Isolatie en Genoomanalyse van Single Virionen gebruik 'Single Virus Genomics'
26 mei 2013
Single Virus Genomics (SVG) is een methode om te isoleren en versterken de genomen van enkele vironen. Virale suspensies van een gemengde assemblage worden naargelang het gebruik van flowcytometrie op een objectglaasje met discrete putjes die agarose, waardoor het vastleggen van het virion en het verminderen van het genoom afschuiving bij opwerking. Whole genome amplificatie wordt bereikt door verschillende verplaatsing amplificatie (MDA) resulterend in genomisch materiaal dat geschikt is voor het rangschikken.
Het algemene doel van deze procedure is om enkele varianten te isoleren van een gemengd consortium en om het verkregen genoommateriaal te sequencen om virussen uit verschillende omgevingen te identificeren zonder de noodzaak van cultivatie. Dit wordt bereikt door eerst de enkele varianten te isoleren met behulp van flowcytometrische sortering op aro parels. Enkele ionencapturing wordt vervolgens gevalideerd door confocale microscopie.
Vervolgens wordt het genoommateriaal van de ionen geïsoleerd en geamplificeerd met behulp van multiple displacement amplification of MDA om de hoeveelheid DNA te genereren die nodig is voor sequencing. Ten slotte wordt het virale DNA gesequenced met behulp van high throughput technologieën om een overmatige dekking van het virionen genoom te genereren, wat substantieel helpt bij de genoomassemblage en annotatie. Uiteindelijk maken bioinformaticatechnieken die gericht zijn op het gebruik van sequence subsampling benaderingen om de con grootte te vergroten, analyse van geïsoleerde vons mogelijk.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van virale ecologie door genomische context te geven aan de enorme pool van geannoteerde OC plankton genen, en tevens de ontdekking van nieuwe genomen uit verschillende ecosystemen mogelijk te maken. Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat amplificatie en isolatie van enkele ionen de grenzen van de huidige technologie opvullen. We hadden eerst het idee voor deze methode toen we het gebruik van MDA op Vero plankton gemeenschappen aan het evalueren waren en realiseerden dat het mogelijk was om een enkele virale deeltje te sorteren en te sequencen en daardoor een volledig virionaal genoom te assembleren uit deze complexe gemeenschappen. Om virussen te sorteren met behulp van een flowcytometer uitgerust met aangepaste forward scatter fotomultiplier tubes of F-S-C-P-M-T begin je door de virale deeltjes te verdunnen in 0,1 micron gefilterde tris, EDTA voor een gemengde samenstelling die T vier en lambda fagendeeltjes bevat. Zet de F-S-C-P-M-T op 1000 en de SSC op 200 om de signaal-ruisverhouding te maximaliseren.
Na het uitvoeren van controlemonsters, loop ongeveer 100 microliter van de duurzame virale suspensie tot een totaal van 5.000 gebeurtenissen. Gebruik vervolgens de cyber green een en F-S-C-P-M-T grafieken om een strakke gate in het midden van de virale deeltjes te plaatsen. Voeg nu vijf microliter van 1% low melting point aros in TBE buffer gekoeld tot 37 graden Celsius toe aan elke put op een A-P-T-F-E microscoopslide en laad vervolgens de slide in de flowcytometer om de gesorteerd virale deeltjes te vangen.
Begin met sorteren, waarbij 10 of meer virale deeltje gebeurtenissen in sommige van de putten worden gevangen om de detectie van de diepte van virussen tijdens confocale laserscanning microscopie te vergemakkelijken. Wanneer het sorteren voltooid is, verwijder de slide van de flowcytometer en voeg nog eens vijf microliter van low melting point aros gekoeld tot 37 graden Celsius toe aan elke put. Bedoeling is om de virale deeltjes voor enkele varion te bedekken.
Stel de confocale laserscanning microscoop in op 488 nanometer. Excitatie en beeld de ingebedde deeltjes vervolgens af met behulp van een 63 x lange werkafstand objectief om te verifiëren dat er slechts een enkele deeltje aanwezig is en dat meerdere virussen niet bovenop elkaar zijn gestapeld. Wanneer de putten met enkele virussen zijn geïdentificeerd, gebruik dan een scheermesje om de gewenste agro parels van de slide te verwijderen en plaats ze in een steriele PCR buis.
Plaats de buis in de hitteblok van een thermocycler ingesteld op 94 graden Celsius gedurende drie minuten om het virale deeltje in situ te lyze. Na het uitvoeren van een gewijzigde MDA, breng het genoom DNA over naar 1,7 milliliter einor buisjes en voeg een tiende volume van drie molair natriumacetaat toe in TBE buffer. Om het geamplificeerde genoommateriaal te zuiveren, plaats de monsters gedurende 10 minuten op 55 graden Celsius om de aros op te lossen en vervolgens verplaats de buisjes naar 42 graden Celsius om de temperatuur te verlagen voordat het enzym wordt toegevoegd. Voeg nu twee eenheden beta aase toe aan elke buis en incubeer de buisjes gedurende twee uur.
Voeg vervolgens een volume van een bufferverzadigde fenoloplossing toe aan elke buis. Meng krachtig en centrifugeer de buisjes gedurende 15 minuten bij 3.500 keer G. Bij kamertemperatuur, breng het DNA bevattende SUPERNATANTS over naar een nieuwe 1,7 milliliter einor buis. Voeg vervolgens een volume van 100% isopropanol en één microliter glyco blue toe aan de buisjes en draai de buisjes om om te mengen nadat de buisjes opnieuw zijn gecentrifugeerd.
Deze keer gedurende 60 minuten bij 28.000 keer G en vier graden Celsius. Decanteer het isopropanol, zorg ervoor dat het pellet niet wordt verstoord en voeg 150 microliter van 70% ethanol toe aan elke buis. Centrifugeer de buisjes gedurende 10 minuten bij 28.000 keer G bij kamertemperatuur. Decanteer het ethanol, droge lucht het DNA pellet en suspendeer het DNA opnieuw in een geschikt volume tris EDTA buffer. Deze driedimensionale reconstructie van een cyber green, een gekleurd virale deeltje binnen een agro snelheid demonstreert hoe confocale lasermicroscopie kan worden gebruikt om te visualiseren en te bevestigen dat een enkel virion wordt verkregen in elke put na het worden gevangen en ingebed in aros, de inzet toont een hogere vergroting van het geïsoleerde virale deeltje.
Hier wordt een profielplot van de relatieve fluorescentie van het gekleurde enkele virale deeltje binnen een aro parel weergegeven. Deze laatste reeks figuren toont hoe bijna het hele Lambda genoom, met uitzondering van de eerste vijf basenparen, werd hersteld voor dit representatieve virus. Hier is de GC plot voor het enkele virus.
Het geïdentificeerde genoom wordt getoond. Deze figuur toont de genoomkaart van lambda. Ten slotte wordt de mapping van een enkele virusgenoom getoond voor het representatieve geïsoleerde en geamplificeerde bacteriofage lambda.
De X-as toont de genoompositie. De Y-as toont het percentage dekking
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Single Virus Genomics (SVG) is een methode die is ontworpen om de genomen van enkele virons uit gemengde virale suspensies te isoleren en te versterken. Deze techniek maakt gebruik van flow cytometry voor sortering en gebruikt meerdere verplaatsingsversterking (MDA) voor versterking van het hele genoom, wat de daaropvolgende sequencing mogelijk maakt.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Virologie
- Genomics
- Microbiologie
Achtergrond
- Het isoleren van enkele virons maakt de studie van virale genomen zonder cultivatie mogelijk.
- Flow cytometry wordt gebruikt om virons op agarosekralen te sorteren.
- Confocale microscopie valideert de opvang van enkele virons.
- High throughput sequencing-technologieën worden gebruikt voor genomische analyse.
Doel van de studie
- Om enkele virons uit gemengde consortia te isoleren.
- Om genomisch materiaal te sequencen voor virusidentificatie.
- Om genoomsamenstelling en annotatie door bioinformatica te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Flow cytometrische sortering van virale suspensies.
- Isolatie van genomisch materiaal van gevangen virons.
- Meervoudige verplaatsingsversterking (MDA) voor DNA-versterking.
- High throughput sequencing voor uitgebreide genomische dekking.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van enkele virons uit gemengde monsters.
- Generatie van voldoende DNA voor sequencing door middel van MDA.
- High coverage sequencing die helpt bij genoomsamenstelling.
- Toepassing van bio-informaticatechnieken voor data-analyse.
Conclusies
- SVG is effectief voor het bestuderen van virale genomen in diverse omgevingen.
- De methode vermindert genoomversnippering tijdens verwerking.
- Bioinformatica verbetert de analyse van geïsoleerde virons.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Single Virus Genomics (SVG) enables cultivation-free genomic characterization of individual virions, addressing a critical gap in viral ecology and discovery pipelines. By isolating and amplifying single viral genomes from complex mixtures, SVG supports target de-risking and predictive confidence in early-stage antiviral and phage therapy research. This method enhances portfolio relevance by providing high-resolution genomic data from unculturable viruses, informing mechanistic studies and translational biomarker alignment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of viral hypotheses by providing genomic context to individual virions from mixed environmental samples.
- Operational Value: Supports biological de-risking through cultivation-free isolation, reducing false negatives in target identification.
- Predictive Value: Generates high-coverage sequencing data that aids in genome assembly and annotation, improving confidence in viral target selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, high-molecular-weight genomic DNA via MDA, enabling reliable downstream sequencing and comparative analysis.
- Operational Value: Facilitates assay readiness through flow cytometry-based sorting and confocal validation, ensuring reproducible single-virion capture.
- Scalability: Allows processing of thousands of events via flow cytometry, supporting high-throughput screening of viral diversity.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase viral genome data to preclinical validation by enabling sequence-based taxonomy and functional inference.
- Biomarker Alignment: Supports identification of viral genomic signatures that may correlate with pathogenic potential or host interaction profiles.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in viral target selection through direct genomic evidence.
Pipeline & Workflow Integration
SVG fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing and target validation prior to lead identification and preclinical evaluation. Its output—amplified, sequencable viral DNA—directly enables genomic screening and comparative analytics workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating single virons for genomic interrogation, clarifying viral diversity and functional potential in complex communities.
- Screening: Enables assay standardization through flow sorting and MDA amplification, providing reproducible inputs for sequencing-based screening platforms.
- Analytics: Generates quantitative genomic outputs (coverage, GC content, genome maps) that allow cross-condition comparison and variant calling.
- Translational Research: Connects to preclinical work by providing genome-resolved data that can inform biomarker development and mechanism-of-action studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for viral genome characterization across diverse ecosystems, reducing reliance on cultivation-dependent methods.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in viral target validation by delivering cultivation-free, genome-resolved data from single particles.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through validated single-virion capture via flow cytometry and confocal microscopy.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of viral targets, reducing investment in non-viable or poorly characterized candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering high-confidence genomic data that informs advancement decisions in antiviral and phage-derived therapeutic pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, confocal microscopy, and molecular biology for single-particle handling and amplification.
- Dependent on access to flow cytometers with custom scatter detection and high-throughput sequencing infrastructure.
- Necessitates standardized protocols for sample preparation, contamination control, and bioinformatic analysis across teams.
- Must account for variability in viral size, density, and staining efficiency when adapting to diverse viral systems or environmental samples.
- Practical limitations include amplification bias and stochastic sampling effects inherent to single-cell/single-virion MDA approaches.
