Protease-en Acid-gekatalyseerde Labeling Werkstromen Gebruikmakend

Deze presentatie demonstreert workflows voor de stabiele isotopenmarkering van proteïnedigesten en synthetische peptiden met behulp van water verrijkt met zuurstof 18. Ten eerste in het protease-gekatalyseerde paleo-tijdreeksexperiment worden substraat en protease geïncubeerd in de aanwezigheid van 50% zuurstof 18-verrijkt water om zuurstof 18-atomen in te bouwen. Vervolgens is de protease in staat tot dubbele markering. Herhaal de incubatie van de splitsingsproducten na digestie met het betreffende protease in de aanwezigheid van 50% zuurstof 18-verrijkt water.

De EO-workflow voert de zuurkatalyse incorporate van zuurstof 18-atomen in functionele groepen uit op vaste tijdsintervallen. Door aliquots van de reactiemengsels met matrix op moldy targetplaten te spotten tijdens de massaspectrometrische data-acquisitie, worden spectrale tijdplots van de peptideclivingsreacties en zuurstof 18-incorporatieplots van individuele peptidesoorten gegenereerd; gelabelde clivingsproducten worden geselecteerd voor MSM S-gebaseerde sequentie-identificatie. Uiteindelijk bieden deze workflows veelzijdige instrumenten voor kwantitatieve en kwalitatieve proteomische studies.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van proteaseresearch, zoals het identificeren van de snelheid, snelheidsbepalende stappen en reactie-intermediaten in complexe proteolytische pathways. Proteolytische signaturen geïdentificeerd door de paleo-tijdreeks bieden belangrijke feiten met betrekking tot substraatspecificiteit. Daarnaast maakt de timers-data ook gebruik van kinetische informatie.

Een postdoc uit mijn laboratorium zal nu de procedure demonstreeren. De paleo-tijdreeksworkflow monitort de dynamiek van proteolytische splitsingsreacties op basis van protease-gekatalyseerde inbouw van zuurstof 18; voeg voor de 20 µL reactie de monsterpeptiden toe aan de protease-reactiebuffer die zuurstof 18-verrijkt water bevat. Meng 0,5 µL van het reactiemengsel met 0,5 µL matrix, breng dit aan op een Opti-to-3 84 MALDI-targetplaat en laat de oplosmiddeldruppels bij kamertemperatuur drogen. Verdeel ondertussen het reactiemengsel over twee buisjes.

Controle en monster voor de monsterbuis. Voeg de protease van interesse toe en incubeer bij de aanbevolen enzymreactietemperatuur. Voeg de gespecificeerde tijdstippen toe.

Verwijder een aliquot van 0,5 µL om te mengen met 0,5 µL matrix en breng dit aan op de multi-target plaat. Analyseer vervolgens de reactiedynamica via MALDI-TOF MS-analyse, zoals later beschreven in deze workflow voor labeling na paleo-digestie. Proteasen zoals trypsine katalyseren de carboxyl-zuurstofuitwisselingsreactie om zuurstof-18 in te bouwen. Nadat een proteïnedigestie zonder zuurstof-18 labeling is uitgevoerd, worden de splitsingsproducten door een PepClean C18 spincolumn geleid om resterende protease-activiteiten te elimineren.

Resuspendeer de monsters vervolgens in 20 µL tripsine-reactiebuffer die water verrijkt met zuurstof-18 bevat. Neem een aliquot van 0,5 µL en meng deze met een gelijk volume matrix. Breng dit vervolgens aan op een opti off 3 84 MALDI-targetplaat om aan de lucht te laten drogen.

Verdeel vervolgens de reactieoplossing in controle- en monsterbuisjes voor het monsterbuisje. Voeg trypsine toe en incubeer bij 37 °C. Neem een aliquot van 0,5 µL af om de reactie te monitoren.

Meng met 0,5 µL matrix en breng dit aan op een MALDI-plaat. Analyseer de dynamiek van deze carboxyl-zuurstofuitwisselingsreactie via MALDI-TOF MS-analyse. De IEO-tijdreeksworkflow is gebaseerd op de zuurgekatalyseerde carboxyl-zuurstofuitwisselingsreacties van zure peptide-zijketens en terminale groepen.

Incubeer eerst 50 nanomolaire individuele peptiden met een één-op-één mengsel van water verrijkt met zuurstof 18, in aanwezigheid of afwezigheid van 0,1% trifluorazijnzuur. Neem dagelijks gedurende 48 dagen aliquots van 0,5 microliter van de reactie en spot deze direct samen met de matrix op een MALDI-targetplaat. Dien de MALDI-targetplaat regelmatig in voor MALDI-TOF MS/MS-productanalyse. Dit gedeelte is gedetailleerd beschreven in het bijbehorende manuscript.

Verkrijg eerst MS-spectra in triplo in positieve ionmodus. Na het kalibreren van de multiplier en het instellen van de MS-acquisitie, worden single shots voor sub-spectra verkregen. Exporteer vervolgens de MS-databestanden vanuit de acquisitesoftware van de 4.000-serie Explorer.

Importeer deze vervolgens in een intern informatiesysteem dat Mascot Distiller-software gebruikt voor spectrale verwerking en piekdetectie. Deconvolueer de isotopische enveloppen en bepaal automatisch de inbouwratio's van zuurstof 18; noteer de inbouwratio's van zuurstof 18 als de relatieve bijdragen van individuele peptide-isotoopspecies aan de volledige isotopische envelop. Filter de bin-lijst en bepaal voor elk tijdskursexperiment minstens drie waarden bij een massabreedte van 100 ppm.

Extraheer de moleculaire massa's voor alle gedetecteerde peptidesoorten uit de bijbehorende MS-databestanden. Gebruik nu Xpacey om pep-sets te vinden met een tolerantie voor massa-afwijking van 200 PPM. Vergelijk de bin-lijst met de gegevens van de proteolytische splitsingsproducten die zijn voorspeld op basis van de sequentie van het substraatpeptide.

Ga over tot het verkrijgen van msms-spectra voor alle massawaarden van splitsingsproducten die door de find pep-tool zijn voorspeld en voor bin-waarden met bijbehorende oxygen 18-incorporaties. Verzamel MSMS-gegevens van 50 shots in een gerandomiseerd patroon per subspectrum, met maximaal 40 subspectra per spot, en exporteer de msms-bestanden. Exporteer vervolgens de MSMS-gegevensbestanden naar het analysesysteem voor piekdetectie en MSMS-pieklijsten gekoppeld aan de corresponderende bend MS-gegevens voor peptide-identificatie.

Stel deze zoekparameters in de Mascot-zoekmachine in: geen enzymspecificiteit, 150 PPM precursor-ion en 0,2 Dalton fragment-ion massatoleranties. Zoek de M-S-M-S-P-lijsten tegen de Swiss Pro-database. Peptide-identificaties kunnen aanvullend worden gevalideerd met data explorer-software door de karakteristieke oxygen 18-incorporatiepatronen over de fragment-ionen te bevestigen voor spectrale tijdsplots.

Exporteer de MS-databestanden voor elk reactietijdstip vanuit de data explorer-software als ASCI-bestanden met behulp van een macro. Importeer deze bestanden vervolgens in een programma voor data-analyse en grafieken en toon deze als waterfall plots om incorporatieplots van zuurstof 18 voor elke bocht te maken. Extraheer uit het peptide-splitsingsproduct de relatieve bijdragen van individuele peptide-isotoopspecies over alle reactietijdstippen en plot deze vervolgens tegen de tijd.

Spectrale tijdplots zoals deze tonen de dynamiek van proteolytische splitsingsreacties. In dit experiment wordt de splitsing van het bioactieve peptide endo en C geanalyseerd door het endothelium-converterend enzym één. Een watervaldiagram plot de MS-spectra van de paleo-tijdreeksexperimenten om gelijktijdig de afbraak van het substraat en de vorming van intermediaire en uiteindelijke producten te monitoren.

De splitsingsproducten worden geïdentificeerd via MSMS en de kenmerkende signatuur van de inbouw van zuurstof 18 in hun isotopenenveloppen. Dit reactiemechanisme van trypsine geeft aan dat de gebruikte proteasen de inbouw van maximaal twee zuurstof 18-atomen in de peptide-splitsingsproducten faciliteren. In de op proteasen gebaseerde labelingsworkflow resulteert de reactie van de peptidebinding-splitsing in een inbouwratio van 50% voor een enkel zuurstof 18-atoom voor vers gegenereerde peptide-splitsingsproducten; proteasen zoals trypsine, die de reactieproducten opnieuw binden, katalyseren vervolgens de inbouw van een tweede zuurstof 18-atoom via de carboxyl-zuurstofuitwisselingsreactie.

Bij equilibrium is het zuurstof-18 label verdeeld in een verhouding van één op twee op één in niet-gelabelde, enkelvoudig gelabelde en dubbel gelabelde producten. In de workflow voor labeling van proteolytische termini vóór de digestie vinden er geen peptidebinding-splitsingen plaats. In plaats daarvan is de incorporatie van maximaal twee zuurstof-18 atomen uitsluitend gebaseerd op de carboxylzuurstof-uitwisselingsreactie.

Daarom vindt de incorporatie van zuurstof 18 alleen plaats bij proteasen die hun peptide-splitsingsproducten opnieuw binden. Zuur-gekatalyseerde zuurstof 18-markering leidt tot de incorporatie van twee zuurstof 18-atomen per carboxylgroep. Gedurende dit experiment kunnen de meervoudige verschuivingen van plus twee Dalton in de isotopische envelop van angiotensine één in kaart worden gebracht door de opname van zuurstof 18-atomen.

Door OPE-labeling en hogeresolutie massaspectrometrie op een tijdige manier te combineren, maakt de paleo-tijdverloopmethode een dynamische analyse mogelijk van de generatie van peptideproducten. De assay kan worden gebruikt om gestabiliseerde, topisch gelabelde peptiden te genereren voor kwantitatieve en kwalitatieve proteomische studies, en om de kinetiek te evalueren waarmee Protopic-peptiden worden gegenereerd.

De Paleo-tijdreeks is ontworpen om proteolytische routes onder fysiologisch relevante omstandigheden te evalueren. Deze techniek maakte de weg vrij voor ons recente onderzoek naar lytische processen in micro-omgevingen van menselijke kanker.