Isolatie en Genoomanalyse van Single Virionen gebruik 'Single Virus Genomics'

Het algemene doel van deze procedure is om individuele virionen uit een gemengd consortium te isoleren en het verkregen genomische materiaal te sequensen om virussen uit diverse omgevingen te identificeren zonder dat cultivatie nodig is. Dit wordt bereikt door eerst de individuele virionen te isoleren middels flowcytometrische sortering op agarose-beads. De vangst van individuele virionen wordt vervolgens gevalideerd met confocale microscopie.

Vervolgens wordt het genomisch materiaal uit de virionen geïsoleerd en geamplificeerd met behulp van multiple displacement amplification of MDA om de hoeveelheid DNA te genereren die nodig is voor sequencing. Ten slotte wordt het virale DNA gesequenced met behulp van high-throughput technologieën om een overmatige dekking van het viriongenoom te verkrijgen, wat de genoomassemblage en annotatie aanzienlijk ondersteunt. Uiteindelijk maken bioinformatische technieken, gericht op het gebruik van sequence sub-sampling benaderingen om de contig-grootte te vergroten, de analyse van geïsoleerde virionen mogelijk.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de virale ecologie door genomische context te bieden aan de enorme hoeveelheid niet-geannoteerde virioplankton-genen, en maakt daarnaast de ontdekking van nieuwe genomen uit uiteenlopende ecosystemen mogelijk. Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze methode problemen ondervinden, omdat de amplificatie en isolatie van enkelvoudige virionen de grenzen van de huidige technologie opzoeken. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we het gebruik van MDA op virioplankton-gemeenschappen evalueerden en beseften dat het mogelijk was om een enkel viraal partikel te sorteren en te sequensen, en zo een volledig viraal genoom uit deze complexe gemeenschappen te assembleren. Om virussen te sorteren met een flowcytometer die is uitgerust met aangepaste forward scatter photomultiplier tubes of FSCPMT: begin met het verdunnen van de virale partikels in 0,1 micron gefilterde tris-EDTA. Stel voor een mengsel met T4- en lambda-faagpartikels de FSCPMT in op 1000 en de SSC op 200 om de signaal-ruisverhouding te maximaliseren.

Nadat de controlemonsters zijn geanalyseerd, worden ongeveer 100 µL van de gekleurde virale suspensie doorgemeten tot een totaal van 5 000 events. Gebruik vervolgens de sybr green one- en FSCPMT-plots om een nauwe gate in het centrum van de virale deeltjes te plaatsen. Voeg nu vijf µL 1% low melting point agarose in TBE-buffer, afgekoeld tot 37 °C, toe aan elke well op een P-T-F-E microscoopglaasje en plaats het glaasje vervolgens in de flowcytometer om de gesorteerde virale deeltjes op te vangen.

Begin met het sorteren, waarbij in sommige putjes 10 of meer virale partikelgebeurtenissen worden vastgelegd om te helpen bij het bepalen van de diepte van de virussen tijdens confocale laserscanmicroscopie. Wanneer het sorteren is voltooid, wordt de slide uit de flowcytometer verwijderd en worden aan elk putje met ingebedde virale partikels nog eens vijf microliter laagsmeltende agarose toegevoegd, afgekoeld tot 37 °C. Stel voor enkelvoudige virionen de confocale laserscanmicroscoop in op een excitatie van 488 nm. Beeld vervolgens de ingebedde partikels af met een 63 x objectief met een lange werkafstand om te verifiëren dat er slechts één enkel partikel aanwezig is en dat er geen meerdere virussen op elkaar gestapeld zijn. Zodra de putjes met enkelvoudige virussen zijn geïdentificeerd, wordt een scheermesje gebruikt om de gewenste agarosebolletjes van de slide te verwijderen en in een steriele PCR-buis te plaatsen.

Plaats de buis drie minuten lang in het warmteblok van een thermocycler ingesteld op 94 °C om het virusdeeltje in-situ te lyseren. Draag na het uitvoeren van een gemodificeerde MDA het genomisch DNA over naar 1,7 ml Eppendorf-buisjes en voeg een tiende volume van drie molar natriumacetaat in TBE-buffer toe om het geamplificeerde genomische materiaal te zuiveren. Plaats de monsters 10 minuten op 55 °C om de agarose op te lossen en verplaats de buisjes vervolgens naar 42 °C om de temperatuur te verlagen voordat het enzym wordt toegevoegd. Voeg nu twee units Beta-agarase toe aan elke buis en incubeer de buisjes gedurende twee uur.

Voeg vervolgens één volume van een gebufferde verzadigde fenolloplossing toe aan elke buis. Meng krachtig en centrifugeer de buizen gedurende 15 minuten bij 3.500 ×g bij kamertemperatuur. Draag de DNA-bevattende supernatanten over naar een nieuwe Eppendorf-buis van 1,7 milliliter. Voeg daarna één volume 100% isopropanol en één microliter glyco-blue toe aan de buizen en keer de buizen om om te mengen. Nadat de buizen opnieuw zijn gecentrifugeerd, ditmaal gedurende 60 minuten bij 28.000 ×g en vier graden Celsius, wordt de isopropanol afgegoten, waarbij erop wordt gelet dat het pellet niet wordt verstoord, waarna 150 microliters 70% ethanol aan elke buis wordt toegevoegd. Centrifugeer de buizen 10 minuten bij 28.000 ×g bij kamertemperatuur. Giet de ethanol af, laat het DNA-pellet aan de lucht drogen en resuspendeer het DNA in een passend volume tris-EDTA-buffer. Deze driedimensionale reconstructie van een met sybr green I gekleurd viraal deeltje in een agarose-kraal demonstreert hoe confocale lasersmicroscopie kan worden gebruikt om te visualiseren en te bevestigen dat er in elke put een enkel virion is verkregen na vastlegging en inbedding in agarose; de inzet toont een hogere vergroting van het geïsoleerde viraal deeltje.

Hier wordt een profielplot getoond van de relatieve fluorescentie van het gekleurde enkele virusdeeltje binnen een agarosekraal. Deze laatste reeks figuren laat zien hoe bijna het volledige Lambda-genoom, met uitzondering van de eerste vijf baseparen, werd teruggewonnen voor dit representatieve virus. Hier wordt de GC-plot getoond voor het geïdentificeerde enkele virusgenoom. Deze figuur toont de genoomkaart van lambda. Ten slotte wordt de mapping van een enkel virusgenoom getoond voor de representatieve geïsoleerde en geamplificeerde bacteriofaag lambda. De X-as toont de genoompositie. De Y-as toont het percentage dekking.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om steriele technieken toe te passen en de tijd te nemen om contaminatie te voorkomen. Na deze procedure kunnen andere methoden worden gebruikt om de taxonomie van de geïsoleerde virionen te beoordelen voordat er volledige genoomsequencing plaatsvindt. Na het bekijken van deze video zou u een goed beeld moeten hebben van hoe u individuele virionen kunt isoleren met behulp van fluorescence-activated cell sorting, confocale microscopie en whole genome amplification.