Name: Affiniteit Neerslag van Active Rho-GEFs Met behulp van een GST-gelabeld Mutant Rho Protein (GST-RhoA (G17a)) van epitheelcellen Lysaten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Leer een affiniteit neerslagmethode voor actieve Rho-GEFs met behulp van GST-RhoA(G17A) uit epitheelcellenlysaten. Deze techniek maakt kwantitatieve detectie van GEF-activatie mogelijk via Western blot en densitometrie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gefinancierd door de Canadese Instituut voor Gezondheidsonderzoek (CIHR) (MOP-97774) en de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC, subsidie ​​nr: 480619). KS is een ontvanger van een KRESCENT New Investigator Award (een gezamenlijke gunning van de Nierstichting van Canada, de Canadese Nefrologie Society en Canadese Institute of Health Research) en een vroege Onderzoeker Award van de Ontario ministerie van Onderzoek en Innovatie. FW wordt ondersteund door een Li Ka Shing beurs.

1. Transformatie van E. coli met pGEX-RhoA (G17a) Construct <ol><li> Bereid LB-agar door het oplossen van 2,5 g LB en 1,5 g agar-agar in 100 ml dH 2 O. Autoclaaf en afkoelen tot een geschatte 50-55 ° C, die een vuistregel wanneer de kolf kan gemakkelijk worden gehouden. </li><li> Bereid Ampicilline (Amp) voorraad door het oplossen van 50 mg / ml in dH 2 O. Spuit filter en bevriezen ongebruikte porties. Voeg 100 ul Amp voorraad (uiteindelijke concentratie 50 ng / ml) van de LB-Agar van 1.1. Swirl te mengen en giet het in 10 cm bacteriële gerechten (15-20 ml / gerecht). Laat het stollen (15-30 min.) En ongebruikte platen omgekeerd bij 4 ° C opgeslagen gedurende 2-3 weken. </li><li> E. transformeren Coli snel smelten een hoeveelheid DH5a competente cellen in een ijsbad. Voeg 1 pi pGEXRhoA (G17a) DNA verdund tot 25-50 ng / pl. Flick de buis te mengen en op ijs geïncubeerd gedurende 30 minuten. Hitteschok bij 42 ° C gedurende 45 seconden en weer plaatsen op ijs gedurende 2 minuten. Voeg 900 &amp; mu; L SOC medium en groeien gedurende een uur bij 37 ° C met schudden. </li><li> Spreiding 50-100 ul van de getransformeerde bacteriën op LB-amp-Agar plaat met een gebogen steriele Pasteur pipet. Incubeer de plaat goede kant naar boven in een 37 ° C incubator gedurende 5 minuten en dan omkeren en groeien &#39;s nachts. </li><li> Een enkele kolonie zal worden van de plaat geplukt voor de voorbereiding van het GST-gelabeld eiwit (stap 2.1). Voor toekomstig gebruik, wrap en op te slaan platen omgekeerd bij 4 ° C gedurende ongeveer 3 weken. Bovendien bacteriële voorraad worden bereid meer langdurige opslag bij toenemende afzonderlijke kolonies in 2 ml steriele LB-amp nacht bij 37 ° C met schudden. Meng een aliquot steriele 80% glycerol in een 1:1 verhouding en invriezen bij -80 ° C. </li></ol> 2. Voorbereiding van de GST-RhoA (G17a) Kralen <ol><li> Bereid LB door toevoeging van 25 g LB 1 L dH 2 0 en autoclaveren. Bij het afkoelen, voeg 50 ul Amp uit voorraad tot 50 ml LB (50 ug / ml uiteindelijke concentratie). Inoculeren met een goed geïsoleerd colony van getransformeerde bacterien en groeien nacht bij 37 ° C onder roeren. Toen volledige dichtheid (OD 600&gt; 1.0) verdund met 450 ml LB-amp en groeien gedurende 30 minuten bij 37 ° C. </li><li> Bereid een 100 mM voorraad oplossing van isopropyl BD-thiogalactopyranoside (IPTG) door het oplossen van 0,238 g in 10 ml dH 2 O. Bewaren in fracties bij -20 ° C. Induceren bacteriën Rho eiwit door toevoeging van 500 pi 100 mM IPTG aan 500 ml cultuur (een eindconcentratie van 100 uM). Verlaag de temperatuur tot 22-24 ° C en te groeien voor ~ 16 uur uur. </li><li> Spin cultuur bij 3600 g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Indien nodig kan de 500 ml cultuur worden verdeeld in 50 ml van centrifugatie. Freeze pellet (s) ten minste 1 uur (bij voorkeur nacht) bij -80 ° C. </li><li> Bereid 200 ml lysisbuffer die 20 mM HEPES (0,95 g) / pH 7,5, 150 mM NaCl (1,75 g), 5 mM MgCl2 (0,203 g), 1% TX-100 (2 ml). Bereid voorraadoplossingen van 1M DTT (1,542 g in 10 ml dH 2 O) En 100 mM PMSF (0,174 g/10 ml EtOH). Om lysisbuffer + voor te bereiden, aan te vullen met 10 ml 1 mM DTT (10 ul van voorraad) en 1 mM PMSF (100 pl voorraad) en een complete mini Proteaseremmer tablet. </li><li> Werken aan ijs, voeg 10 ml lysis buffer + om de pellets uit stap 2.3. Resuspendeer grondig door zachte vortexen en pipetteren. Schuimvorming te voorkomen. Bewerk met ultrasone trillingen op ijs gedurende 1 minuut op het vaststellen van 4 met 50% puls. Draai het gesoniceerde lysaat op 15,000-20,000 g gedurende 15 minuten bij 4 ° C, en verwijder de geklaarde ultrasone trillingen (supernatans) in een steriele afgedekt 15 ml buis. </li><li> Bereid de Glutathion Sepharose door voorzichtig mengen van de originele buis met een 75% slurry en overdracht 335 pl in een 15 ml buis. Gebruik een wijde boring tip om kralen pipet. Voeg 10 ml koud PBS en spin 500 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant, voeg 1 ml lysis buffer + aan de kralen en draaien als voor de vorige wasbeurt. Verwijder het supernatant en add lysisbuffer + om een ​​50% slurry te maken. </li><li> Voeg 250 pi equilibrated kraal slurry aan de supernatant uit stap 2.5. Roteren bij 4 ° C gedurende 45 minuten. </li><li> Bereid 500 ml HBS bevattende 20 mM HEPES (2,38 g) / pH 7,5 en 150 mM NaCl (4,38 g) in DH 2 O. Bereid voorraad oplossingen van 1M MgCl2 (0,952 g in 10 ml dH 2 O) en 1M DTT (1,542 g in 10 ml dH 2 O). Om HBS + bereiden, 100 ml vlak voor gebruik met 5 mM MgCl2 (50 pi uit voorraad) en 1 mM DTT (100 pi uit voorraad). </li><li> Draai de kralen van stap 2,7 bij 500 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en was kralen 2x met 10 ml lysis buffer +, en 2x met 10 ml HBS +. Na de laatste wassing, een 50% suspensie door de korrels te mengen in HBS + aangevuld met BD BaculoGold proteaseremmer (20 pi 50x BD BaculoGold / ml). </li><li> Verdun 10 ul van de uiteindelijke korrels preparaat met 2x Laemmli monsterbuffer met β-mercapto-ethanol. Maak Bovine serum albumine (BSA) normen. Gebruik 2 mg / ml voorraadoplossing (0,02 g BSA in 10 ml dH 2 O). Mix 10 ul op voorraad met 10 ul Laemmli (20 pg final), 5 pi op voorraad met 5 pi van dH 2 O en 10 ul Laemmli (10 ug final), en 2,5 pl voorraad met 7,5 ui dH 2 O en 10 ul Laemmli (5 pg def.) Kook alle monsters (5 min). Draai de kraal monster en laat supernatant met BSA normen molecuulgewichtsmerkers op een 10% SDS-polyacrylamidegel. </li><li> Bereid de Comassie Blue vlek (0,1 g in 10 ml azijnzuur, 40 ml methanol en 50 ml dH 2 O) en destain (500 ml dH 2 O 400 ml methanol en 100 ml azijnzuur). Bewaar bij kamertemperatuur. Vlekken op de gel voor 20-30 minuten, verwijder de kleurstof (het kan worden hergebruikt meerdere keren) en tweemaal spoelen met destain oplossing. Blijf destain onder voorzichtig schudden gedurende enkele uren tot banden zijn duidelijk zichtbaar. </li><li> Bereken de concentratie van GST-RhoA (G17a) gekoppeld met de korrels met de BSA normen als referentie (fig. 2). Aliquot een gelijk volume kralen die ~ 10-15 ug eiwit in 1,5 ml micro centrifugebuizen. Store kralen bij 4 ° C om te gebruiken binnen een dag. Bevries bij -80 ° C in HBS + / glycerol in een 3:1 verhouding te gebruiken binnen enkele dagen. </li></ol> 3. GEF Pulldown de muis met Nucleotide-free RhoA (G17a) Kralen <ol><li> Cellen groeien in 10 cm schaaltjes voor confluentie. Serum ontnemen tenminste 3 uur behandelen vereist. </li><li> Bereid lysis buffer + als in stap 2.4. Bereid genoeg lysis buffer voor 700 pl / schotel plus een aantal extra bedrag toe te staan ​​voor pipetteren fouten. Voeg de proteaseremmers vlak voor gebruik. </li><li> Werken op het ijs, verwijder kweekmedium van de gerechten en wassen met ijskoud HBS. Verwijder alle HBS en voeg 700 ul lysisbuffer + bij elk gerecht. Swirl platen tot alle gebieden, schrapen en het verzamelen van lysaten in genummerde 1,5 ml buizen. Spin bij 15.000 g gedurende 1 min bij 4 ° C. Het supernatant wordt gebruikt voor de test. </li><li> Als uw mobiele nummer is gelijk in allegerechten worden getest, kun je het weg doen van een eiwit-test, en ga naar stap 3.5. Anders meten eiwitconcentratie van elke supernatant met Bio-Rad proteïne assay snel en gelijk de supernatant voor volume en concentratie. De totale hoeveelheid eiwit afhankelijk van de cellen die worden gebruikt (gewoonlijk 1-1,5 mg eiwit LLC-PK1 cellen). </li><li> Verwijder 30 ul van elk supernatant en meng met 30 ul 2x het verminderen van Laemmli monsterbuffer, kook en laat de stap 3.7. Voeg de resterende supernatanten aan porties van de GST-RhoA (G17a) kralen uit stap 2.12. Draaien gedurende 45 minuten bij 4 ° C. </li><li> Spin kralen bij 6.800 g gedurende 10 seconden bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en was de korrels 3x met lysisbuffer, centrifugeren op dezelfde wijze wasjes. Volledig verwijderen van de laatste wasbeurt met een 1 cc injectiespuit voorzien van een 30 G naald en voeg 20 ul 2x het verminderen van Laemmli monsterbuffer. Kook gedurende 5 minuten. Draai om pellet kralen en ofwel onmiddellijk voer het supernatant (bij voorkeur) of plaatst u het eent -80 ° C voor latere analyse. </li><li> Run 20 pl totaal cellysaten en al van het neergeslagen eiwit monsters op de juiste percentage SDS-polyacrylamide gel voor de grootte van GEF je studeert. Detecteert uw GEF van een keuze door Western blotting met behulp van een specifiek antilichaam. </li></ol> 4. Representatieve resultaten Deel 1 en 2 van het protocol beschreven bereiding van GST-RhoA (G17a) gekoppeld aan GSH-sefarosekorrels en testen door SDS-PAGE (zie omtrek van protocol in fig. 1). Een typische Coomassie gekleurde gel wordt op Figuur 2. Het monster met het geëlueerde eiwit moet een enkele band bij ongeveer 50 kDa (figuur 2, laan 6). De concentratie van het eiwit kunnen worden bepaald met behulp van de BSA referentiemonsters. In het voorbeeld van fig. 2, wordt de concentratie van RhoA (G17a) gelijk is aan 15 pi μg/10 zijn. Zo werden fracties van 10 pl / buis opgesteld. De typische opbrengst<html> in de hand 15-20 ug eiwit van 10 ml bacteriële lysis. Deel 3 van het protocol beschrijft de affiniteit neerslag assay (zie overzicht op Fig 1). Een succesvolle test GEF het opsporen van de activering van de uitwisseling factor GEF-H1 wordt weergegeven op Fig 3. De RhoA (G17a) eiwit gevangen sommige GEF-H1 van de controle (onbehandelde) cellysaten, wat suggereert dat GEF-H1 basale activiteit heeft. De hoeveelheid neergeslagen echter stijgingen van de cellen behandeld met het inflammatoir cytokine Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α), consistent met het idee dat TNF-α GEF-H1 5,7 activeert. Belangrijk is dat de totale cellysaten tonen overeenkomstige hoeveelheden GEF-H1 in de controle en het behandelde monster, wat suggereert dat de behandeling niet GEF-H1 niveau veranderen en de ingang in de test gelijk. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig1.jpg" /> Figuur 1. Overzicht van het protocol. ove_content &quot;&gt; <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig2.jpg" /> Figuur 2. Representatief resultaat van de kraal preparaat protocol. Een Coomassie gekleurde gel met succesvolle GST-RhoA (G17a) kraal voorbereiding wordt weergegeven. Kralen monster en BSA eiwit standaarden werden gescheiden door SDS-PAGE met een 10% acrylamide gel. Om de korrels te testen, wordt 10 ul van de uiteindelijke korrel slurry met GST-RhoA (G17a) 1:1 met reducerende Laemmli monsterbuffer en 5 minuten gekookt. De korrels werden kort gesponnen en het supernatant geladen op de gel. De volgende monsters werden geladen: Baan 1: moleculair gewicht marker (MW) (FroggaBio Blueye prestained eiwit ladder); Lanes 2-4: 5, 10 en 20 ug Bovine serum albumine (BSA), Lane 5 is leeg; Lane 6: 10 ul van de vers bereide RhoA (G17a) kralen. Na scheiding is voltooid, wordt de gel gekleurd met Coomassie Blue vervolgens ontkleurd met eiwitten te onthullen. Het molecuulgewicht van de GST-RhoA (G17a) eiwit ongeveer 50<html> kDa en loopt rond het niveau van de 48 kDa marker. De concentratie van het GST-Rho eiwit in dit monster wordt geschat op ongeveer 15 pi μg/10 slurry. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig3.jpg" /> Figuur 3. Representatieve GEF activering assay met TNF-α-geïnduceerde activatie van GEF-H1. Confluente LLC-PK1 cellen werden behandeld met 10 ng / ml TNF-α gedurende 5 minuten. Na de behandeling werden de cellen gelyseerd en actieve GEFs werden gevangen met behulp van GST-RhoA (G17a) gebonden kralen. De aanwezigheid van GEF-H1 in de neergeslagen eiwitten (boven blot) en totaal cellysaat monsters (onder blot) werd gedetecteerd met Western blotting met een anti-GEF-H1 antilichaam (Cell Signaling). Let op het verhoogde bedrag van de neergeslagen GEF-H1 in de TNF-α behandelde versus niet-behandelde cellen ten opzichte van het equivalente ingangen, wat wijst op een succesvol resultaat. 3932/3932fig4.jpg &quot;/&gt; Figuur 4. Een &quot;slecht resultaat&quot;. Hoewel de GEF pulldown assay hier tot enkele GEF-H1 opgenomen door de korrels bedragen neergeslagen uit controle-en TNF-α-behandelde cellen hetzelfde. Zo TNF-α, heeft een kennis activator van GEF-H1 in dit geval niet leiden tot activering. In dit experiment latere oplossen van problemen gesuggereerd dat de gebruikte TNF-α was niet vers genoeg en waarschijnlijk afgebroken.

<ol><li>Jaffe, A. B., Hall, A. R. ho <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTPases%3A+biochemistry+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">GTPases: biochemistry and biology.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 247-269 (2005).</li>
<li>Rossman, K. L., Der, C. J., Sondek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GEF+means+go%3A+turning+on+RHO+GTPases+with+guanine+nucleotide-exchange+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">GEF means go: turning on RHO GTPases with guanine nucleotide-exchange factors.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 167-180 (2005).</li>
<li>Arthur, W. T., Ellerbroek, S. M., Der, C. J., Burridge, K., Wennerberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XPLN%2C+a+guanine+nucleotide+exchange+factor+for+RhoA+and+RhoB%2C+but+not+RhoC%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">XPLN, a guanine nucleotide exchange factor for RhoA and RhoB, but not RhoC.</a> J. Biol. Chem. 277, 42964-42972 (2002).</li>
<li>Garcia-Mata, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+activated+GAPs+and+GEFs+in+cell+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analysis of activated GAPs and GEFs in cell lysates.</a> Methods Enzymol. 406, 425-437 (2006).</li>
<li>Kakiashvili, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GEF-H1+Mediates+Tumor+Necrosis+Factor-%7Balpha%7D-induced+Rho+Activation+and+Myosin+Phosphorylation%3A+role+in+the+regulation+of+tubular+paracellular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">GEF-H1 Mediates Tumor Necrosis Factor-{alpha}-induced Rho Activation and Myosin Phosphorylation: role in the regulation of tubular paracellular permeability.</a> J. Biol. Chem. 284, 11454-11466 (2009).</li>
<li>Waheed, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+signal+regulated+kinase+and+GEF-H1+mediate+depolarization-induced+Rho+activation+and+paracellular+permeability+increase%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Extracellular signal regulated kinase and GEF-H1 mediate depolarization-induced Rho activation and paracellular permeability increase.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. , (2010).</li>
<li>Kakiashvili, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidermal+growth+factor+receptor+mediates+tumor+necrosis+factor-alpha-induced+activation+of+the+ERK%2FGEF-H1%2FRhoA+pathway+in+tubular+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The epidermal growth factor receptor mediates tumor necrosis factor-alpha-induced activation of the ERK/GEF-H1/RhoA pathway in tubular epithelium.</a> J. Biol. Chem. 286, 9268-9279 (2011).</li>
<li>Garcia-Mata, R., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catching+a+GEF+by+its+tail%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Catching a GEF by its tail.</a> Trends Cell Biol. 17, 36-43 (2007).</li>
<li>Dubash, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+small+GTPase+RhoA+localizes+to+the+nucleus+and+is+activated+by+Net1+and+DNA+damage+signals%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The small GTPase RhoA localizes to the nucleus and is activated by Net1 and DNA damage signals.</a> PLoS One. 6, e17380-e17380 (2011).</li>
<li>Guilluy, G., Dubash, A. D., García-Mata, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+RhoA+and+Rho+GEF+activity+in+whole+cells+and+the+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analysis of RhoA and Rho GEF activity in whole cells and the cell nucleus.</a> Nature Protocols. , (2011).</li>
<li>Guilluy, C., Swaminathan, V., Garcia-Mata, R., O'Brien, E. T., Superfine, R., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rho+GEFs+LARG+and+GEF-H1+regulate+the+mechanical+response+to+force+on+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Rho GEFs LARG and GEF-H1 regulate the mechanical response to force on integrins.</a> Nature Cell Biology. 13, 722-727 (2011).</li>
<li>Dubash, A. D., Wennerberg, K., Garcia-Mata, R., Menold, M. M., Arthur, W. T., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+Lsc%2Fp115+RhoGEF+and+LARG+in+regulating+RhoA+activity+downstream+of+adhesion+to+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A novel role for Lsc/p115 RhoGEF and LARG in regulating RhoA activity downstream of adhesion to fibronectin.</a> J. Cell Sci. 120, 3989-3998 (2007).</li>
<li>Arthur, W. T., Ellerbroek, S. M., Der, C. J., Burridge, K., Wennerberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XPLN%2C+a+guanine+nucleotide+exchange+factor+for+RhoA+and+RhoB%2C+but+not+RhoC%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">XPLN, a guanine nucleotide exchange factor for RhoA and RhoB, but not RhoC.</a> J. Biol. Chem. 277, 42964-42972 (2002).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De methode die hier gepresenteerd is de enige beschikbare niet-radioactieve activatie test voor GEFs dat de actieve pool van GEFs in cellen kan volgen. De test is vergelijkbaar met de precipitatie assays voor na activering van kleine GTPases en GEFs tegen Rac en Cdc42. Deze verschillende assays GST-gemerkte eiwitten en hebben geringe afwijkingen van de hier beschreven, maar de basisstappen zijn hetzelfde. Zo kan dit protocol gemakkelijk worden aangepast voor andere kleine GTPase en GEF activatie assays. De gepresenteerde GEF-test werd onlangs aangepast voor toepassing voor nucleaire fracties 9,10. Met andere wijzigingen kunnen testen van GEF activatie andere subcellulaire compartimenten ook mogelijk. We maken gebruik van de gepresenteerde methode om de activering van GEFs in epitheliale cellijnen 5,6,7 te bestuderen. Bij sommige optimalisatie, moet deze test voldoende zijn om GEFs detecteren vanaf een cellijn. Wanneer adapting op een bepaald celtype, de meest optimale aantal cellen lysisbuffer volume en de detectie werkwijze voor het GEF te testen (een goede antilichaam voor Western blotting is belangrijk). Voor de eerste configuratie van de test is het raadzaam het gebruik van een stimulus waarvan bekend is dat het GEF van belang te activeren. Bij gebruik van een onbekende stimulus, gebruik dan altijd een positieve controle te controleren of uw test werkt. Deze test kan worden geactiveerd bekende GEFs detecteren door Western blotting. Het is echter ook voldoende te identificeren onbekende GEFs. Daartoe moeten gevangen GEFs van controle en gestimuleerd monsters worden geanalyseerd op een Coomassie-gekleurde gel. Bands die alleen verschijnen in gestimuleerd monsters kunnen bevatten geactiveerd GEFs en kan worden gestuurd voor identificatie met behulp van massaspectrometrie (bijv. 5). Tot slot een kritische noot. De test is gebaseerd op de aanname dat de post-translationele modificaties waardoor GEFs actieve bewaard na cellyse. Inderdaad, dit is duidelijk de case een aantal GEFs, en omdat de inrichtingen is deze test gebruikt bij de diverse tot de activering van verschillende GEFs, zoals GEF-H1, p115RhoGEF en XPLN (bijvoorbeeld 5,11,12,13) ​​detecteren. Behoud van de actieve toestand echter kan niet gebeuren bij alle GEFs en daarom is het denkbaar dat deze test niet werken voor alle GEFs. Het heeft ook te worden opgemerkt, dat veel GEFs activiteit uit te oefenen naar meer dan een kleine GTPases. Dus, als een specifieke GEF wordt bestudeerd, is het aan te raden om deze test te vullen met GEF neerslag assays voor andere kleine GTPases, maar ook functionele studies onderzoeken RhoA, Rac1 en Cdc42. Kritische stappen in het protocol: Kolonies van getransformeerde bacteriën moeten worden opgehaald van verse, goed voorbereid platen om een ​​adequate selectie door Amp, een goede uitgroei en opbrengst te garanderen. Transformatie voorwaarden voor competente cellen verkregen uit andere bronnen kan variëren en moet worden geraadpleegd. </p&gt; Alle stappen van de eiwitpreparaat protocol (van stap 2.3) en de assay (van stap 3.2) worden uitgevoerd bij 4 ° C gekoeld met oplossingen centrifuges. Bacteriële lysis (stap 2.5) moet grondig en volledig om een ​​homogene suspensie te verkrijgen. Wanneer het lyseren van de bacteriën, vortex afwisselend pipetteren het lysaat met behoud het op 4 ° C en zorgen sonicatie gebeurt op ijs voorkomen denaturering van de proteïne. Als u een ander model van ultrasoonapparaat kunnen er voorwaarden moeten worden aangepast. Incubatie van ultrasone trillingen met de kralen moet altijd worden gedaan bij 4 ° C op een rotator om voldoende binding te waarborgen, en zorg moeten worden genomen om de timing consistent. GST-Rho mutanten zijn enigszins instabiel, uitgedrukt in bacteriën, dus het is het beste om voorbereid kralen te gebruiken direct of binnen een paar dagen. De neerslag assay (deel 3) is het tijd en temperatuur gevoelig is, eenactieve GEFs gemakkelijk verloren het cellysaat, moet dus stappen worden uitgevoerd zo snel mogelijk. De volgende sectie bevat enkele het oplossen van problemen tips. Geen of zeer kleine hoeveelheid mutant Rho eiwit in de uiteindelijke korrel preparaat: Dit kan worden veroorzaakt door inefficiënte inductie onvoldoende lysis van de bacteriën of een verlies van het eiwit tijdens het bereidingsproces of opslag. Om problemen enkele van deze mogelijkheden kunnen monsters bacteriën worden onderzocht voor en na inductie. Als er slechte inductie van het eiwit herhaal het proces met behulp van een kolonie van een vers strepen plaat of van re-getransformeerde competente cellen. Verschillende IPTG concentraties en inductie tijden moeten ook worden getest. Als de lysis onvoldoende is (dat wil zeggen het eiwit blijft in de pellet in plaats van de supernatant) wisselende zout en afwasmiddel concentraties in de lysis buffer kan worden geprobeerd. Alternatieve sonicatie tijden eninstellingen moeten worden onderzocht, en monsters voor en na sonicatie kan worden gecontroleerd door middel van microscopisch om de efficiëntie van lysis te bepalen. Nr. neergeslagen GEF, terwijl de GST-eiwit aanwezig op de korrels: Dit kan vanwege technische problemen tijdens de precipitatie assay of een echte afwezigheid van activering van de onderzochte GEF met toegepaste stimulus. Gebruik altijd een bekende stimulus als een positieve controle om te controleren of uw test werkt. Gebruik de voorbereide kralen binnen een paar dagen. Als de test neerslag vangt detecteerbare hoeveelheden van de GEF onderzocht onder alle omstandigheden, controleert de GEF aanwezig is en goed detecteerbaar in de supernatant na centrifugeren die worden gebruikt voor de assay (stap 3.3). Zorg ervoor dat alle buffers en proteaseremmers vers zijn, en het uitvoeren van alle stappen op ijs zo snel mogelijk. Verhoog de hoeveelheid van de input-eiwit (bijvoorbeeld door gebruik te maken lysaten van 2 platen / monster). Als het neerslaan assay geeft basale neerslaguitvoering van de GEF, maar geen verschil wordt gezien tussen de controle en gestimuleerd monsters (afb. 4), start het oplossen van problemen door te controleren of de toegepaste prikkel gewerkt met behulp van andere bekende effecten (bijvoorbeeld door het detecteren van activatie van andere signaalwegen). Denk aan het veranderen van de behandeling voorwaarden en / of concentraties. Vertrouw op gegevens uit de literatuur rapportage hoe uw prikkel Rho of andere signalen activeert om te voorspellen waarschijnlijk tijden en concentraties. Bij het optimaliseren van de behandeling de tijd, gebruik maken van zowel korte als lange tijd punten, zoals GEF activering kan het best waarneembaar zijn op een tijdstip voorafgaand aan goed waarneembaar Rho activering. Tenslotte kan dezelfde stimulus tot een variabele mate van geactiveerd door een verandering in cel reactiviteit door passage nummer cel confluentie, etc.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> pGEX-RhoA (G17a) </td><td> Addgene </td><td> Zal binnenkort beschikbaar zijn </td><td> Gegenereerd in het lab van Dr Keith Burridge (University of North Carolina) (ref 3) </td></tr><tr><td> DH5a </td><td> Invitrogen </td><td> 18258-012 </td><td> Store -80 ° C </td></tr><tr><td> SOC medium </td><td> BioShop </td><td> SOC001.10 </td><td></td></tr><tr><td> LB </td><td> BioShop </td><td> LBL407.1 </td><td> Houd steriel </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> BioShop </td><td> GLY002.1 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicilline </td><td> BioShop </td><td> AMP201.25 </td><td> Store voorraad bij -20 ° C </td></tr><tr><td> Agar-agar </td><td> BioShop </td><td> AGR001.500 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG (Isopropyl BD-thiogalacto-pyranoside) </td><td> Calbio-chem </td><td> 420322 </td><td> Store voorraad oplossing bij -20 ° C </td></tr><tr><td> Glutathion Sepharose kralen </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0756-01 </td><td></td></tr><tr><td> PBS 10x </td><td> SIGMA </td><td> D1408 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> SIGMA </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BioShop </td><td> SOD001.10 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> SIGMA </td><td> M-9272 </td><td> Voeg vlak voor gebruik </td></tr><tr><td> TX-100 </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> X100 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> OmniPur EMD </td><td> 3860 </td><td> Voeg vlak voor gebruik </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> SIGMA </td><td> P-7626 </td><td> Voeg vlak voor gebruik </td></tr><tr><td> Protease Inhibitor 50x </td><td> BD Baculo-Gold </td><td> 51 21426Z </td><td> Voeg vlak voor gebruik </td></tr><tr&gt; <td> Compleet Mini, EDTA-free 10x </td><td> Roche </td><td> 11 836 170 001 </td><td> Voeg vlak voor gebruik </td></tr><tr><td> Laemmli monsterbuffer 2x </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0737 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercapto </td><td> SIGMA </td><td> M7154 </td><td> Voeg vlak voor gebruik </td></tr><tr><td> Coomassie Brilliant Blue </td><td> Bio-Rad </td><td> R-250 </td><td></td></tr><tr><td> Azijnzuur </td><td> Caledon </td><td> 1000-1 </td><td></td></tr><tr><td> Methanol </td><td> Caledon </td><td> 6701-7 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Rad Protein Assay </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0114 </td><td></td></tr><tr><td> Blueye ladder </td><td> FroggaBio </td><td> PM008-0500 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 1. Reagentia gebruikt. <table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de apparatuur </td><td> Vennootschap </td&gt; <td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> RC-5B centrifuge </td><td> Sorvall </td><td> SS-34 rotor </td><td> Gebruik bij 4 ° C </td></tr><tr><td> Centrifugeer </td><td> Sorvall-Thermo Scientific </td><td> ST-16R </td><td> Gebruik bij 4 ° C </td></tr><tr><td> Micro centrifuge </td><td> Eppendorf </td><td> 5417R </td><td> Gebruik bij 4 ° C </td></tr><tr><td> Bacteriële shaker </td><td> INFORS HT Ecotron </td><td> AG CH-1403 Bottmingen </td><td> Gebruik bij 37 ° C of 22 ° C </td></tr><tr><td> Ultrasoonapparaat </td><td> Branson </td><td> Sonifier-450 </td><td> Gebruik bij RT </td></tr><tr><td> Rotator </td><td> Glas-Col </td><td> 099A CR4012 </td><td> Gebruik bij 4 ° C </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Gebruikte specifieke apparatuur.

affiniteit neerslag van active rho-gefs met behulp van een gst-gelabeld mutant rho protein (gst-rhoa (g17a)) van epitheelcellen lysaten

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein (GST-RhoA(G17A)) from Epithelial Cell Lysates

Eiwitten van de Rho familie van kleine GTPases staan ​​centraal regulatoren van het cytoskelet, en controle een grote verscheidenheid van cellulaire processen, waaronder cel-migratie, genexpressie, voortgang van de celcyclus en celadhesie 1. Rho eiwitten zijn moleculaire schakelaars die actief zijn in GTP-gebonden en inactief in het BBP-gebonden toestand. Hun activatie wordt gemedieerd door een familie van guanine-nucleotide Exchange Factor (GEF) eiwitten. Rho-GEFs vormen een grote familie, met overlappende specifieke kenmerken 2. Hoewel er veel vooruitgang is geboekt bij het identificeren van de GEFs geactiveerd door specifieke signalen, zijn er nog veel vragen bestaan ​​rond de route-specifieke regulatie van deze eiwitten. Het aantal van Rho-GEFs hoger is dan 70, en elke cel drukt meer dan een GEF eiwit. Bovendien zijn veel van deze eiwitten te activeren niet alleen Rho, maar andere leden van de familie, bij te dragen naar aanleiding van de complexiteit van de regelgeving netwerken. Belangrijk is dat het verkennen vanhoe GEFs worden geregeld is een methode om de actieve pool van individuele GEFs volgen cellen geactiveerd door verschillende stimuli. Hier zorgen wij voor een stap-voor-stap protocol voor een methode die wordt gebruikt om te beoordelen en kwantificeren van de beschikbare actieve Rho-specifieke GEFs met behulp van een affiniteit neerslag test. Deze test werd een paar jaar geleden ontwikkeld in de Burridge lab 3,4 en we hebben gebruikt in de nier tubulaire cellijnen 5,6,7. De assay maakt gebruik van een &quot;nucleotide vrij&quot; mutant RhoA met een hoge affiniteit voor actieve GEFs. De mutatie (G17a) maakt het eiwit niet in staat om te binden het BBP of GTP en deze staat bootst de tussenliggende staat die is gebonden aan het GEF. Een GST-gelabeld versie van deze mutant eiwit tot expressie en gezuiverd uit E. coli, gebonden aan glutathion sefarosekorrels en gebruikt voor het neerslaan actieve GEFs van lysaten van onbehandelde en gestimuleerde cellen. Aangezien de meeste GEFs worden geactiveerd via posttranslationele modificaties of ontheffing van remmende banden, hun actieve toestandbewaard in cellysaten en kunnen worden gedetecteerd door deze test 8. Gevangen eiwitten kunnen worden gezocht heeft naar bekende GEFs door detectie met specifieke antilichamen met behulp van Western blotting, of geanalyseerd met behulp van massaspectrometrie voor onbekende GEFs geactiveerd door bepaalde stimuli te identificeren.

De hier gepresenteerde methode beschrijft een assay voor activering van RhoA specifieke GDP / GTP uitruilfactoren (GEFs) in gekweekte cellen volgen door gebruik te maken van een gemuteerde RhoA GST fusieproteïne dat een hoge affiniteit voor geactiveerd GEFs heeft. GEFs worden neergeslagen uit cellysaten, gedetecteerd door Western blotting en gekwantificeerd door densitometrie.

Affiniteit Neerslag van Active Rho-GEFs Met behulp van een GST-gelabeld Mutant Rho Protein (GST-RhoA (G17a)) van epitheelcellen Lysaten

Eiwitten van de Rho-familie van kleine GTPases zijn centrale regulatoren van het cytoskelet en controleren een grote verscheidenheid aan cellulaire processen, waaronder cel...

Het algemene doel van deze procedure is om de activatie van RO door specifieke G-D-P-G-T-P-uitwisselingsfactoren of gafs in gekweekte cellen te volgen, door gebruik te maken van een mutant RO A GST-fusie-eiwit met een hoge affiniteit voor geactiveerde gs. Dit wordt bereikt door eerst het GST-getagde mutante row-eiwit in bacteriën te produceren. Vervolgens wordt de bead-gekoppelde GST row A gezuiverd.Vervolgens worden de zuiverheid en concentratie van het GST RO A-eiwit beoordeeld met behulp van SDS-PAGE. Ten slotte worden cellysaten voorbereid en wordt een GEF-precipitatie-assay uitgevoerd met het GST RO A-eiwit. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een verhoogde precipitatie van geactiveerd GS in behandelde cellen laten zien via western blot-analyse van de geprecipiteerde eiwitten met een specifiek anti-GF-antilichaam en kwantificering via densitometrie.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van een aantal boeiende vragen in het veld van de ruwe GTPS, zoals hoe de vele row G-D-P-G-T-P-uitwisselingsfactoren op een signaalspecifieke manier worden gereguleerd en hoe hun activiteit wordt gecoördineerd. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode in het begin moeite hebben, omdat het GST RO G 17 A-eiwit relatief instabiel is en kan afbreken tijdens de preparatie. Het is daarnaast belangrijk om te onthouden dat de GF-precipitatieanalyse snel en consistent moet worden uitgevoerd. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Pfizer Vahid, een masterstudent uit mijn lab, om e coli te transformeren.Voeg snel 1 µL van 25 tot 50 ng/µL PX row A G 17 A DNA toe aan een aliquot DH5α competente cellen in een ijsbad. Tik tegen de buis om te mengen en incubeer 30 minuten op ijs. Heatshock de cellen bij 42 °C gedurende 45 seconden en plaats ze vervolgens gedurende twee minuten terug op ijs.Voeg 900 µL SOC-medium toe en kweek gedurende één uur bij 37 °C onder schudding. Verspreid met een gebogen steriele plastic pipet 50 tot 100 µL van de getransformeerde bacteriën op een vooraf bereide LB-agar- en persinplaat. Incubeer de plaat met de bodem naar beneden in een incubator bij 37 °C gedurende vijf minuten, keer de plaat vervolgens om en kweek deze overnacht.Selecteer een goed geïsoleerde kolonie van getransformeerde bacteriën en gebruik deze om 50 milliliters LB met ampicilline te inoculeren. Laat dit gedurende de nacht groeien bij 37 degrees SIUs onder agitatie. Wanneer de cultuur de volledige dichtheid heeft bereikt, wordt deze verdund met 450 milliliters LB ampicilline en nog 30 minuten verder gekweekt. Induceer de bacteriën bij 37 degrees Celsius om row proteïne te produceren door 500 microliters van 100 millimolar IPTG toe te voegen aan een 500 milliliter cultuur.Verlaag de temperatuur naar 22 tot 24 °C en laat deze ongeveer 16 uur groeien. Centrifugeer de cultuur bij 3.600 ×g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Vries de pellets gedurende ten minste één uur of bij voorkeur overnacht in bij -80 °C.Nadat 200 milliliters lysisbuffer is voorbereid zoals beschreven in het schriftelijke protocol, wordt lysisbuffer plus gemaakt door 10 milliliters aan te vullen met één millimolar DTT, één millimolar PMSF en één protease-inhibittablet, waarbij op ijs wordt gewerkt. Voeg 10 milliliters lysisbuffer plus toe aan de Thor-pellets en resuspendeer grondig door te pipetteren en te vortexen. Sonicate de suspensie op ijs gedurende één minuut op stand vier met een 50%pulse.Centrifugeer het gesoniceerde lysaat 15.000 tot 20.000 ×g gedurende 15 minuten bij 4 °C en breng het geklaarde sonicaat over naar een steriele, afgesloten buis van 15 ml. Bereid de glutathione sphero beads voor door de 75% slurry voorzichtig te mengen en met een wide-bore tip 335 µL over te brengen naar een buis van 15 ml. Voeg 10 ml koud PBS toe en centrifugeer dit 500 ×g gedurende vijf minuten bij 4 °C.Verwijder het supernatant. Voeg één milliliter lysisbuffer plus toe aan de kralen en centrifugeer opnieuw. Verwijder het supernatant opnieuw en voeg lysisbuffer toe.Maak daarna een 50% slurry door twee delen van 50 µL geëquilibreerde bead slurry te combineren met het voorbereide supernatant. Draai dit 45 minuten bij 4 °C. Bereid HBS plus door 100 mL HBS-buffer aan te vullen met 5 mM magnesiumchloride en 1 mM DTT. Centrifugeer het supernatant en de beads 5 minuten bij 500 ×g bij 4 °C.Verwijder het supernatant en was de beads tweemaal met 10 milliliters lysis buffer plus en tweemaal met 10 milliliters HBS plus. Maak na de laatste wasbeurt een suspensie van 50% door de beads opnieuw op te lossen in HBS plus aangevuld met protease-inhibitor. Verdun 10 microliters van de uiteindelijke bead-preparatie met twee keer lam ly sample buffer bevattend beamr cap twee ethanol.Maak vervolgens drie BSA-standaardmonsters door 10 µL, 5 µL en 2,5 µL van een BSA-voorraadoplossing van 2 mg/mL te mengen met 10 µL Laemmli-buffer.Kook de monsters gedurende vijf minuten, centrifugeer ze vervolgens kort en scheid ze samen met een molecuulgewichtmarker op een 10% SDS-polyacrylamidegel; schat na kleuring en ontkleuring van de gel de GST-rij A G 17 A in met behulp van de BSA-standaarden als referentie. Verdeel een gelijk volume kralen met ongeveer 10 tot 15 microgram eiwit over 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes. Ter voorbereiding op de GF-pull-downassay worden de te gebruiken cellen tot confluentie gekweekt in 10 centimeter schalen en ten minste drie uur vóór de assay serumvrij gehouden.Vlak voor de start van de assay. Bereid lysisbuffer plus met protease-remmers voor op ijs. Verwijder het kweekmedium uit de schalen en was met ijskoud HBS.Verwijder alle HBS en voeg 700 µL lysisbuffer plus toe aan elk schaaltje. Schud de platen om alle gebieden te bedekken.Schraap vervolgens de lysaten weg en verzamel deze in genummerde buisjes van 1,5 milliliter. Centrifugeer 1 minuut bij 15,000 ×g bij vier graden Celsius. Bewaar het supernatant voor de assay; indien het aantal cellen in elke plaat gelijk was, neem dan 30 µL van elk supernatant en meng dit met 30 µL van een tweevoudige reducerende lysis-monsterbuffer.Kook het mengsel vervolgens en zet het op ijs. Voeg de overige supernatanten toe aan aliquots van de GST row a G 17 A-beads en roteer gedurende 45 minuten bij 4 °C. Centrifugeer de beads bij 6.800 ×g gedurende 10 seconden bij 4 °C.Verwijder het supernatant en was de beads drie keer met lysisbuffer. Gebruik een spuit van 1 cc voorzien van een naald van 30 gauge om de laatste wasbeurt volledig te verwijderen en voeg 20 µL van tweemaal reducerende laly-monsterbuffer toe. Kook de monsters gedurende vijf minuten, centrifugeer om de beads te pelletteren en analyseer de totale cellysaten en geprecipiteerde eiwitmonsters op een SDS-PAGE-gel met het juiste percentage voor de grootte van de bestudeerde GF.Voer ten slotte een western blot uit om de relevante GFA succesvolle GF-assay te detecteren. De detectie van de activatie van de uitwisselingsfactor GFH one wordt hier getoond. De rij A G 17 A proteïne vangt enige GFH one op uit de controlcell-lysaten, wat suggereert dat GFH one een basale activiteit heeft.De hoeveelheid neerslag nam echter toe in cellen die behandeld waren met het inflammatoire cytokine tumornecrosefactor alfa, wat consistent is met de opvatting dat TNF alfa G FH one activeert. Belangrijk is dat het totale cellysaat vergelijkbare hoeveelheden gfh one laat zien in de controle- en de behandelde monsters, wat suggereert dat de behandeling de G FH one-niveaus niet heeft veranderd en dat de input die in de assay is gebruikt gelijk was. Bij het aanpassen van deze procedure is het belangrijk om het GSE RO G 17 A-eiwit en de CELLIS eights op ijs te bewaren.Voer de GF-assay snel en consistent uit, en gebruik adequate positieve controles die invalidatie en probleemoplossing mogelijk maken.

affinity-precipitation-active-rho-gefs-using-gst-tagged-mutant-rho

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol maakt gebruik van een pull-down test om het niveau van de actieve RhoC GTPase vast te stellen in de cellen.

RhoC GTPase Activering Assay

Clathrine-gemedieerde endocytose afhankelijk van de adapter eiwitten die lading selectie en clathrine vacht montage coördineren. Hier beschrijven we de procedures voor adapter-clathrine fysieke interactie en live cell imaging methoden gebruikt als een model de gist endocytische adapter eiwit Sla1p bestuderen.

In vivo en in vitro studies van Adapter-clathrine Interactie

This video demonstrates a competition assay to study GTPase-binding protein partners. Utilizing nucleotide-bound GTPase protein immobilized on magnetic beads, the competitive binding between two interacting protein partners for the same binding site on the GTPase can be studied to assess the binding affinities of the protein partners.

Competition Binding Assay to Study Competing GTPase-Binding Protein Partners

We genetisch coderen natuurlijk aminozuur, p-azido-L-fenylalanine op verschillende gerichte posities in GPCRs en tonen de veelzijdigheid van de azidogroep in verschillende toepassingen. Deze omvatten een gerichte fotoverknoping technologie om resten in de ligand-bindingsplaats van een GPCR te identificeren, en de site-specifieke bioorthogonal modificatie van GPCR's met een peptide-epitoopmerker of fluorescente probe.

Genetisch gecodeerde Molecular Probes aan G-eiwit gekoppelde receptoren Studie

Dit protocol vergelijkt de relatieve affiniteiten van bindingspartners voor Rho-familie GTPases, inclusief Rac1. In vivo, concurreren Rac1-bindende eiwitten voor een enkele bindingsinterface, waarvan de conformatie wordt bepaald door een gebonden nucleotide. Het nucleotide is zowel belangrijk als moeilijk experimenteel te beheersen, vanwege de hoge hydrolysesnelheid.

Het vergelijken van de affiniteit van GTPase-bindende eiwitten met behulp competitiebepalingen

G4 Resolvase1 bindt aan G-quadruplex (G4) met de kleinste structuren gerapporteerde affiniteit voor een G4-bindend eiwit en vertegenwoordigt het merendeel van de G4-DNA afwikkelen activiteit in HeLa-cellen. We beschrijven een nieuw protocol dat de affiniteit en ATP-afhankelijke afwikkelen activiteit van de G4-Resolvase1 gordels om specifiek te zuiveren katalytisch actieve recombinant G4R1.

Een G-quadruplex DNA-affiniteit Aanpak voor zuivering van enzymatisch actieve G4 Resolvase1

In het manuscript beschrijven we het gebruik van een kwantitatieve analyse van gist gebaseerde fluorescentie, verslaggever te identificeren van cellulaire componenten betrokken bij de handel en het doden van processen van de cytotoxische een subeenheid van de plant toxine ricine (RTA).

Een eenvoudige fluorescentie gebaseerde verslaggever Assay identificatie van cellulaire bestanddelen die nodig zijn voor ricine toxine een keten (RTA) handel in gist

De huidige studie beschrijft een eenvoudige methode voor het opsporen van endogene niveaus van Rab10 fosforylering door leucine-rijke herhalen kinase 2.

Rab10 fosforylering detectie door LRRK2 activiteit met behulp van SDS-pagina met een fosfaat-bindende-Tag

Hier beschrijven we een protocol voor het onderzoek naar de prenylation en 5'-Guanosinetrifosfaat (GTP)-laden van Rho GTPase. Dit protocol bestaat uit twee gedetailleerde methoden, namelijk membraan fractionering en een GTPase-linked immunosorbent assay. Het protocol kan worden gebruikt voor het meten van de prenylation en de GTP laden van verschillende andere kleine GTPases.

Detectie van kleine GTPase Prenylation en GTP bindend gebruiken membraan fractionering en GTPase-linked Immunosorbent Assay

Deze studie beschrijft experimentele methoden om GFAP en de ziekteverwekkende mutaties biochemisch te karakteriseren, met de nadruk op filamentassemblage, aggregatie en posttranslationele modificatie. Hoogzuivere GFAP-eiwitten werden geanalyseerd, wat inzicht gaf in de mechanismen van de ziekte van Alexander die een kader kunnen bieden voor het bestuderen van potentiële therapeutische doelwitten en het begrijpen van GFAP-mutaties en gerelateerde aandoeningen.

Experimentele benaderingen voor biochemische analyse van gliale fibrillaire zure eiwitten en de ziekte-geassocieerde varianten

Leer een affiniteit neerslagmethode voor actieve Rho-GEFs met behulp van GST-RhoA(G17A) uit epitheelcellenlysaten. Deze techniek maakt kwantitatieve detectie van GEF-activatie mogelijk via Western blot en densitometrie.

Affiniteit Neerslag van Active Rho-GEFs Met behulp van een GST-gelabeld Mutant Rho Protein (GST-RhoA (G17a)) van epitheelcellen Lysaten (Video) | JoVE Journal

Affiniteit Neerslag van Active Rho-GEFs Met behulp van een GST-gelabeld Mutant Rho Protein (GST-RhoA (G17a)) van epitheelcellen Lysaten

Meer video's verkennen