Name: Protease-en Acid-gekatalyseerde Labeling Werkstromen Gebruikmakend 18 O verrijkte Water (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Leer workflows voor stabiele isotooplabeling van eiwitdigesten met 18O-verrijkt water via protease- en zuurgekatalyseerde methoden. Deze technieken verbeteren kwantitatieve en kwalitatieve proteomics-analyses.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door NIH / NIDCR Grant 1R01DE019796.

De gepresenteerde LEO-workflows zorgen voor de stabiele isotoop etikettering van eiwit hydrolysaten en synthetische peptiden. Deze tijdsverloop experimenten (figuur 1) zijn van toepassing op vergelijkende en kwantitatieve proteomics studies en protease onderzoek. Elke workflow bestaat uit twee experimentele stappen (figuur 2): A) De tijd opgeloste bemonstering van de respectieve 18 O-stabiele isotoop-gecodeerde reactie (protease-gekatalyseerde splitsing peptide; protease gekatalyseerde carboxyl zuurstof uitwisselingsreactie, carboxyl zuur gekatalyseerde zuurstofuitwisseling reactie) en B) analyse door massaspectrometrie en grafische representatie van 18 O-opname kinetiek. A. tijdsverloop Experimenten I. Paleo-tijdsverloop: Protease-gekatalyseerde etikettering van proteolytische splitsingen <ol><li> (Optioneel) Disulfidebindingen van eiwitten (10 uM) en peptiden (250 uM) worden gereduceerd met DTT (eindconcentratie 2,5 mM)in 25 mM NH 4 HCO 3 (beide vers bereid) door incubatie gedurende 30 min bij 50 ° C. </li><li> (Optioneel) vrije cysteïnen worden gealkyleerd met joodacetamide (eindconcentratie 10 mM) in 25 mM NH 4 HCO 3 door incubatie gedurende 30 min bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Afhankelijk van protease van belang, eiwit / peptide-oplossingen moeten worden schoongemaakt-up om de resterende buffer en alkyleringsagens verwijderen. Gebruik PepClean C-18 spin-kolommen (Thermo) voor peptide opruimen en Vivaspin Centrifugaal Concentrators (Sartorius) om buffers te ruilen voor eiwit monsters. </li><li> Voeg daarna / exchange peptiden / eiwitten in 20 pi protease reactiebuffer (ECE-1: 50 mM MES-KOH, pH 5,5; trypsine: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) bevattende 1:1 (v / v) def H 2 18 O (95%, Sigma Isotec). </li><li> Intrekken tijdstip nul monster voorafgaand aan de toevoeging van het protease: Mix 0,5 ul van het reactiemengsel en 0,5 pi alpha cyano-4-hydroxycinnamicacid matrix (10 mg / ml in 50% acetonitril, 0,1% TFA). Steekproefmetingen op Opti-TOF 384 MALDI richtplaat (AB SCIEX) en het oplosmiddel druppels bij kamertemperatuur laten tot droog (ongeveer 5 min). </li><li> Splits de reactieoplossing in twee hoeveelheden. De eerste aliquot wordt geïncubeerd met de protease plaats (ECE-1: 75 nM; trypsine: 0,04 nM) bij kamertemperatuur of de aanbevolen temperatuur voor het specifieke enzym. De tweede aliquot wordt geïncubeerd zonder protease en zal dienen als controlemonster. De eerste aliquot is een standaardmonster voor protease-gekatalyseerde 18 O-labeling en kan worden gebruikt voor peptide en proteïne-identificatie, detectie van proteolytische en bewaking van proteolytische splitsing reacties. Het tweede monster wordt gebruikt om aan te tonen dat 18 O-opname wordt geïnduceerd door de protease, dus noch labeling of splitsing verwacht voor dit voorbeeld. </li><li> Volg de reactie door het verwijderen van reactie monsters en spotten ze als described onder stap 5 op tijdsintervallen als lijken fit. De reactiecondities hierboven beschreven worden gebruikt om een ​​proteolytische reactie tot vier dagen (ca. 24 spots) te monitoren. Start bemonstering om de 5 min tot 30 min, vervolgens ter plaatse om de 30 min. tot 2 uur, vervolgens elk uur tot 8 uur en elke 8 uur tot 4 dagen. Splitsing producten moeten optreden binnen de eerste 12 uur en de ondergrond moet volledig worden gehydrolyseerd na 24 uur. Langere reactietijd incubatietijden laten stabiele reactieproducten die discrete van reactietussenproducten, die verder verwerkt definiëren. Afhankelijk vraagstelling en gegeven enzym-substraat paren zijn spotting tijden en incubatietemperatuur te moduleren optimale reactie sampling verzekeren. </li><li> Na de laatste reactietijd punt is gespot of tussen de uitgebreide spotten intervallen, de MALDI richtplaat wordt voorgelegd aan MALDI-TOF/TOF MS / MS-analyse zoals hieronder beschreven (deel B). </li></ol> II. Paleo-tijdsverloop: Postdigestion etikettering van proteolytische termini <ol><li> (Optioneel) Disulfidebindingen van eiwitten (10 uM) en peptiden (250 uM) worden gereduceerd met DTT (eindconcentratie 2,5 mM) in 25 mM NH 4 HCO 3 (beide vers bereid) door incubatie gedurende 30 min bij 50 ° C. </li><li> (Optioneel) vrije cysteïnen worden gealkyleerd met joodacetamide (eindconcentratie 10 mM) in 25 mM NH 4 HCO 3 door incubatie gedurende 30 min bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Afhankelijk van de protease van belang, eiwit / peptide-oplossingen moeten worden schoongemaakt-up om de resterende buffer en alkyleringsagens verwijderen. Gebruik PepClean C-18 spin-kolommen voor peptide opruimen en Vivaspin Centrifugaal Concentrators voor eiwit buffer uitwisseling. </li><li> Voeg daarna / wisselen opgeruimde peptide producten / eiwitten in 20 pi reactiebuffer protease (bijvoorbeeld trypsine: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) en met protease vertering plaats afronding (bijvoorbeeld trypsine: 0,04 nM, 37 ° C, 12 uur). </li><li> Cleanup splitsingsproducten met PepClean C-18 spin-kolommen. Deze stap elimineert overblijvende protease activiteiten. </li><li> Voeg daarna / wisselen opgeruimde peptide producten in 20 pi protease reactiebuffer (trypsine: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) bevattende 1:1 (v / v) def H 2 18 O. </li><li> Intrekken tijdstip nul monster voorafgaand aan de toevoeging van enzym: Mix 0,5 ul van het reactiemengsel en 0,5 pi alpha cyano-4-hydroxykaneelzuur matrix (10 mg / ml in 50% acetonitril, 0,1% TFA). Steekproefmetingen op een MALDI richtplaat en de solvent druppels bij kamertemperatuur tot droog (ongeveer 5 min). </li><li> Splits de reactieoplossing in twee hoeveelheden. De eerste aliquot wordt geïncubeerd met protease van belang (bijvoorbeeld trypsine: 0,04 nM) bij kamertemperatuur of de aanbevolen temperatuur voor het specifieke enzym. Het tweede aliquot wordt geïncubeerd zonder protease en dient als een controle. Het eerstealiquot is een standaardmonster voor protease-gekatalyseerde 18 O-postdigestion labeling en kan worden gebruikt voor peptide en proteïne kwantificering. Het tweede monster wordt gebruikt om aan te tonen dat 18 O-opname wordt gekatalyseerd door het protease en daardoor kan geen labeling verwacht voor dit voorbeeld. </li><li> Volg de reactie door het verwijderen van vlekken reactie aliquots ze als beschreven in stap 7.) Bij tijdsintervallen als lijken fit. Zo zagen we eerst elke 5 min tot 30 min en elke 15 min daarna naar de carboxyl zuurstofuitwisseling gekatalyseerd door trypsine controleren. </li><li> Na de laatste reactietijd punt is gespot of tussen de verlengde spotten intervallen de MALDI richtplaat wordt voorgelegd aan MALDI-TOF/TOF MS / MS-analyse zoals hieronder beschreven (deel B). </li></ol> III. Aleo-tijdsverloop: Zuur-gekatalyseerde etikettering van carboxylgroepen <ol><li> Incubeer afzonderlijke peptiden (50 nM) met 1:1 (v / v) 18 O-verrijkte water in thij of afwezigheid (controle) 0,1% (v / v) trifluorazijnzuur final (totaal volume 30 ui). </li><li> Sample de reactieproducten dagelijks gedurende 48 dagen door co-spotten 0,5 ul aliquot van het mengsel van alfa 0.5μl cyano-4-hydroxykaneelzuur matrix (10 mg / ml in 50% acetonitril, 0,1% TFA) rechtstreeks op een MALDI doel plaat. </li><li> Tussen spotten tussenpozen en na het spotten van de uiteindelijke reactie tijdstip in te dienen MALDI doelplaat voor MALDI-TOF/TOF MS / MS-analyse zoals hieronder beschreven in hoofdstuk B. </li></ol> B. MALDI-TOF/TOF MS / MS Data Acquisition and Analysis <ol><li> Massaspectra worden verkregen op een resolutie van 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer (AB SCIEX). </li><li> Voor de analyse, wordt het instrument gekalibreerd met een mengsel van peptide standaarden (massastandaarden Kit voor kalibratie van AB SCIEX TOF / TOF instrumenten) met een maximale massa meetfout van ± 50 ppm en een minimum aantal van zes pieken te passen. </li><li> MS spectra (massabereik400 - 4000 m / z) worden verworven in drievoud met positieve ionmodus met instelbare laserintensiteit (3.400 - 3.800; stapgrootte 50) met een aanvaardbare base piekintensiteit bereik van 2.000 - 45.000. Enkele shots worden verworven voor sub-spectra, met 400 totaal shots / spectrum, stop voorwaarden treden in werking na 800 sub-spectra worden verworven (slagen of zakken) of 400 deelspectra pas acceptatiecriteria. Bij lage overvloedig monsters of in aanwezigheid van complexe biologische achtergronden het ondereinde van het MS detectiebereik worden verhoogd tot 800 m / z. Bovendien kan het nodig zijn zout en andere storende verbindingen te verwijderen met een monster opruimstap zoals eerder beschreven of door LC scheiding. </li><li> MS-gegevensbestanden (. T2D-bestanden) worden uitgevoerd uit de 4000-serie Explorer data-acquisitie software en geïmporteerd in ons eigen laboratorium informatie systeem, dat MASCOT Distiller software (Matrix Science) voor spectrale verwerking en piek detectie maakt gebruik van. Isotopische enveloppendeconvoluted zijn en 18 O-opname verhoudingen automatisch bepaald met behulp van een algoritme vergelijkbaar met die beschreven door Mason et al.. 12 en aangepast door onze groep 9. alternatief software zoals ZoomQuant 13 en Viper 14, alsmede commerciële software pakketten, als BioWorks Xpress (Thermo Fisher Scientific) en Mascot Distiller Kwantificering Toolbox (Matrix Science) kan deconvolute 18 O-type data 15,16. 18 O-incorporatie verhoudingen zijn uitgedrukt als de relatieve bijdragen van de afzonderlijke peptide isotoop soorten (dwz, peptiden met 16 O, 18 O 18 O 1 of 2) de gehele isotopische envelop. </li><li> Voor elk experiment tijdsverloop, de molecuulmassa&#39;s ([M + H] +) voor alle gevonden peptide soorten uit de bijbehorende gegevensbestanden MS en de waarden weggegooid op 100 ppm massa breedte. </li><li> Eent minste drie [M + H] + zijn ingesteld om te worden verplicht om een bak te vullen. Bij bekende substraten, wordt de gefilterde bin lijst vergeleken met een lijst van proteolytische splitsingsproducten voorspeld uit het substraat peptidesequentie met het ExPASy FindPept gereedschap 17 ( <a href="http://au.expasy.org/tools/findpept.html" target="_blank">http://au.expasy.org/tools/findpept.html</a> ) en een 200 ppm massa fout acceptatie tolerantie. </li><li> MS / MS spectra worden verworven voor alle massa van splitsingsproducten voorspeld door de FindPept tool en voor bin waarden die 18 O-oprichtingen verband met hen te hebben. MS / MS-gegevens worden verkregen over de 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer in 1kV reflector positieve ion-modus, met een vaste laser intensiteit van 4200 en CID-gas in uit-stand. 50 schoten worden verworven in een gerandomiseerde patroon per sub-spectra tot een totaal van 40 sub-spectra per spot (wat een totaal van 2.000 schoten / spot). </li><li> MS / MS-gegevens-bestanden (. T2D-bestanden) worden uitgevoerd uit de 4000-serie Explorer data-acquisitie software en geïmporteerd in ons eigen laboratorium informatie systeem, worden pieken gedetecteerd en MS / MS piek lijsten zijn gekoppeld aan de corresponderende prullenmand MS-gegevens. </li><li> Voor peptide identificatie, zijn MS / MS piek lijsten gezocht tegen de SwissProt database met behulp van de MASCOT zoekmachine met de volgende zoekparameters: geen enzym specificiteit, 150 ppm precursorion en 0,2 Da fragment ion mass toleranties. </li><li> Peptide identificaties kunnen bovendien worden gevalideerd met behulp van de Data Explorer software (AB SCIEX) door de bevestiging van de karakteristieke 18 O-opname patronen in y-serie fragmentionen zoals beschreven door Shevchenko et al.. 18. </li></ol> C. Bereiding van het spectrale Time en 18 O-incorporatie Plots Spectrale tijd plots: MS-gegevensbestanden (. T2D bestanden) voor elke reactie tijdstip worden uitgevoerd uit het Data Explorer software als ASCII-bestanden met behulp van eenmacro en geïmporteerd in een data-analyse en grafische software programma (bijvoorbeeld Herkomst OriginLab) en weergegeven als waterval plots (Figuur 3). 18 O-opname plots: Voor elke weggegooid peptide splitsingsproduct, de relatieve bijdrage van afzonderlijke peptide isotoop soorten (16 O, 18 O 18 O 1 of 2) geëxtraheerd alle reactietijd punten en uitgezet tegen de tijd (Figuur 4).

<ol><li>Bender, M., Kemp, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-18+Studies+of+the+Mechanism+of+the+alpha-Chymotrypsin-catalyzed+Hydrolysis+of+Esters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Oxygen-18 Studies of the Mechanism of the alpha-Chymotrypsin-catalyzed Hydrolysis of Esters.</a> Journal of the American Chemical Society. 79, 111-116 (1957).</li>
<li>Sharon, N., Grisaro, V., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pepsin-catalyzed+exchange+of+oxygen+atoms+between+water+and+carboxylic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Pepsin-catalyzed exchange of oxygen atoms between water and carboxylic acids.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 219-221 (1962).</li>
<li>Antonov, V., Ginodman, L., Rumsh, L., Kapitannikov, Y., Barshevskaya, T., Yavashev, L., Gurova, A., Volkova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+mechanisms+of+action+of+proteolytic+enzymes+using+heavy+oxygen+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Studies on the mechanisms of action of proteolytic enzymes using heavy oxygen exchange.</a> European Journal of Biochemistry. 117, 195-200 (1981).</li>
<li>Fenselau, C., Yao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((18O2-labeling+in+quantitative+proteomic+strategies%3A+a+status+report%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">18O2-labeling in quantitative proteomic strategies: a status report.</a> Journal of Proteome Research. 8, 2140-2143 (2009).</li>
<li>Miyagi, M., Rao, K. C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+18O-labeling+strategies+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Proteolytic 18O-labeling strategies for quantitative proteomics.</a> Mass Spectrom. Rev. 26, 121-136 (2007).</li>
<li>Ye, X., Luke, B., Andresson, T., Blonder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((18O+stable+isotope+labeling+in+MS-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Funct.+Genomic+Proteomic%22%5BJournal%5D)">18O stable isotope labeling in MS-based proteomics.</a> Brief Funct. Genomic Proteomic. 8, 136-144 (2009).</li>
<li>Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mass+spectrometry+in+proteomics%3A+a+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389, 1017-1031 (2007).</li>
<li>Yao, X., Afonso, C., Fenselau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+proteolytic+18O+labeling%3A+endoprotease-catalyzed+16O-to-18O+exchange+of+truncated+peptide+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Dissection of proteolytic 18O labeling: endoprotease-catalyzed 16O-to-18O exchange of truncated peptide substrates.</a> Journal of Proteome Research. 2, 147-152 (2003).</li>
<li>Robinson, S., Niles, R. K., Witkowska, H. E., Rittenbach, K. J., Nichols, R. J., Sargent, J. A., Dixon, S. E., Prakobphol, A., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mass+spectrometry-based+strategy+for+detecting+and+characterizing+endogenous+proteinase+activities+in+complex+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">A mass spectrometry-based strategy for detecting and characterizing endogenous proteinase activities in complex biological samples.</a> Proteomics. 8, 435-445 (2008).</li>
<li>Cottrell, G. S., Padilla, B. E., Amadesi, S., Poole, D. P., Murphy, J. E., Hardt, M., Roosterman, D., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+endothelin-converting+enzyme-1%3A+a+regulator+of+beta-arrestin-dependent+ERK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Endosomal endothelin-converting enzyme-1: a regulator of beta-arrestin-dependent ERK signaling.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284, 22411-22425 (2009).</li>
<li>Subramanian, S., Hardt, M., Choe, Y., Niles, R. K., Johansen, E. B., Legac, J., Gut, J., Kerr, I. D., Craik, C. S., Rosenthal, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemoglobin+cleavage+site-specificity+of+the+Plasmodium+falciparum+cysteine+proteases+falcipain-2+and+falcipain-3%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Hemoglobin cleavage site-specificity of the Plasmodium falciparum cysteine proteases falcipain-2 and falcipain-3.</a> PLoS ONE. 4, e5156(2009).</li>
<li>Mason, C., Therneau, T., Eckel-Passow, J., Johnson, K., Oberg, A., Olson, J., Nair, K., Muddiman, D. C., Bergen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+automatically+interpreting+mass+spectra+of+18O-labeled+isotopic+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A method for automatically interpreting mass spectra of 18O-labeled isotopic clusters.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 6, 305-318 (2007).</li>
<li>Hicks, W. A., Halligan, B. D., Slyper, R. Y., Twigger, S. N., Greene, A. S., Olivier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantification+and+identification+using+18O+labeling+with+an+ion+trap+mass+spectrometer+and+the+analysis+software+application+%22ZoomQuant%26quot%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantification and identification using 18O labeling with an ion trap mass spectrometer and the analysis software application "ZoomQuant&quot.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16, 916-925 (2005).</li>
<li>Qian, W. -J., Petritis, B. O., Nicora, C. D., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin-catalyzed+oxygen-18+labeling+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Trypsin-catalyzed oxygen-18 labeling for quantitative proteomics.</a> Methods Mol. Biol. 753, 43-54 (2011).</li>
<li>Ye, X., Luke, B. T., Johann, D. J., Ono, A., Prieto, D. A., Chan, K. C., Issaq, H. J., Veenstra, T. D., Blonder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+method+for+computing+%2818%29O%2F%2816%29O+ratios+of+differentially+stable-isotope+labeled+peptides+in+the+context+of+postdigestion+%2818%29O+exchange%2Flabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Optimized method for computing (18)O/(16)O ratios of differentially stable-isotope labeled peptides in the context of postdigestion (18)O exchange/labeling.</a> Anal. Chem. 82 (18), 5878-5886 (2010).</li>
<li>Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveying+proteolytic+processes+in+human+cancer+microenvironments+by+microdialysis+and+activity-based+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin.+Appl%22%5BJournal%5D)">Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry.</a> Proteomics Clin. Appl. 5, 636-643 (2011).</li>
<li>Gattiker, A., Bienvenut, W., Bairoch, A., Gasteiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FindPept%2C+a+tool+to+identify+unmatched+masses+in+peptide+mass+fingerprinting+protein+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification.</a> Proteomics. 2, 1435-1444 (2002).</li>
<li>Shevchenko, A., Chernushevich, I., Ens, W., Standing, K. G., Thomson, B., Wilm, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+%27de+novo%27+peptide+sequencing+by+a+combination+of+nanoelectrospray%2C+isotopic+labeling+and+a+quadrupole%2Ftime-of-flight+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Rapid 'de novo' peptide sequencing by a combination of nanoelectrospray, isotopic labeling and a quadrupole/time-of-flight mass spectrometer.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 11, 1015-1024 (1997).</li>
<li>Niles, R. K., Witkowska, H. E., Allen, S., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid-catalyzed+oxygen-18+labeling+of+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Acid-catalyzed oxygen-18 labeling of peptides.</a> Analytical Chemistry. 81, 2804-2809 (2009).</li>
<li>Bender, M., Stone, R., Dewey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+Isotopic+Oxygen+Exchange+between+Substituted+Benzoic+Acids+and+Water%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Kinetics of Isotopic Oxygen Exchange between Substituted Benzoic Acids and Water.</a> Journal of the American Chemical Society. 78, 319-321 (1956).</li>
<li>Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scoring+proteomes+with+proteotypic+peptide+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Scoring proteomes with proteotypic peptide probes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 577-583 (2005).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Door het combineren van stabiele isotopen labeling en hoge resolutie massaspectrometrie in een tijdsopgeloste wijze de paleo-tijdsverloop werkwijze maakt een dynamische analyse van de vorming van peptide producten. De test kan worden gebruikt om stabiele isotoop gemerkte peptiden voor kwantitatieve en kwalitatieve proteomics studies genereren en de kinetiek waarbij proteotypic peptiden gegenereerd evalueren. Bovendien wordt paleo-tijdsverloop ontworpen om proteolytische systemen evalueren onder specifieke, fysiologisch ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Stofnaam </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> PepClean C-18 Spin Columns </td><td> Thermo </td><td> 89870 </td></tr><tr><td> Opti-TOF 384 MALDI richtplaat </td><td> AB SCIEX </td><td> 1016629 </td></tr><tr><td> 4800 MALDI TOF / TOF </td><td> AB SCIEX </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 1. Materials <table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> Alpha cyano-4-hydroxykaneelzuur </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 70990-1G-F </td></tr><tr><td> Bovine serum albumine (BSA) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A3294-10G </td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) </td><td&gt; Acros </td><td> 16568-0050 </td></tr><tr><td> Joodaceetamide (IAM) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 1149-5G </td></tr><tr><td> Endotheline converterend enzym-1 (ECE-1) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 1784-ZN </td></tr><tr><td> Trypsine Gold </td><td> Promega </td><td> V5280 </td></tr><tr><td> Water-18 O, 97% 18 O atoom </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 329878-1G </td></tr><tr><td> Trifluorazijnzuur (TFA) </td><td> Thermo </td><td> 28904 </td></tr><tr><td> Massa Normen Kit voor kalibratie van AB SCIEX TOF / TOF instrumenten </td><td> AB SCIEX </td><td> 4333604 </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Reagentia

protease-en acid-gekatalyseerde labeling werkstromen gebruikmakend<sup&gt; 18</sup&gt; o verrijkte water

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

Stabiele isotopen zijn essentiële hulpmiddelen in biologische massaspectrometrie. Vroeger 18 O-stabiele isotopen uitgebreid gebruikt om de katalytische mechanismen van proteolytische enzymen 1-3 bestuderen. Met de komst van massaspectrometrie-based proteomics is het enzymatisch gekatalyseerde omzetting van 18 O-atomen stabiele isotoopverrijking water een populaire methode om kwantitatief vergelijken eiwitexpressieniveaus (beoordeeld door Fenselau en Yao 4, Miyagi en Rao 5 en Ye et al.. 6). 18 O-etikettering is een eenvoudige en goedkope alternatief voor chemische (bijv. iTRAQ, ICCAT) en metabole (bijv. SILAC) labelingstechnieken 7. Afhankelijk van de gebruikte protease kan 18 O-labeling leiden tot de opname van maximaal twee 18 O-atomen in de C-eindstandige carboxylgroep van de splitsing product 3 </sup&gt;. De labelingsreactie kan worden onderverdeeld in twee onafhankelijke processen, de peptidebinding splitsing en carboxyl zuurstof uitwisselingsreactie 8. In onze Paleo (p rotease-a ssisted l Abeling e mploying 18 O-verrijkt water) de aanpassing van enzymatische 18 O-etikettering, we gebruik gemaakt van 50% 18 O-verrijkt water onderscheidend isotopen opleveren. In combinatie met hoge resolutie matrix-assisted laser desorptie ionisatie time-of-flight tandem massaspectrometrie (MALDI-TOF/TOF MS / MS) kan de kenmerkende isotoop enveloppen worden gebruikt splitsingsproducten identificeren met een hoge mate van specificiteit. Wij hebben al eerder gebruik hebben gemaakt van de paleo-methodiek op te sporen en te karakteriseren endogene proteasen 9 en bewaken proteolytische reacties 10-11. Sinds Paleo codeert de essentie van de proteolytische splitsing reactie, de experimentele opstelling is eenvoudig en biochemische Enrichment stappen van splitsingsproducten kunnen worden omzeild. De Paleo-methode kan eenvoudig worden uitgebreid met (i) het tijdsverloop experimenten die de dynamiek van de proteolytische splitsing reacties en (ii) de analyse van proteolyse in complexe biologische monsters die fysiologische omstandigheden vertegenwoordigen controleren. Paleo-tijdsverloop experimenten helpen identificeren van snelheidsbeperkende processtappen en reactie-intermediairen in complexe proteolytische route reacties. Bovendien is de paleo-reactie kunnen we vaststellen proteolytische enzymen zoals de serine protease trypsine die in staat zijn splitsingproducten opnieuw binden en de opname van een tweede 18 O-atoom katalyseren. Dergelijke &quot;dubbele labeling&quot; enzymen kunnen worden gebruikt voor postdigestion 18 O-labeling, waarbij peptiden uitsluitend gelabeld door de carboxyl zuurstof uitwisselingsreactie. Onze derde strategie breidt etikettering gebruik 18 O-verrijkt water buiten enzymen en maakt gebruik van zure pH voorwaarden in te voeren 18 O-stabiele isotoop tekenperaturen in peptiden.

We gebruikten de paleo-tijdsverloop workflow voor het dynamisch toezien op de integratie van 18 O-stabiele isotopen in peptide splitsingsproducten gegenereerd door proteolytische enzymen. De gepresenteerde aanpak is een veelzijdige tool om relatief proteolytische processing paden te bestuderen voor verschillende ondergrond en protease combinaties. Door het bemonsteren proteolytische reacties herhaaldelijk over het verloop van de reactie, de paleo-tijdsverloop experiment biedt tijdsopgeloste snapshots van subs...

Stabiele isotoop labeling workflows in dienst<sup&gt; 18</sup&gt; O-verrijkt water (LEO-workflows) zijn veelzijdige tools voor kwantitatieve en kwalitatieve proteomics studies. In protease-assisted (paleo) workflows,<sup&gt; 18</sup&gt; O-atomen die door proteolytische splitsing en carboxyl zuurstof uitwisselingsreacties gemedieerd door proteasen. In het zuur-gekatalyseerde (Aleo) workflow,<sup&gt; 18</sup&gt; O-atomen worden geïntroduceerd door carboxyl zuurstoftoevoer bij lage pH.

Protease-en Acid-gekatalyseerde Labeling Werkstromen Gebruikmakend<sup&gt; 18</sup&gt; O verrijkte Water

Stabiele isotopen zijn essentiële instrumenten in de biologische massaspectrometrie. Historisch gezien zijn 18O-stabiele isotopen uitgebreid gebruikt om de katalytische ...

Deze presentatie demonstreert workflows voor de stabiele isotopenmarkering van proteïnedigesten en synthetische peptiden met behulp van water verrijkt met zuurstof 18. Ten eerste in het protease-gekatalyseerde paleo-tijdreeksexperiment worden substraat en protease geïncubeerd in de aanwezigheid van 50% zuurstof 18-verrijkt water om zuurstof 18-atomen in te bouwen. Vervolgens is de protease in staat tot dubbele markering. Herhaal de incubatie van de splitsingsproducten na digestie met het betreffende protease in de aanwezigheid van 50% zuurstof 18-verrijkt water.De EO-workflow voert de zuurkatalyse incorporate van zuurstof 18-atomen in functionele groepen uit op vaste tijdsintervallen. Door aliquots van de reactiemengsels met matrix op moldy targetplaten te spotten tijdens de massaspectrometrische data-acquisitie, worden spectrale tijdplots van de peptideclivingsreacties en zuurstof 18-incorporatieplots van individuele peptidesoorten gegenereerd; gelabelde clivingsproducten worden geselecteerd voor MSM S-gebaseerde sequentie-identificatie. Uiteindelijk bieden deze workflows veelzijdige instrumenten voor kwantitatieve en kwalitatieve proteomische studies.Deze methode kan helpen bij h

protease-acid-catalyzed-labeling-workflows-employing-18o-enriched

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Leucine rich repeat kinases 1 en 2 (LRRK1 en LRRK2) zijn multidomain eiwitten die zowel GTPase en kinase domeinen coderen en die gefosforyleerd zijn in cellen. Hier presenteren we een protocol om LRRK1 en LRRK2 label in cellen met 32p orthofosfaat, waardoor een middel om hun algemene cellulaire fosforylering te meten.

Metabole Labeling van leucine rich repeat Kinasen 1 en 2 met radioactieve fosfaat

Stabiele isotoop labeling van peptiden door reductieve dimethylering (Redi etikettering) is een snelle, goedkope strategie voor nauwkeurige massa-spectrometrie gebaseerde kwantitatieve proteomics. Hier laten we een robuuste werkwijze voor de bereiding en analyse van eiwitmengsels met de Redi aanpak die kan worden toegepast op vrijwel elk type monster.

Kwantitatieve Proteomics behulp Reductieve dimethylering voor stabiele isotopen Labeling

DNA en eiwitten sequentie-specifiek gemerkt met affiniteit of fluorescente reporter groepen met DNA of eiwit methyltransferases en synthetische analogen cofactor. Afhankelijk van de cofactor specificiteit van de enzymen, aziridine of dubbel geactiveerde cofactor analogen worden gebruikt voor één of twee stappen labeling.

Sequentie-specifieke Labeling van nucleïnezuren en eiwitten met methyltransferases en Cofactor Analogues

Hier presenteren we een protocol om chemisch verkennende sondes op een specifieke plaats in een antilichaamfragment in te brengen door genetisch een azid-bevattend aminozuur in te bouwen en vervolgens het azid te koppelen aan een chemische sonde door spanningsgepromoveerde azid-alkyn cycloadditie (SPAAC).

Efficiënt en Site-specifiek antilichaam Labeling by-stam bevorderde azide-alkyn Cycloadditiereacties

Gecombineerd voorloper isotopische labeling en isobare tagging (cPILOT) is een kwantitatieve proteomics strategie die steekproef multiplexing mogelijkheden van isobarisch labels verbetert. Dit protocol beschrijft de toepassing van cPILOT op weefsels van de ziekte van Alzheimer muismodel en wildtype controles.

Verbeterde Sample Multiplexing Weefsels gebruik van Gecombineerd Precursor isotopische labeling en Isobaric Tagging (cPILOT)

Dit protocol beschrijft een experimentele procedure voor het kwantitatief en uitgebreid onderzoek naar het metabolisme van meerdere nutriënten bronnen. Deze werkstroom, gebaseerd op een combinatie van isotopische tracerproeven en een analytische procedure, kan het lot van verbruikte voedingsstoffen en de metabole oorsprong van moleculen synthetized door micro-organismen te bepalen.

Workflow gebaseerd op de combinatie van isotopische tracerproeven te onderzoeken van de microbiële metabolisme van meerdere nutriënten bronnen

Hier presenteren we een protocol om te beoordelen van de labeling homogeniteit voor elke soort eiwit in een complexe eiwitSteekproef op het niveau van één molecuul.

Proteoom bestrijkende kwantificering van Labeling homogeniteit op het niveau van één molecuul

Het gebruik van gethioleerd uracil om gevoelig en specifiek zuivert nieuw Getranscribeerd RNA van de gist Saccharomyces cerevisiae.

Zeer snelle en specifieke metabolische etikettering van RNA in vivo met 4-thiouracil (Ers4tU)

Eiwitthioloxidatie heeft significante implicaties onder normale fysiologische en pathofysiologische omstandigheden. We beschrijven de details van een kwantitatieve redox proteomics-methode, die gebruik maakt van harsondersteunde vangst, isobare etikettering en massaspectrometrie, waardoor locatiespecifieke identificatie en kwantificering van reversibel geoxideerde cysteïneresiduen van eiwitten mogelijk wordt.

Harsondersteunde vangst in combinatie met isobare tandemmassalabellabeling voor multiplexed kwantificering van eiwitthodoxe oxidatie

De mogelijkheid om de kinetiek van blaasje los maatregel kan hulp bieden inzicht in een aantal van de basisprincipes van neurotransmissie. Hier gebruikten we real-time beeldvorming van blaasjes gelabeld met de rode fluorescente kleurstof FM 4-64 om de snelheid van presynaptische blaasje release in hippocampale neuronale culturen te meten.

Het meten van exocytose in Neuronen FM-ontvanger voor Labeling

Leer workflows voor stabiele isotooplabeling van eiwitdigesten met 18O-verrijkt water via protease- en zuurgekatalyseerde methoden. Deze technieken verbeteren kwantitatieve en kwalitatieve proteomics-analyses.

Protease-en Acid-gekatalyseerde Labeling Werkstromen Gebruikmakend

Meer video's verkennen