Affiniteit Neerslag van Active Rho-GEFs Met behulp van een GST-gelabeld Mutant Rho Protein (GST-RhoA (G17a)) van epitheelcellen Lysaten

Het algemene doel van deze procedure is om de activatie van RO door specifieke G-D-P-G-T-P-uitwisselingsfactoren of gafs in gekweekte cellen te volgen, door gebruik te maken van een mutant RO A GST-fusie-eiwit met een hoge affiniteit voor geactiveerde gs. Dit wordt bereikt door eerst het GST-getagde mutante row-eiwit in bacteriën te produceren. Vervolgens wordt de bead-gekoppelde GST row A gezuiverd.

Vervolgens worden de zuiverheid en concentratie van het GST RO A-eiwit beoordeeld met behulp van SDS-PAGE. Ten slotte worden cellysaten voorbereid en wordt een GEF-precipitatie-assay uitgevoerd met het GST RO A-eiwit. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een verhoogde precipitatie van geactiveerd GS in behandelde cellen laten zien via western blot-analyse van de geprecipiteerde eiwitten met een specifiek anti-GF-antilichaam en kwantificering via densitometrie.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van een aantal boeiende vragen in het veld van de ruwe GTPS, zoals hoe de vele row G-D-P-G-T-P-uitwisselingsfactoren op een signaalspecifieke manier worden gereguleerd en hoe hun activiteit wordt gecoördineerd. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode in het begin moeite hebben, omdat het GST RO G 17 A-eiwit relatief instabiel is en kan afbreken tijdens de preparatie. Het is daarnaast belangrijk om te onthouden dat de GF-precipitatieanalyse snel en consistent moet worden uitgevoerd. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Pfizer Vahid, een masterstudent uit mijn lab, om e coli te transformeren.

Voeg snel 1 µL van 25 tot 50 ng/µL PX row A G 17 A DNA toe aan een aliquot DH5α competente cellen in een ijsbad. Tik tegen de buis om te mengen en incubeer 30 minuten op ijs. Heatshock de cellen bij 42 °C gedurende 45 seconden en plaats ze vervolgens gedurende twee minuten terug op ijs.

Voeg 900 µL SOC-medium toe en kweek gedurende één uur bij 37 °C onder schudding. Verspreid met een gebogen steriele plastic pipet 50 tot 100 µL van de getransformeerde bacteriën op een vooraf bereide LB-agar- en persinplaat. Incubeer de plaat met de bodem naar beneden in een incubator bij 37 °C gedurende vijf minuten, keer de plaat vervolgens om en kweek deze overnacht.

Selecteer een goed geïsoleerde kolonie van getransformeerde bacteriën en gebruik deze om 50 milliliters LB met ampicilline te inoculeren. Laat dit gedurende de nacht groeien bij 37 degrees SIUs onder agitatie. Wanneer de cultuur de volledige dichtheid heeft bereikt, wordt deze verdund met 450 milliliters LB ampicilline en nog 30 minuten verder gekweekt. Induceer de bacteriën bij 37 degrees Celsius om row proteïne te produceren door 500 microliters van 100 millimolar IPTG toe te voegen aan een 500 milliliter cultuur.

Verlaag de temperatuur naar 22 tot 24 °C en laat deze ongeveer 16 uur groeien. Centrifugeer de cultuur bij 3.600 ×g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Vries de pellets gedurende ten minste één uur of bij voorkeur overnacht in bij -80 °C.

Nadat 200 milliliters lysisbuffer is voorbereid zoals beschreven in het schriftelijke protocol, wordt lysisbuffer plus gemaakt door 10 milliliters aan te vullen met één millimolar DTT, één millimolar PMSF en één protease-inhibittablet, waarbij op ijs wordt gewerkt. Voeg 10 milliliters lysisbuffer plus toe aan de Thor-pellets en resuspendeer grondig door te pipetteren en te vortexen. Sonicate de suspensie op ijs gedurende één minuut op stand vier met een 50%pulse.

Centrifugeer het gesoniceerde lysaat 15.000 tot 20.000 ×g gedurende 15 minuten bij 4 °C en breng het geklaarde sonicaat over naar een steriele, afgesloten buis van 15 ml. Bereid de glutathione sphero beads voor door de 75% slurry voorzichtig te mengen en met een wide-bore tip 335 µL over te brengen naar een buis van 15 ml. Voeg 10 ml koud PBS toe en centrifugeer dit 500 ×g gedurende vijf minuten bij 4 °C.

Verwijder het supernatant. Voeg één milliliter lysisbuffer plus toe aan de kralen en centrifugeer opnieuw. Verwijder het supernatant opnieuw en voeg lysisbuffer toe.

Maak daarna een 50% slurry door twee delen van 50 µL geëquilibreerde bead slurry te combineren met het voorbereide supernatant. Draai dit 45 minuten bij 4 °C. Bereid HBS plus door 100 mL HBS-buffer aan te vullen met 5 mM magnesiumchloride en 1 mM DTT. Centrifugeer het supernatant en de beads 5 minuten bij 500 ×g bij 4 °C.

Verwijder het supernatant en was de beads tweemaal met 10 milliliters lysis buffer plus en tweemaal met 10 milliliters HBS plus. Maak na de laatste wasbeurt een suspensie van 50% door de beads opnieuw op te lossen in HBS plus aangevuld met protease-inhibitor. Verdun 10 microliters van de uiteindelijke bead-preparatie met twee keer lam ly sample buffer bevattend beamr cap twee ethanol.

Maak vervolgens drie BSA-standaardmonsters door 10 µL, 5 µL en 2,5 µL van een BSA-voorraadoplossing van 2 mg/mL te mengen met 10 µL Laemmli-buffer.

Kook de monsters gedurende vijf minuten, centrifugeer ze vervolgens kort en scheid ze samen met een molecuulgewichtmarker op een 10% SDS-polyacrylamidegel; schat na kleuring en ontkleuring van de gel de GST-rij A G 17 A in met behulp van de BSA-standaarden als referentie. Verdeel een gelijk volume kralen met ongeveer 10 tot 15 microgram eiwit over 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes. Ter voorbereiding op de GF-pull-downassay worden de te gebruiken cellen tot confluentie gekweekt in 10 centimeter schalen en ten minste drie uur vóór de assay serumvrij gehouden.

Vlak voor de start van de assay. Bereid lysisbuffer plus met protease-remmers voor op ijs. Verwijder het kweekmedium uit de schalen en was met ijskoud HBS.

Verwijder alle HBS en voeg 700 µL lysisbuffer plus toe aan elk schaaltje. Schud de platen om alle gebieden te bedekken.

Schraap vervolgens de lysaten weg en verzamel deze in genummerde buisjes van 1,5 milliliter. Centrifugeer 1 minuut bij 15,000 ×g bij vier graden Celsius. Bewaar het supernatant voor de assay; indien het aantal cellen in elke plaat gelijk was, neem dan 30 µL van elk supernatant en meng dit met 30 µL van een tweevoudige reducerende lysis-monsterbuffer.

Kook het mengsel vervolgens en zet het op ijs. Voeg de overige supernatanten toe aan aliquots van de GST row a G 17 A-beads en roteer gedurende 45 minuten bij 4 °C. Centrifugeer de beads bij 6.800 ×g gedurende 10 seconden bij 4 °C.

Verwijder het supernatant en was de beads drie keer met lysisbuffer. Gebruik een spuit van 1 cc voorzien van een naald van 30 gauge om de laatste wasbeurt volledig te verwijderen en voeg 20 µL van tweemaal reducerende laly-monsterbuffer toe. Kook de monsters gedurende vijf minuten, centrifugeer om de beads te pelletteren en analyseer de totale cellysaten en geprecipiteerde eiwitmonsters op een SDS-PAGE-gel met het juiste percentage voor de grootte van de bestudeerde GF.

Voer ten slotte een western blot uit om de relevante GFA succesvolle GF-assay te detecteren. De detectie van de activatie van de uitwisselingsfactor GFH one wordt hier getoond. De rij A G 17 A proteïne vangt enige GFH one op uit de controlcell-lysaten, wat suggereert dat GFH one een basale activiteit heeft.

De hoeveelheid neerslag nam echter toe in cellen die behandeld waren met het inflammatoire cytokine tumornecrosefactor alfa, wat consistent is met de opvatting dat TNF alfa G FH one activeert. Belangrijk is dat het totale cellysaat vergelijkbare hoeveelheden gfh one laat zien in de controle- en de behandelde monsters, wat suggereert dat de behandeling de G FH one-niveaus niet heeft veranderd en dat de input die in de assay is gebruikt gelijk was. Bij het aanpassen van deze procedure is het belangrijk om het GSE RO G 17 A-eiwit en de CELLIS eights op ijs te bewaren.

Voer de GF-assay snel en consistent uit, en gebruik adequate positieve controles die invalidatie en probleemoplossing mogelijk maken.