and the participation of MMP2.</a> Int. J. Cancer. 114, 531-543 (2005).</li>
<li>Iwanicki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+spheroids+use+myosin-generated+force+to+clear+the+mesothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium.</a> Cancer Discovery. 1, 144-157 (2011).</li>
<li>Folkman, J., Moscona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cell+shape+in+growth+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of cell shape in growth control.</a> Nature. 273, 345-349 (1978).</li>
<li>Gregoire, L., Munkarah, A., Rabah, R., Morris, R. T., Lancaster, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+culture+of+human+ovarian+surface+epithelial+cells%3A+a+potential+model+for+ovarian+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev.+Biol.+Anim%22%5BJournal%5D)">Organotypic culture of human ovarian surface epithelial cells: a potential model for ovarian carcinogenesis.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 34, 636-639 (1998).</li>
<li>Roberts, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+molecular+and+cellular+events+during+neoplastic+progression%3A+a+mouse+syngeneic+ovarian+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Sequential molecular and cellular events during neoplastic progression: a mouse syngeneic ovarian cancer model.</a> Neoplasia. 7, 944-956 (2005).</li>
<li>Okada, T., Okuno, H., Mitsui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+vitro+assay+system+for+transendothelial+tumor+cell+invasion%3A+significance+of+E-selectin+and+alpha+3+integrin+in+the+transendothelial+invasion+by+HT1080+fibrosarcoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">A novel in vitro assay system for transendothelial tumor cell invasion: significance of E-selectin and alpha 3 integrin in the transendothelial invasion by HT1080 fibrosarcoma cells.</a> Clin. Exp. Metastasis. 12, 305-314 (1994).</li>
<li>Zervantonakis, I. K., Kothapalli, C. R., Chung, S., Sudo, R., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+for+studying+heterotypic+cell-cell+interactions+and+tissue+specimen+cultures+under+controlled+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices for studying heterotypic cell-cell interactions and tissue specimen cultures under controlled microenvironments.</a> Biomicrofluidics. 5, 13406-1310 (2011).</li>
<li>Brandt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-extravasation+model+--+selection+of+highly+motile+and+metastatic+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">3D-extravasation model -- selection of highly motile and metastatic cancer cells.</a> Semin. Cancer Biol. 15, 387-395 (2005).</li>
<li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 921-930 (2003).</li>
<li>Dai, J., Ting-Beall, H. P., Hochmuth, R. M., Sheetz, M. P., Titus, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+I+contributes+to+the+generation+of+resting+cortical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Myosin I contributes to the generation of resting cortical tension.</a> Biophys. J. 77, 1168-1176 (1999).</li>
<li>Laferriere, J., Houle, F., Taher, M. M., Valerie, K., Huot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transendothelial+migration+of+colon+carcinoma+cells+requires+expression+of+E-selectin+by+endothelial+cells+and+activation+of+stress-activated+protein+kinase-2+%28SAPK2%2Fp38%29+in+the+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Transendothelial migration of colon carcinoma cells requires expression of E-selectin by endothelial cells and activation of stress-activated protein kinase-2 (SAPK2/p38) in the tumor cells.</a> J. Biol. Chem. 276, 33762-33772 (2001).</li>
<li>Dong, C., Slattery, M. J., Rank, B. M., You, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+and+micromechanics+of+tumor+cell+chemotactic+protrusion%2C+locomotion%2C+and+extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization and micromechanics of tumor cell chemotactic protrusion, locomotion, and extravasation.</a> Ann. Biomed. Eng. 30, 344-355 (2002).</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

De &quot;Mesothelial Clearance Assay&quot; hier gepresenteerde maakt gebruik van time-lapse microscopie te zien op de interacties van eierstokkanker meercellige sferoïden en mesotheelcellen cel monolagen, in grote ruimtelijke en temporele detail. Eerder had een aantal groepen 8-14 gebruikt eindpunt testen aan te tonen dat eierstokkanker cellen hechten aan en binnen te vallen in mesotheelcellen cel monolagen. Deze test is uniek omdat het gebruikt fluorescent gelabelde cellen te onderscheiden tumorcellen van me...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> OVCA433 eierstokkanker cellen </td><td></td><td></td><td> Geschenk van Dr Dennis Slamon </td></tr><tr><td> ZT mesotheelcellen </td><td></td><td></td><td> Geschenk van Dr Tan Ince </td></tr><tr><td> Medium 199 </td><td> Gibco </td><td> 19950 </td><td></td></tr><tr><td> MCDB105 </td><td> Cell Applications Inc </td><td> 117-500 </td><td></td></tr><tr><td> FBS-warmte geïnactiveerd </td><td> Gibco </td><td> 10082 </td><td></td></tr><tr><td> Pen-Strep </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td> Platen met 96 putjes </td><td> Corning Costar </td><td> 3799 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> Polyhydroxyethylmethacrylaat (poly-HEMA) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 192066-25G </td><td> Voor de poly-HEMA oplossing te ontbinden 6mg poly-HEMA poeder in 1 ml 95% EtOH </td></tr><tr><td> EtOH </td><td> Pharmco-aaper </td><td> 111ACS200 </td><td> Verdun tot 95% in dH 2 0 </td></tr><tr><td> Celcultuur kap </td><td> Nuaire </td><td> NU-425-300 </td><td></td></tr><tr><td> Weefselkweek incubator </td><td> Thermo Scientific </td><td> 3110 </td><td></td></tr><tr><td> incubator voor poly-HEMA platen </td><td> Labline Instrumenten </td><td> Keizerlijk III 305 </td><td></td></tr><tr><td> Tabletop centrifuge </td><td> Heraeus </td><td> 75003429/01 </td><td></td></tr><tr><td> 6 goed glazen onderste schaal </td><td> MatTek corp. </td><td> P06G-1.5-20-F </td><td></td></tr><tr><td> Fibronectine </td><td> Sigma </td><td> F1141-1 mg </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21 tot 040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Time-lapse microscoop: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscoop </td><td> Nikon </td><td></td><td> Ti-E Omgekeerde gemotoriseerde Fluorescentie time-lapse microscoop met geïntegreerde Perfect Focus System </td></tr><tr><td> Lens </td><td> Nikon </td><td></td><td> 20X-0.75 numerieke apeture </td></tr><tr><td> Halogeen transilluminator </td><td> Nikon </td><td></td><td> 0,52 NA lange werkafstand condensor </td></tr><tr><td> Excitatie en emissie filters </td><td> Chroma single-pass filters in Nikon behuizing </td><td></td><td> GFP Ex 480/40, Em 525/50 RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50 </td></tr><tr><td> Verzonden en Epifluoresce lichtpad </td><td> Sutter </td&gt; <td></td><td> Smart Shutters </td></tr><tr><td> Lineaire-gecodeerde gemotoriseerde fase </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gekoelde charged-coupled device-camera </td><td> Hamamatsu </td><td> ORCA-AG </td><td></td></tr><tr><td> Microscoop incubatiekamer met de temperatuur en CO 2-controle </td><td> custom-built </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Trillingsisolatie tafel </td><td> TMC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NOS-Elements-software </td><td> Nikon </td><td></td><td> Versie 3 </td></tr></tbody></table>

in vitro mesothelial ontruiming assay dat de modellen van de vroege stappen van eierstokkanker metastase

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Eierstokkanker is de vijfde belangrijkste oorzaak van kanker gerelateerde sterfgevallen in de Verenigde Staten 1. Ondanks een positieve eerste reactie op therapieën, 70 tot 90 procent van de vrouwen met eierstokkanker te ontwikkelen nieuwe uitzaaiingen, en de herhaling is vaak dodelijk 2. Het is daarom nodig om te begrijpen hoe secundaire uitzaaiingen ontstaan ​​om betere behandelingen voor tussen-en late stadium eierstokkanker te ontwikkelen. Eierstokkanker uitzaaiing ontstaat wanneer kwaadaardige cellen los te maken van de primaire tumor en de verspreiding van de hele buikholte. De verspreide cellen kunnen vormen meercellige clusters, of sferoïden, die ofwel blijft onthecht, of implantaat op organen in de buikholte 3 (figuur 1, Film 1). Alle organen in de buikholte zijn bekleed met een enkele, continue, laag van mesotheelcellen 4-6 (figuur 2). Echter mesotheelcellen ontbreken van onderperitoneale tumor massa&#39;s, zoals blijkt uit electronen microscoop studies van weggesneden menselijk tumorweefsel secties 3,5-7 (figuur 2). Dit suggereert dat mesotheelcellen zijn uitgesloten van onder de tumormassa door een onbekende proces. Vorige in vitro experimenten toonden aan dat de primaire eierstokkanker cellen efficiënter te hechten aan extracellulaire matrix dan mesotheelcellen 8, en meer recente studies is gebleken dat primaire peritoneale mesotheelcellen eigenlijk een barrière te verstrekken aan eierstokkanker celadhesie en invasie (in vergelijking met adhesie en invasie op substraten die niet waren bedekt met mesotheelcellen) 9,10. Dit zou betekenen dat mesotheelcellen fungeren als een barrière tegen eierstokkanker metastase. De cellulaire en moleculaire mechanismen die eierstokkanker cellen inbreuk pleegt op deze barrière, en exclusief de mesothelium hebben, tot voor kort nog onbekend. Hier beschrijven we ee methode voor een in vitro assay dat modellen de interactie tussen ovarium kankercellijn sferoïden en mesotheelcellen in vivo (figuur 3 Film 2). Ons protocol werd aangepast van vroeger beschreven methoden voor het analyseren van ovariële tumor cel interacties met mesotheelcellen monolagen 8-16, en werd voor het eerst beschreven in een rapport waaruit blijkt dat het ovariële tumor cellen maken gebruik van een integrine-afhankelijke activering van myosine en trekkracht, met uitsluiting van de bevordering van mesotheelcellen van onder een tumor sferoïde 17. Dit model maakt gebruik van time-lapse fluorescentie microscopie om toezicht te houden de twee celpopulaties in real time en biedt ruimtelijke en temporele informatie over de interactie. De ovarium kankercellen drukken rood fluorescent eiwit (RFP) terwijl de mesotheelcellen drukken green fluorescent protein (GFP). RFP expressie ovarium kankercellijn sferoïden hechten aan de GFP expressie mesotheelcellen monolaag. De sferoïden verspreiding, binnen te vallen, endwingen mesotheelcellen opzij een gat in de monolaag. Dit gat is weergegeven als de negatieve ruimte (zwart) in de GFP beeld. De oppervlakte van de opening kan dan worden gemeten kwantitatief te analyseren verschillen in afstand activiteit tussen controlegroep en populaties van ovariumkanker en / of mesotheelcellen. Deze test vereist slechts een klein aantal van eierstokkanker cellen (100 cellen per sferoïde X 20-30 sferoïden per conditie), zodat het haalbaar is om deze test met behulp van kostbare primaire tumor cel monsters uit te voeren. Bovendien kan deze assay gemakkelijk worden aangepast voor high throughput screening.

De mesotheelcellen klaring test hier beschreven maakt gebruik van fluorescent gelabelde cellen en time-lapse video-microscopie kwantitatief te visualiseren en meten van de interacties van eierstokkanker meercellige sferoïden en mesotheelcellen cel monolagen. Deze test modelleert de eerste stappen van eierstokkanker metastase.

In vitro Mesothelial Ontruiming Assay dat de modellen van de vroege stappen van eierstokkanker Metastase

Eierstokkanker is de vijfde belangrijkste doodsoorzaak door kanker in de Verenigde Staten1. Ondanks een positieve initiële respons op therapieën, vertonen 70 tot 90 ...

Het algemene doel van deze procedure is om het vermogen van multicellulaire sferoïden van eierstokkanker om een mesotheliaal monolaag te invaderen te bepalen. Dit wordt bereikt door eerst rood fluorescent eiwit-expresserende eierstokkankercellen te incuberen in kweekplaten met lage adhesie om multicellulaire sferoïden te vormen. De volgende stap is het uitplaten van groen fluorescent eiwit-expresserende mesotheliale cellen op met fibronectine gecoate glazen kweekschalen om monolagen te vormen.De laatste stap is het overbrengen van de eierstokkanker-sfereen van de platen met lage adhesie naar de platen die de mesotheliale monolagen bevatten. Uiteindelijk wordt fluorescentie-time-lapse videomicroscopie gebruikt om het relatieve vermogen van controle- en experimentele eierstokkanker-sfereen om een gat in de mesotheliale monolaag te vormen te kwantificeren.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande endpoint-assays is dat een combinatie van fluorescentielabelled cellen en time-lapse videomicroscopie wordt gebruikt om de dynamiek van mesiale klaring in de tijd te monitoren. Voorafgaand aan de vorming van eierstokkanker is het noodzakelijk om low-adhesion 96-well ronde bodem kweekschalen voor te bereiden. Om deze kweekschalen te produceren, voegt u 30 µL poly-hema-oplossing toe aan elke well van een 96-well celkweekplaat.Incubeer de 96-wells platen gedurende 24 tot 48 uur in een niet-bevochtigde incubator bij 37 °C om de ethanol te laten verdampen, zodat op elke well een film van poly-HEMA achterblijft. Deze poly-HEMA film voorkomt dat cellen zich hechten aan de bodem van de well, waardoor de cellen gedwongen worden in suspensie te groeien. De eierstokkankercellen die het rode fluorescerende eiwit tot expressie brengen in dit experiment, worden gekweekt in 10% base medium, een op maat gemaakt celkweekmedium, zodra de low-adhesion kweekplaten gereed zijn.Trypsineer een plaat met eierstokkankercellen door de plaat eerst te wassen met PBS, vervolgens één milliliter trypsine toe te voegen en de plaat vier tot vijf minuten te incuberen bij 37 °C. Voeg 10% basismedium toe om de trypsine te neutraliseren en breng de celsuspensie vervolgens over naar een conische polypropyleen buis van 15 milliliter. Pelleteer de cellen in een tafelcentrifuge bij 900 RCF gedurende drie minuten, aspireer het supernatant en resuspendeer de cellen in 10% basismedium.Nadat de cellen met een hemocytometer zijn geteld, wordt de celconcentratie aangepast naar 100 cellen per 50 µL in 10% basismedium. Voeg 50 µL van de uniform gesuspendeerde verdunde celsuspensie toe aan elke put van de met poly-HEMA gecoate 96-wells cultuurplaat. Incubeer de 96-wells plaat gedurende 16 uur in een celkweekincubator bij 37 °C om de eierstokkankercellen de gelegenheid te geven te clusteren, zodat er in elke put een enkele multicellular sferoïde wordt gevormd. Om deze procedure te starten, worden de putten van een MatTek glazen bodem 6-wells schaal geprecoat met fibronectine. Voeg 2 mL fibronectine-PBS-oplossing toe aan elke put van de schaal en incubeer dit gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.De mesotheelcellen die het groen fluorescerende eiwit tot expressie brengen voor het vormen van een mesotheelcellaag worden gekweekt in 10% basismedium. Trypsiniseer een plaat met mesotheelcellen en centrifugeer deze in een tafelcentrifuge bij 900 RPM gedurende drie minuten. Aspireer het supernatant en resuspendeer de cellen in 10% basismedium; stel de gewenste concentratie in met 10% basismedium. Wanneer de 30-minuten incubatie van de MatTek-dish met fibronectine is voltooid, worden de wells gewassen met 2 mL PBS. Aspireer de PBS en zaai 6 x 10⁵ mesotheelcellen per well in elke well van de 6-wells MatTek-dish.Incubeer de MatTek-schaal overnacht in een celkweekincubator bij 37 °C om de mesotheliale cellen de mogelijkheid te geven zich aan de schaal te hechten en een monolaag te vormen. Om deze assay te starten, gebruik dan een pipet om de PHE van eierstokkanker uit de 96-wells poly-HEMA-gecoate plaat te verzamelen; aspireer het medium uit één well van de 6-wells MatTek-schaal die een mesotheliale cellaag bevat, was één keer met 2 mL PBS en voeg alle PHE uit de 96-wells plaat toe aan één well van de MatTek-schaal. Dit is ongeveer drie keer het aantal steroïden dat wordt afgebeeld, om rekening te houden met PHE die terechtkomt op het deel van de schaal dat niet kan worden afgebeeld.Aangezien we slechts één steroid per gezichtsveld willen afbeelden, moet aggregatie van de steroiden worden voorkomen. Schud de schaal voorzichtig van zij naar zij om de steroiden gelijkmatig over de monolaag te verspreiden voordat ze hechten. Plaats de mat tech-schaal op de tafel van een inverted widefield fluorescentiemicroscoop.In staat om time-lapse imaging uit te voeren gedurende minimaal acht uur. Gebruik een gemotoriseerde tafel om meerdere posities in de schaal te beelden met meerdere OID-intercollatie-gebeurtenissen. In een enkel experiment zullen de eierstokkankercellen PHE naar de bodem van de schaal zakken en hechten aan de mesotheelcellen.De monolayer verzamelt GFP- en RFP-fasebeelden van meer dan 20 sferoïde-monolayer-interacties elke 10 minuten gedurende acht uur. In de mesotheelcel-klaringassay zullen de RFP-expresserende eierstokkankercellen (PHE) de GFP-expresserende mesotheelcel-monolayer binnendringen, waardoor er gaten in de monolayer ontstaan. De grootte van de gaten wordt gemeten door de zwarte gaten in de GFP-beelden te traceren met Element-software of een andere geschikte software zoals Image J. De grootte van het gat wordt vervolgens genormaliseerd naar de initiële sferoïdengrootte door de grootte van het gat na acht uur te delen door de grootte van de sferoïde in het overeenkomstige RFP-beeld op tijdstip nul. De mesotheelcel-klaringassay kan worden gebruikt om de invasiecapaciteit van eierstokkankersferoïden te vergelijken die genetisch zijn gemodificeerd om de moleculaire mechanismen te verduidelijken waarmee eierstokkankersferoïden klaring veroorzaken.De mesotheelmonolaag in dit voorbeeld, het mesotheel-klaringvermogen van OVCA 433 eierstokkankercellen. PHE's met een verzwakte expressie van Taline 1 werden vergeleken met die van controle OVCA 433 OID's. De gaten die in de monolaag werden geproduceerd door de uitbreidende PHE werden gemeten en zes posities van elke groep werden gemiddeld.Zoals in deze grafiek te zien is, was het gemiddelde klaringsoppervlak gecreëerd door Talon 1 knockdown sferoïden significant kleiner dan het gemiddelde oppervlak gecreëerd door controle-sferoïden, wat suggereert dat Talon vereist is voor mesotheliale klaring door OVCA 4 33 eierstokkanker-sferoïden. Deze time-lapse film toont een rode controle OVCA 4 33 sferoïde die een groene mesotheliale monolaag invadeert. Deze volgende time-lapse film is van een rode OVCA 4 33 sferoïde met een verminderde expressie van Talon 1 die een groene mesotheliale monolaag invadeert.In vergelijking met de vorige film is duidelijk dat attenuatie van Talon one-expressie in de sferoïden het mesotheliale klaringvermogen vermindert. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe de interactie tussen eierstokkanker, multicellular sferoïden en mesotheliale cellagen in de loop van de tijd kan worden gemonitord met behulp van time-lapse videomicroscopie.

in-vitro-mesothelial-clearance-assay-that-models-early-steps-ovarian

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Heterotypische Driedimensionale<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellering van Stroma-epitheliale interacties tijdens eierstokkanker initiatie en progressie

In this video, we demonstrate the development of  an in vitro  three-dimensional model of the lining of the peritoneal cavity. This organotypic culture can help to investigate ovarian cancer cell adhesion, invasion, and proliferation.

Modeling Ovarian Cancer Metastasis in Peritoneal Cavity Lining: A Method To Establish an In Vitro 3D Model of the Peritoneal Lining

This video describes a technique to quantitatively measure the interaction of ovarian cancer spheroids with mesothelial cells, using fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy. This in vitro assay models the interaction between metastasizing ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells lining the peritoneal cavity in vivo.

Mesothelial Clearance Assay: An In Vitro Technique to Quantify the Invasion Ability of Ovarian Cancer Spheroids into Mesothelial Cell Monolayers

Ovariale kankercel invasie in de mesotheellaag van het peritoneum is een dynamisch proces in de tijd. Gebruik te maken van een real-time analyzer, kan de invasieve capaciteit van eierstokkanker cellen in een bolvormige-mesothelial cel co-cultuur model gekwantificeerd worden gedurende langere perioden, het verstrekken van inzicht in factoren die de het metastatische proces.

Evaluatie van eierstokkanker Sferoïde Hechting en Invasie van mesotheelcellen in Real Time

We schetsen een protocol dat zowel in vivo als ex vivo benaderingen implementeert om de kolonisatie van peritoneale vetweefsels door eierstokkanker te bestuderen, met name het omentum. Bovendien presenteren we een protocol om immuuncelstructuren in het omentum, bekend als melkvlekken, te kwantificeren en te analyseren, die metastasen van peritoneale vetweefsels bevorderen.

In vivo en ex vivo benaderingen van eierstokkanker uitgezaaide Kolonisatie van Milky Spot Structuren Bestudeer in peritoneale Adipose

Eierstokkankermetastase wordt gekenmerkt door talrijke diffuse intra-peritoneale laesies, waardoor nauwkeurige visuele kwantificering van de tumorbelasting een uitdaging is. Hierin beschrijven we een methode voor in situ en ex vivo kwantificering van de metastatische tumorbelasting met behulp van rood fluorescerend proteïne (RFP)-gelabelde tumorcellen en optische beeldvorming.

Kwantificering van Intra-peritoneale eierstokkanker Metastase

Hier presenteren we een protocol om een driedimensionaal in vitro model te construeren van de bekleding van de peritoneale holte, samengesteld uit primaire humane mesotheliële cellen en fibroblasten, bedekt met extracellulaire matrix, als een hulpmiddel om de adhesie, invasie en proliferatie van ovariële kankercellen te onderzoeken.

Modelleren van de eerste stappen van eierstokkanker Verspreiding in een Organotypische Cultuur van de menselijke buikholte

Het meerstaps proces van peritoneale verspreiding van ovariumcarcinoom verduidelijken de huidige studie beschrijft een murine experimenteel model van originele tumorontwikkeling en metastase via orthotope peritoneale inoculatie met deze tumorcellen.

Murine Experimental Model van de oorspronkelijke tumor Ontwikkeling en peritoneale metastase<em&gt; via</em&gt; Orthotope Inenting met ovariumcarcinoom Cells

Ovariële tumorprogressie te bestuderen in een fysiologisch relevante model multicellulaire sferoïden werden gekweekt in een micro-inrichting onder gesimuleerde fluïdumstroming. Deze dynamische 3D-model emuleert de intraperitoneale omgeving met de cellulaire en mechanische componenten, waar eierstokkanker metastase optreedt.

Modelleren van eierstokkanker Meercellige Sferoïde Gedrag in een dynamische 3D peritoneale microdevice

Dit protocol beschrijft de opstelling van een driedimensionaal (3D) ex vivo model van de interactie tussen kankercellen en omtentum. Het model biedt een platform voor het ophelderen van pro-tumormechanismen binnen de vetniche en voor het testen van nieuwe therapieën.

Een ex vivo-model van peritoneale metastase van eierstokkanker met behulp van humaan omentum

Leer hoe eierstokkankersferoïden mesotheliale monolagen binnendringen met fluorescentie-tijdsverloopmicroscopie. Deze methode kwantificeert invasiedynamiek en ondersteunt onderzoek naar vroege metastase.

In vitro Mesothelial Ontruiming Assay dat de modellen van de vroege stappen van eierstokkanker Metastase

Meer video's verkennen